Summary
Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.
Abstract
La motilidad del enjambre bacteriano es un fenotipo microbiológico común que las comunidades bacterianas utilizan para migrar sobre superficies semisólidas. En las investigaciones de la motilidad del enjambre inducido, la concentración específica de un inductor puede no ser capaz de informar eventos que ocurren dentro del rango de concentración óptimo para provocar las respuestas deseadas de una especie. Las placas semisólidas que contienen múltiples concentraciones se usan comúnmente para investigar la respuesta dentro de un rango de concentración del inductor. Sin embargo, las placas semisólidas separadas aumentan las variaciones en la viscosidad media y el contenido de humedad dentro de cada placa debido al tiempo de solidificación no uniforme.
Este artículo describe un método de un solo paso para probar simultáneamente la motilidad del enjambre de superficie en una sola placa de gradiente, donde los pozos de prueba dispuestos isométricamente permiten la adquisición simultánea de respuestas de multiconcentración. En el presente trabajo, se evaluó el enjambre superficial de Escherichia coli K12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1 en respuesta a un gradiente de concentración de inductores como el resveratrol y la arabinosa. Periódicamente, las morfologías del enjambre se fotografiaban utilizando un sistema de imágenes para capturar todo el proceso de enjambre de superficie.
La medición cuantitativa de las morfologías del enjambre se adquirió utilizando el software ImageJ, proporcionando información analizable del área del enjambre. Este artículo presenta un método simple de placa de enjambre de gradiente que proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre los efectos de los inductores en el enjambre de superficie, que puede ampliarse para estudiar los efectos de otros inductores en una gama más amplia de especies bacterianas móviles.
Introduction
La motilidad del enjambre bacteriano se refiere a la migración colectiva de células bacterianas a través de la superficie de una sustancia. Además de las placas de agar semisólido especialmente preparadas en el laboratorio1, este fenotipo también se observa en algunos sustratos blandos como tejidos animales2, superficies hidratadas3 y raíces de plantas4. Si bien una superficie semisólida se considera una de las condiciones fundamentales para el enjambre bacteriano, algunas especies también requieren un medio rico en energía para soportar su motilidad de enjambre5. La rotación de flagelos potencia tanto para nadar como para enjambre: la natación describe la motilidad unicelular dentro de un ambiente líquido, mientras que el enjambre es el movimiento sincrónico de una población microbiana a través de superficies semisólidas.
La viscosidad del sustrato influye en la motilidad bacteriana; los estudios de microbios patógenos, como Helicobacter pylori, han demostrado que la motilidad del patógeno cambia en función de la viscosidad de la capa de mucina, que está influenciada por la acidificación ambiental en el huésped humano6. Para replicar estos entornos, estudios anteriores que utilizaron una concentración de agar superior al 0,3% (p/v) restringen la motilidad bacteriana de la natación para efectuar un cambio gradual hacia el enjambre superficial. El uso de concentraciones de agar por encima del 1% (p/v) previene la motilidad del enjambre de muchas especies7. Los patrones de colonia formados en la superficie son diversos, incluyendo mat8 sin rasgos, ojo de buey9, dendritas10 y vórtice11.
Aunque la relevancia de tales patrones sigue sin estar clara, esos patrones parecen depender de señales ambientales y químicas12. Las señales ambientales cubren diferentes aspectos, incluida la temperatura, la salinidad, la luz y el pH, mientras que las señales químicas incluyen la presencia de moléculas de detección de quórum microbiano, subproductos bioquímicos y nutrientes. Las moléculas de señalización de detección de quórum autoinductoras como AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) pueden afectar el enjambre superficial al regular la producción de surfactante13,14. El resveratrol, un compuesto fitoalexina, podría restringir la motilidad del enjambre bacteriano15.
En el presente trabajo, investigamos el efecto de las concentraciones de gradiente de resveratrol en la cepa K12 de Escherichia coli de tipo silvestre e investigamos la motilidad de enjambre inducible por arabinosa de las especies de E. coli K12-YdeH y Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La producción de la enzima YdeH es inducida por la arabinosa a través del promotor araBAD, resultando en perturbación celular c-di-GMP y afectando la motilidad del enjambre bacteriano16,17. Este comportamiento de enjambre inducible se estudia utilizando placas de enjambre de gradiente de arabinosa con cepas de E. coli K12-YdeH y P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Las placas de enjambre de gradiente se preparan solidificando sucesivamente el medio de doble capa (Figura 1B). La capa inferior comprende el medio agregado con el inductor, vertido en un lado de una placa de Petri apoyada. Tras la solidificación de la capa inferior, la placa de Petri se devuelve a una superficie plana, donde la capa superior que contiene el medio sin el inductor se agrega desde el otro lado de la placa. Después de que las placas de enjambre están completamente solidificadas, los pozos de retención dispuestos isométricamente se producen perforando agujeros en las placas de enjambre siguiendo un diseño fijo (Figura 1C) o imprimiendo los pozos utilizando un modelo impreso en 3D de la cubierta de la placa que contiene clavijas durante el proceso de curado del medio (Figura suplementaria S1). Se utiliza un sistema de imágenes en gel para capturar las morfologías del enjambre en diferentes puntos temporales (Figura 2). El análisis del enjambre de superficies utilizando el software ImageJ (Figura suplementaria S2) proporciona resultados cuantitativos del proceso de enjambre de superficies (Figura 3).
Por lo tanto, proponemos un método simple para probar la motilidad del enjambre de superficie dentro de un rango de concentración de inductores. Este método se puede utilizar para probar múltiples respuestas de concentración de otros inductores mezclando el inductor en el medio de la capa inferior y se puede aplicar a otras especies móviles (por ejemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Este enfoque podría proporcionar resultados cualitativos y cuantitativos confiables para la detección de un solo inductor químico, y se pueden emplear placas separadas para evaluar más inductores químicos.
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Protocol
1. Preparación de placas de enjambre de gradiente
- Preparación del medio de enjambre
NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener una breve comparación de las diferentes viscosidades medias; En este protocolo se utilizó una concentración de agar del medio de enjambre al 0,7% (p/v).- Preparar caldo de lisogenia (LB) en polvo con agar en dos matraces cónicos; cada matraz contiene 2 g de triptona, 2 g de cloruro de sodio, 1 g de extracto de levadura y 1,4 g de agar. Agregue agua de doble destilación (ddH2O) y revuelva la suspensión con una barra de agitación magnética. Ajuste el volumen final a 200 ml agregando ddH2O adicional.
- Autoclave la solución a 121 °C durante 20 min. Use una tapa permeable al aire o una película de sellado de botellas con una salida de aire.
NOTA: El agar se disolverá cuando se caliente en el autoclave. - Cuando la temperatura baje a 65 °C, mezcle la solución para garantizar la homogeneidad y transfiera el medio a una incubadora o baño de agua a 65 °C para un uso a corto plazo.
- Preparación del medio de enjambre de capa inferior
NOTA: El medio de capa inferior es la mezcla de medio de enjambre y soluciones madre inductoras. La formulación de las placas de enjambre de gradiente inductor se muestra en la Tabla 1.- Prepare una solución madre de resveratrol de 100 mM disolviendo 114,12 mg de polvo de resveratrol liofilizado en 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacene la solución a -20 °C.
- Preparar una solución madre de arabinosa al 20% (p/v) disolviendo 6 g de polvo de arabinosa en 30 ml de ddH2O; espere 10-15 minutos para permitir que la arabinosa se disuelva; y almacene la solución a temperatura ambiente.
- Saque el medio de la incubadora de 65 °C y colóquelo a temperatura ambiente; deje que el medio de enjambre se enfríe hasta que el matraz Erlenmeyer esté lo suficientemente frío como para sostenerlo (~ 50 ° C). No coloque el medio de enjambre a temperatura ambiente durante largos períodos, ya que esto causará la solidificación del agar.
- Añadir el volumen requerido de la solución madre inductora al medio de enjambre a 50 °C (Tabla 1). Use una pipeta para dispensar la solución inductora en lugar de verterla. Agite suavemente para mezclar el inductor con el medio de enjambre.
NOTA: Este paso es para inductores que no se pueden esterilizar en autoclave. Tenga cuidado de no introducir burbujas en el medio.
- Preparación de placas de enjambre de gradiente de doble capa
NOTA: El medio de capa superior es un medio LB que contiene 0.7% (p/v) de agar.- Etiquete las placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm con el nombre del inductor y las cepas, y apoye los platos sobre el borde de las tapas (Figura 1B).
- Agregue un medio de capa inferior caliente de 40 ml (50 °C) utilizando una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml.
NOTA: Alternativamente, para placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm, es adecuado un medio de capa inferior y capa superior de 40 ml; para placas de Petri cuadradas de 10 x 10 cm, la capa inferior de 25 ml y el medio de capa superior son adecuados. - Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante 1 h dentro de una campana de flujo laminar. No moleste las placas de Petri cuadradas mientras el medio se solidifica.
NOTA: Durante el curado de la capa inferior, el medio de enjambre que no contenga inductores debe mantenerse en una incubadora o baño de agua a 65 °C. - Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri cuadradas dentro de una campana de flujo laminar.
- Añadir 40 ml de medio de capa superior caliente (50 °C) utilizando una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml.
NOTA: El medio de capa superior no contiene inductores. - Cure las placas de doble capa en la mesa de trabajo cubierta y sin molestias durante 1 h. Conservar las placas preparadas a 4 °C durante un máximo de 24 h.
NOTA: Los tiempos de curado más largos reducirían el contenido de humedad y restringirían la motilidad del enjambre.
2. Crecimiento de E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1
- Prepare 500 ml de medio LB agregando 5 g de triptona, 5 g de NaCl y 2.5 g de extracto de levadura en ddH2O, y complete la solución a 500 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C y guárdela a 4 °C.
- Prepare 100 ml de medio lb-agar al 1,5% (p/v) agregando 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extracto de levadura y 1,5 g de agar en ddH2O y rellene la solución a 100 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C. Transfiera el medio a un baño de agua a 50 °C para evitar que el agar se solidifique.
- Cuando el matraz medio LB-agar sea cómodo de sostener, agregue 20 ml de medio LB-agar en una placa de Petri (10 cm de diámetro) con una pipeta de 25 ml. Deje el plato a temperatura ambiente durante la noche y guarde el plato de agar LB a 4 °C.
- Tome cultivos de inventario almacenados a -80 °C, cepas de E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PAO1-YdeH en placas de Petri de agar LB utilizando bucles de inoculación desechables. Incubar las placas de Petri invertidas durante la noche a 37 °C.
- Elija colonias individuales para diferentes cepas de las placas de Petri, inocule cada colonia en 5 ml de medio LB e incube el cultivo a 37 ° C en un agitador orbital de laboratorio a 220 rpm.
- Cuando la densidad de cultivo alcance OD600nm ~ 1.0, retire el cultivo del agitador y colóquelo a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de cultivo a OD600nm = 1.0, como se describe en el paso 3.2.1.
3. Inoculación e incubación de placas de enjambre de gradiente
- Preparación de pocillos de inoculación
NOTA: Se pueden utilizar modelos de cubiertas de impresión 3D capaces de generar pozos separados por una distancia estándar en lugar del método que se describe a continuación (Figura suplementaria S1).- Marque las posiciones de los pozos en el papel A4 que se muestra en la Figura 1C. Establezca tres concentraciones de prueba en una placa de Petri cuadrada con dos o tres réplicas.
- Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa de gradiente solidificada. Empuje el lado más ancho de la punta de una pipeta de 100 μL en la superficie media semisólida en la posición marcada. Presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.
- Cuando la punta toque la parte inferior, no aplique fuerza vertical a la punta; Gire suavemente la punta para aislar el contenido del pozo cilíndrico.
- Mueva horizontalmente las puntas de la pipeta a lo largo de una distancia muy pequeña para permitir el flujo de aire en el lugar estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta mientras sostiene la pipeta con el pulgar y el dedo medio.
- Tire de la punta hacia afuera verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras lo extrae.
NOTA: Si el contenido del pozo se desliza, aplique un poco más de presión con el dedo índice para sellar completamente la punta. - Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.5 en cada posición marcada. Cubra la placa de enjambre antes de la inoculación.
- Inoculación e incubación de placas de gradiente
- Ajuste la densidad de cultivo de crecimiento durante la noche a OD600nm = 1.0.
- Pipetear 80 μL de la cultura de crecimiento durante la noche en cada pozo. No derrame el cultivo bacteriano fuera de los pozos.
- Envuelva las placas con una película de sellado. Para la observación a largo plazo (3-5 días), envuelva las placas con cinta de goma de laboratorio estéril.
NOTA: Es menos probable que la cinta de goma se rompa. - Coloque un vaso de precipitados lleno de ddH2O en la incubadora para mantener la humedad dentro de la incubadora. Incubar las placas de enjambre de gradiente a 37 °C.
NOTA: No incube las placas de enjambre al revés; esto hará que el cultivo bacteriano se escape de los pozos. - Imagine la placa de enjambre inmediatamente después de la inoculación, registrando esto como el punto de tiempo de 0 h .
4. Imágenes del enjambre de la superficie bacteriana
- Saque las placas de enjambre, una a la vez, de la incubadora cada 12 h, sosteniendo la placa horizontalmente, y colóquelas en el sistema de imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: No deje huellas dactilares en la superficie de las placas; sostenga el costado de la placa de enjambre con guantes limpios. - Seleccione el modo de imagen de gel ; exponer la placa de enjambre a la luz blanca; y ajustar la distancia focal para dar la vista más clara de los enjambres.
NOTA: Utilice la misma distancia focal para todas las placas de un lote determinado. - Mejore el brillo de los enjambres para una observación clara ajustando el tiempo de exposición a 300 ms. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo.
NOTA: El umbral se ajusta en la interfaz operativa del sistema de imágenes en gel. Aumente los valores a la izquierda para minimizar la interferencia de la luz de fondo; disminuir los valores a la derecha para mejorar el brillo de los enjambres. En este protocolo, la región suele estar entre 6.000 y 50.000. - Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del gradiente y las deformaciones en un archivo .txt .
5. Cuantifique el área del enjambre utilizando el software ImageJ
- Importe el archivo de imagen adquirido mediante el sistema de imágenes en gel.
- Establezca la barra de escala utilizando el software ImageJ y aplíquela a todas las imágenes.
- Cree un segmento de línea que marque la longitud del tablero haciendo clic en la herramienta de línea.
- Haga clic en Analizar | Establezca Escala para abrir la ventana Establecer escala .
- Escriba la longitud real en Distancia conocida y Unidad de longitud.
NOTA: Debido a que se utilizaron placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm en este trabajo, la longitud real es '130', y la unidad de longitud es 'mm'. - Marque la casilla Global .
- Insertar una barra de escala haciendo clic en Analizar | Herramientas | Barra de escala, escriba Ancho en mm, Alto en píxeles, Tamaño de fuente y seleccione Color, Fondo y Ubicación en el menú desplegable. Alternativamente, elija Texto en negrita, Ocultar texto, Fuente Serif y Superposición marcando las casillas de verificación.
NOTA: La elección de esos parámetros está determinada por los usuarios y las propiedades de las imágenes. En este protocolo, el ancho en mm se estableció en 25, el alto en píxeles en 20, el tamaño de fuente en 80 y la barra de escala se colocó en la esquina inferior derecha seleccionando Ubicación | Abajo a la derecha. Otros parámetros pueden ser elegidos por el usuario.
- Haga clic en Procesar | Sombras para mejorar la nitidez de la imagen, especialmente los límites (Figura suplementaria S2A). Haga clic en Procesar | Lote para procesar imágenes.
NOTA: El propósito de este paso es proporcionar una demarcación de límites más precisa.- Procese una imagen como referencia haciendo clic en Procesar | Sombras | Sur.
- Haga clic en Procesar | | por lotes Macro para abrir la ventana Proceso por lotes . Busque los siguientes comandos que se muestran en la ventana:
run("Sur");
run("Guardar");
cerrar(); - Escriba la dirección de carpeta de las imágenes originales y la dirección del archivo de salida haciendo clic en Procesar en la ventana Proceso por lotes .
NOTA: Se recomienda exportar imágenes con sombras a otra carpeta y conservar una copia de las imágenes originales.
- Utilice la herramienta Varita (trazado) para seleccionar enjambres individualmente y ajustar la tolerancia ( herramienta Varita (trazado)) hasta que la línea generada se ajuste correctamente al límite de enjambre (Figura suplementaria S2B).
NOTA: Primero, haga clic en la herramienta Varita (rastreo) y seleccione un enjambre en una imagen. Si los límites no se han representado correctamente, haga doble clic en la herramienta Varita (trazado) para abrir las ventanas herramienta Varita , donde se puede ajustar la Tolerancia . - Haga clic en Analizar | Medida para exportar el valor del área.
- Repita los pasos 5.1.1-5.1.5 hasta que se midan todos los enjambres, guarde los resultados en un archivo .csv para su posterior análisis.
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Representative Results
El flujo de trabajo que consiste en la preparación de placas de enjambre de gradiente, inoculación e incubación se muestra en la Figura 1B. Para generar placas de natación de gradiente, el medio de la capa inferior se vierte en platos apuntalados a ~ 4.3 ° desde el plano horizontal (Figura suplementaria S3), seguido de verter el medio de la capa superior después de que la capa inferior esté completamente solidificada. La composición del medio de doble capa se muestra en la Tabla 1. Luego, el cultivo bacteriano cultivado durante la noche se pipetea en los pozos de prueba y se incuba a 37 ° C, manteniendo los niveles adecuados de humedad. Se establecen múltiples concentraciones de prueba en una placa de enjambre de gradiente con dos o tres réplicas (Figura 1C). La opción alternativa de un modelo de impresión 3D de la tapa de la cubierta con la protuberancia columnar en los puntos de prueba se muestra en la Figura suplementaria S1.
Dos especies diseñadas, E. coli K12-YdeH y P. aeruginosa PAO1-YdeH, se probaron en placas de gradiente de arabinosa. La Figura 2A muestra la prueba del proceso de enjambre de superficie en cinco pozos, con superposición entre pozos adyacentes. Se establecieron tres pozos de prueba en una placa, como se muestra en la Figura 2B, C, lo que permitió la formación de límites no superpuestos. La motilidad del enjambre bacteriano se promovió con un aumento en la concentración de arabinosa desde la concentración más baja, pero se restringió gradualmente con concentraciones más altas de arabinosa. E. coli La cepa de tipo salvaje K12 se probó en placas de gradiente de resveratrol (Figura 2C), dentro del rango de concentración de 0-400 μM. Se observó una restricción modesta de la motilidad del enjambre con el aumento de la concentración de resveratrol. Las áreas de enjambre fueron cuantificadas por el software ImageJ (Figura Suplementaria S2). Las curvas de enjambre muestran las respuestas de concentración múltiple (Figura 3).
Figura 1: Esquema de preparación, inoculación e incubación de placas de enjambre de gradiente inductor. (A) Crecimiento nocturno de cultivo bacteriano a 37 °C. (B) Flujo de trabajo de placa de enjambre de gradiente inductor de doble capa. i) Apuntalar placas de Petri cuadradas. ii) Vierta el medio de la capa inferior y solidifique a temperatura ambiente. iii) Coloque las placas de Petri cuadradas planas y vierta el medio de la capa superior. iv) Curado de placas. v) Realizar pozos correspondientes a las posiciones marcadas. vi) Pipetear el cultivo bacteriano en pozos. vii) Envolver las placas con película de sellado o cinta de goma. viii) Coloque las placas de enjambre en una incubadora de 37 °C. C) Boceto de mapa de pozos en papel A4 o modelo de impresión 3D. Tres pozos con I) tres réplicas y II) dos réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procesos de enjambre de superficies en placas de gradiente inductor. Los procesos de enjambre de superficie bacteriana se capturan utilizando un sistema de imágenes en gel dentro de los 5 días posteriores a la inoculación. (A) Proceso de enjambre superficial inducido por arabinosa de E. coli K12-YdeH. (B) Proceso de enjambre superficial inducido por arabinosa de P. aeruginosa PAO1-YdeH. (C) Proceso de enjambre superficial de la cepa de tipo salvaje K12 de E. coli en la placa de gradiente de resveratrol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las curvas de enjambre de superficies representan múltiples respuestas de concentración en placas de gradiente inductor. Cada punto de datos cuantificable consta de tres réplicas. (A) Motilidad de enjambre inducida por arabinosa de P. aeruginosa PAO1-YdeH; las concentraciones aproximadas dentro de los pozos de prueba son 0,17% (p/v), 0,25% (p/v) y 0,42% (p/v). (B) Enjambre de cepas de tipo salvaje de E. coli K12 en placa de enjambre de gradiente de resveratrol; las concentraciones aproximadas dentro de los pozos de prueba son 67 μM, 200 μM y 335 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio de capa superior/medio de caldo de lisogenia (por 100 ml) | ||
| Triptona: 1 g | ||
| Cloruro de sodio: 1 g | ||
| Extracto de levadura: 0.5 g | ||
| Agar: 0.7 g | ||
| Medio de capa inferior/medio que contiene inductor (por 100 ml) | ||
| Triptona: 1 g | Concentración de trabajo: | Concentración de solución madre: |
| Cloruro de sodio: 1 g | ||
| Extracto de levadura: 0.5 g | - Resveratrol: 400 μM | - Resveratrol: 100 mM |
| Agar: 0.7 g | ||
| Inductor: | - Arabinosa: 0,5% (p/v) | - Arabinosa: 20% (p/v) |
| - Solución madre de resveratrol: 400 μL | o 1% (p/v) | |
| - Solución madre de arabinosa: 2,5 ml o 5 ml | ||
Tabla 1: Especificaciones del medio de enjambre de doble capa.
Figura suplementaria S1: Modelos de impresión 3D de tapa de placa de enjambre. (A) 3 x 3 pozos, incluidos tres pozos y tres réplicas. (B) 3 x 2 pozos, incluidos tres pozos y dos réplicas. (C) Hacer pozos con modelos de impresión 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Cuantificación del área de enjambre de superficie utilizando el software ImageJ. (A) Añadir 'sombras' a las imágenes originales (Proceso | Sombras) para generar enjambres cuantificables con límites claros. (B) Establecer barra de escala (Analizar | Establecer escala), seleccionar enjambres mediante herramientas de varita (rastreo) y exportar el área de enjambre (Analizar | Medida). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Placa de Petri cuadrada apuntalada para verter el medio de la capa inferior. El ángulo de inclinación es de ~4.3 °. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La investigación de la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente semisólido puede ser una tarea desafiante18,19,20, ya que involucra múltiples factores como la viscosidad del sustrato, la humedad y los componentes medios. Entre estos factores, la concentración de agar juega un papel decisivo en la determinación de la reversión microbiana a la motilidad de natación o enjambre. A medida que la concentración de agar aumenta de 0.3% (p/v) a 1% (p/v), la motilidad bacteriana de natación se restringirá y cambiará gradualmente al enjambre superficial, y la concentración de agar por encima del 1% (p/v) prohibirá tanto la natación como la motilidad en enjambre7. La concentración de agar se fijó en 0,7% (p/v) sobre la base de experimentos preliminares, ya que mostró un mejor rendimiento que otras concentraciones.
Esta concentración de agar también se empleó previamente para estudiar la quimiotaxis microbiana21. La disminución de la concentración de agar da como resultado un área de enjambre más grande, acompañada de superposiciones entre pozos adyacentes, lo que aumenta la dificultad de cuantificar el área de enjambre debido a la demarcación poco clara de los límites. La concentración relativamente alta de agar da como resultado una pequeña área de enjambre, disminuyendo la posibilidad de superposiciones. Sin embargo, el exceso de agar (>1,0%) puede prevenir el enjambre de superficie bacteriana. Por lo tanto, es esencial seleccionar una concentración de agar adecuada que se pueda aplicar a todas las especies de prueba para generar resultados comparables con una viscosidad estándar.
Los pozos dispuestos isométricamente proporcionan un espacio igual y apropiado para que las bacterias enjambres. La disposición de los pozos puede ser diferente dependiendo de las necesidades de las placas de enjambre de gradiente. El enjambre de superficie puede superponerse debido a la distancia insuficiente entre los pozos de prueba (Figura 2A), lo que dificulta la cuantificación del área del enjambre, especialmente en un estudio prolongado. Se establecieron tres pozos de prueba dentro de una placa de enjambre para probar múltiples respuestas de concentración y evitar la superposición de colonias (Figura 2B, C).
En comparación con una aguja inoculante22, los pozos de retención preparados en estas placas semisólidas proporcionan un volumen de inoculación estandarizado. También se encontró que los pozos de retención sostienen el cultivo bacteriano, evitando la propagación bacteriana observada en otros métodos como el pipeteo 23. Los pozos de retención realizados mediante la inserción de modelos de impresión 3D presentan sitios de inicio de inoculación más claros y estandarizados. Aunque estos pozos requieren una preparación adicional, reducen la desviación entre los puntos de prueba al marcar las posiciones de inoculación en la plantilla. Además, se pueden calcular los recuentos bacterianos exactos en cada pozo de retención, mejorando la reproducibilidad de los datos. Como medida de precaución, la preparación apresurada o descuidada de los pozos podría provocar el agrietamiento de los pozos, lo que resultaría en una variación del enjambre de la superficie durante la migración, ya que los microbios están inclinados a moverse a través de las grietas.
Se debe tener cuidado para evitar salpicaduras del cultivo iniciador microbiano durante la preparación del pozo de carga y la carga de la muestra, especialmente en placas de enjambre de baja viscosidad. Además, el volumen del cultivo bacteriano cargado debe optimizarse para minimizar el tiempo necesario para que los microbios escalen las paredes internas de cada pozo de retención, al tiempo que se evita la posibilidad de derrame durante el transporte de la placa (para fines de imágenes). En este trabajo, disminuimos el volumen de carga de cultivo bacteriano para minimizar la posibilidad de derrame, lo que resulta en un retraso en la migración bacteriana que comúnmente se confunde con el retraso del enjambre24.
Es necesario adaptar la formulación del medio debido a las diferencias de viscosidad y las fuentes de nutrientes requeridas entre las especies móviles. Para algunas especies (por ejemplo, Bacillus subtilis25), el enjambre de superficie puede ser rápido; por lo tanto, el intervalo de imagen debe acortarse. La cuantificación del área de enjambre asistida por computadora proporciona información más precisa que la medición de distancia del radio26. Para generar límites claros para calcular el área de enjambre mediante el software ImageJ, se utilizó un método incorporado en este protocolo que agrega sombras a las imágenes originales adquiridas utilizando el sistema de imágenes en gel. Si un límite del enjambre se fusiona con el adyacente, la migración hacia la frontera se inhibirá, donde estas comunidades prefieren migrar hacia las áreas desocupadas de las placas de enjambre (Figura 2A). Estos factores limitantes resultantes de la superposición de límites presentan un desafío significativo para determinar la distancia migratoria del enjambre superficial, donde estos valores no pueden integrarse en el proceso de enjambre libre.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
El desarrollo de esta técnica fue apoyado por los fondos del plan nacional clave de I + D del Ministerio de Ciencia y Tecnología (2018YF0902604), el Fondo de Investigación para Jóvenes Científicos Internacionales (22050410270) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y los Fondos Externos de los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen (DWKF20190001). Nos gustaría ofrecer nuestro sincero agradecimiento a la señorita Chen Xinyi por su ayuda en la revisión del documento y la gestión del laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
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