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Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63419
Automatic Translation
1,2, 2,3, 3, 4, 1,5,6, 1,2,5,6,7
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

Summary

Un protocole de laboratoire complet et un flux de travail d’analyse sont décrits pour un test colorimétrique rapide, rentable et simple basé sur les cellules afin de détecter les éléments neutralisants contre AAV6.

Abstract

Les virus adéno-associés recombinants (rAAV) se sont avérés être un vecteur sûr et efficace pour le transfert de matériel génétique afin de traiter divers problèmes de santé en laboratoire et en clinique. Cependant, les anticorps neutralisants préexistants (NAbs) contre les capsides AAV posent un défi permanent pour l’administration réussie de thérapies géniques à la fois dans les grands modèles expérimentaux animaux et dans les populations humaines. Un dépistage préliminaire de l’immunité de l’hôte contre l’AAV est nécessaire pour assurer l’efficacité des thérapies géniques à base d’AAV en tant qu’outil de recherche et en tant qu’agent thérapeutique cliniquement viable. Ce protocole décrit un test colorimétrique in vitro pour détecter les facteurs neutralisants contre le sérotype 6 de l’AAV (AAV6). Le test utilise la réaction entre un AAV codant pour un gène rapporteur de phosphatase alcaline (AP) et son substrat NBT / BCIP, qui génère une tache violette quantifiable insoluble lors de la combinaison.

Dans ce protocole, les échantillons de sérum sont combinés avec un AAV exprimant l’AP et incubés pour permettre une activité neutralisante potentielle. Le mélange de sérum viral est ensuite ajouté aux cellules pour permettre la transduction virale de tous les AAV qui n’ont pas été neutralisés. Le substrat NBT/BCIP est ajouté et subit une réaction chromogène, correspondant à la transduction virale et à l’activité neutralisante. La proportion de surface colorée est quantifiée à l’aide d’un outil logiciel gratuit pour générer des titres neutralisants. Ce test montre une forte corrélation positive entre la coloration et la concentration virale. L’évaluation d’échantillons de sérum de moutons avant et après l’administration d’un AAV6 recombinant a entraîné une augmentation spectaculaire de l’activité neutralisante (augmentation de 125 à >10 000 fois). Le test a montré une sensibilité adéquate pour détecter l’activité neutralisante dans >1:32 000 dilutions sériques. Ce test fournit une méthode simple, rapide et rentable pour détecter les NAbs contre les AAV.

Introduction

Les virus adéno-associés (AAV) sont de plus en plus utilisés comme vecteurs pour l’administration de thérapies géniques à des traitements d’essai pour divers problèmes de santé qui ont un impact sur les systèmes cardiovasculaire, pulmonaire, circulatoire, oculaire et nerveux central1,2,3,4,5. La popularité des vecteurs AAV en tant que plate-forme de thérapie génique de premier plan découle de leur profil d’innocuité positif, de leur expression transgénique à long terme et de leurs tropismes spécifiques aux tissus1,6. Les résultats positifs des études animales ont ouvert la voie à plus de cinquante essais cliniques de thérapie génique AAV qui ont atteint avec succès leurs critères d’efficacité7, ainsi qu’à la sortie du premier médicament de thérapie génique AAV disponible dans le commerce approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis8. Après les premiers succès, l’AAV a continué de gagner du terrain dans les secteurs de la recherche fondamentale et clinique en tant que vecteur de choix et est actuellement la seule thérapie génique in vivo approuvée pour une utilisation clinique aux États-Unis et en Europe9. Néanmoins, la présence d’anticorps neutralisants préexistants (NAbs) contre les capsides vectorielles AAV reste un obstacle à la recherche préclinique et à l’efficacité des essais cliniques. Les NAbs sont présents dans les populations humaines et animales naïves et inhibent la transduction des gènes après l’administration in vivo d’un vecteur AAV1. La séropositivité à l’AAV est un critère d’exclusion pour la plupart des essais de thérapie génique et, par conséquent, le dépistage préliminaire de l’immunité de l’hôte est crucial en laboratoire et en clinique. L’établissement d’un test capable de détecter la présence de NAbs contre l’AAV est une étape essentielle dans le pipeline de tout projet de recherche basé sur la thérapie génique AAV. Ce rapport se concentre sur AAV6 qui a intéressé les chercheurs en raison de sa transduction efficace et sélective dans les muscles striés (cœur et muscle squelettique)1,10,11,12. La thérapie génique est considérée comme une stratégie prometteuse pour cibler le cœur, car il est difficile de cibler spécifiquement le cœur sans procédures invasives à cœur ouvert.

L’activité neutralisante est généralement déterminée à l’aide d’un test d’inhibition de la transduction in vitro ou in vivo à base de cellules. In vivo Les tests NAb impliquent généralement l’administration de sérum d’un sujet testé (par exemple, humain ou gros animal) à des souris, suivie d’un AAV avec un gène rapporteur, suivi d’un test d’expression du gène rapporteur ou de l’antigène correspondant. Les essais in vitro déterminent les titres de NAb en incubant du sérum ou du plasma d’un humain ou d’un gros animal dans des dilutions en série avec un AAV recombinant (rAAV) qui exprime un gène rapporteur. Les cellules sont infectées par le mélange sérum/virus, et la mesure dans laquelle l’expression du gène rapporteur est inhibée est évaluée par rapport aux témoins. Les tests in vitro sont largement utilisés pour le dépistage du NAb en raison de leur coût comparativement inférieur, de la rapidité des tests et de la plus grande capacité de normalisation et de validation13,14 par rapport aux essais in vivo. On rapporte souvent que les essais in vivo ont une plus grande sensibilité15,16, mais la même allégation a été faite concernant les essais in vitro14,17.

À ce jour, les tests NAb in vitro ont principalement utilisé la luminescence (luciférase) comme gène rapporteur pour détecter la neutralisation. Bien qu’une méthode basée sur la lumière ait du mérite dans de nombreux contextes, un test colorimétrique / chromogène NAb peut être avantageux dans certaines circonstances. Des tests colorimétriques pour évaluer la neutralisation ont été utilisés avec succès pour d’autres virus tels que la grippe et l’adénovirus18,19. Leur attrait provient de leur simplicité, de leur coût inférieur et de l’exigence de ne disposer que d’appareils et d’outils de laboratoire quotidiens20. Les tests NAb qui utilisent un gène rapporteur basé sur la luminescence nécessitent des kits de substrat coûteux, un luminomètre et un logiciel correspondant pour l’analyse21. Ce test colorimétrique a l’avantage de ne nécessiter qu’un microscope optique et un substrat très bon marché. La déclaration de la sensibilité des tests colorimétriques par rapport aux tests luminescents a donné des résultats contradictoires. Une étude a suggéré que les tests ELISA basés sur la luminescence présentent une plus grande sensibilité et une reproductibilité comparable aux tests colorimétriques22, tandis qu’une autre a révélé que les tests ELISA basés sur la colorimétrie conféraient une plus grande sensibilité23. Ici, un protocole détaillé pour un test NAb in vitro contre l’AAV qui utilise la réaction chromogène entre un AAV codant pour un gène rapporteur de phosphatase alcaline (AP) et un substrat de tétrazolium bleu nitro / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) est fourni. Ce protocole étape par étape a été développé sur la base d’un rapport précédent qui utilisait un gène rapporteur hPLAP (phosphatase alcaline placentaire humaine) (AAV6-hPLAP) pour détecter l’activité neutralisante contre AAV24. Ce test est rentable, rapide, facile à configurer et nécessite un minimum de compétences techniques, d’équipement de laboratoire et de réactifs. De plus, la simplicité de ce test lui donne le potentiel d’être optimisé pour de larges applications sur différents types de cellules, de tissus ou de sérotypes viraux.

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Protocol

Tous les aspects des soins et de l’expérimentation animale ont été menés conformément aux lignes directrices du Florey Institute of Neuroscience and Mental Health et au Code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques suivant la référence25. Des brebis mérinos âgées de 1,5 à 3 ans ont été utilisées pour l’étude. Un aperçu schématique du protocole d’essai est fourni à la figure 1.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique du protocole de test NAb. (A) Représentation visuelle du test NAb illustrant les principales étapes impliquées dans le protocole de trois jours. En bref, les cellules sont cultivées et plaquées pendant la nuit. Le lendemain, des dilutions en série du sérum sont préparées, incubées avec de l’AAV, puis incubées avec les cellules pendant la nuit. Le lendemain, les cellules sont fixées, lavées, incubées, combinées avec le substrat et incubées à nouveau, suivies de l’imagerie et de la quantification. (B) Images représentatives d’un contrôle de signal minimum (inhibition complète de l’AAV), d’un contrôle de signal maximal (pas d’inhibition) et d’un échantillon de sérum ovin avec une inhibition du signal d’environ 50%. Barre d’échelle = 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

1. Préparation initiale

  1. Pour l’évaluation chez le mouton : prélever le sang dans des tubes d’activation de caillots séparateurs de sérum de 8 mL (voir tableau des matériaux), laisser l’échantillon de sang à température ambiante (RT) pendant 20 à 30 min, puis tourner à 2 100 x g pendant 15 min. Le surnageant clair qui se forme au sommet des tubes est le sérum. Aliquoter la phase aqueuse claire dans des tubes de microcentrifugation et stocker à -80 °C.
    REMARQUE: Le sérum à -80 ° C reste stable pendant environ 5 ans. Le sang a été prélevé dans la veine carotide à l’aide d’une aiguille de 16 G (coupure de pointe) et d’une seringue d’animaux conscients.
  2. Chauffer le sérum bovin fœtal (FBS) en le plaçant au bain-marie à 56 °C pendant 30 min et tourbillonner par intermittence. Pour plus de précision, placez un thermomètre dans une deuxième bouteille contenant un volume d’eau équivalent et ajoutez-le au bain de chaleur en même temps que la bouteille FBS. Commencez la synchronisation lorsque le thermomètre atteint 56 °C.
  3. Utiliser une technique aseptique appropriée et une pratique de culture cellulaire pour toutes les étapes ultérieures effectuées dans la culture cellulaire26,27. Vaporiser 70% d’éthanol sur tous les objets et la hotte avant utilisation et nettoyer avec 1% d’hypochlorite de sodium à la fin.
  4. Compléter le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco en combinant un DMEM élevé en glucose (4,5 g / L) DMEM (89%) avec FBS inactivé par la chaleur (10%) et streptomycine à la pénicilline (1%). Combiner et filtrer à l’aide d’un système de filtration sous vide stérile (taille des pores de 0,22 μm, membrane de polyéthersulfone) (voir tableau des matériaux). Conserver le DMEM complet enveloppé dans du papier d’aluminium à 4 °C.
  5. Établir des cellules HT1080 (voir Tableau des matériaux) et passer dans une fiole carrée de 75 cm2 comme décrit à la référence 28. Créez plusieurs stocks congelés de cellules. N’utilisez pas de cellules après 20 passages, car un passage supplémentaire peut influencer les résultats du test.

2. Jour 1 - Placage des cellules

  1. Passage des cellules HT1080 lorsqu’elles atteignent ~ 80% de confluence.
  2. DMEM complet préchauffé (préparé à l’étape 1.4), 0,05 % de trypsine-EDTA et 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C au bain-marie. Retirez le milieu de croissance des cellules traversées à l’aide d’un système d’aspiration.
    REMARQUE: Toute aspiration dans ce protocole utilise un système de vide avec un tube attaché à une pipette sérologique stérile de 5 mL.
  3. Laver les cellules dans 10 mL de PBS préchauffé (37 °C) et trypsiniser les cellules pendant 3 à 4 min dans 4 mL de trypsine-EDTA préchauffée à 0,05 % pour détacher les cellules de la fiole.
  4. Inactiver la trypsine en ajoutant 6 mL de DMEM complet préchauffé et pipeter les cellules dans un tube de 50 mL. Calculer le nombre et la concentration de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et de la méthode d’exclusion du bleu de trypan29.
  5. Diluer les cellules à une concentration de 1 x 105 cellules/mL dans du DMEM complet préchauffé. Ensemencez 100 μL de cellules/puits dans des plaques claires à fond plat de 96 puits (1 x 104 cellules par puits). Incuber la plaque à 37 °C, 5% de dioxyde de carbone (CO2) pendant la nuit pendant 16-22 h.

3. Jour 2 - Infecter les cellules

  1. Retirez les plaques de l’incubateur et utilisez un microscope optique pour confirmer que les cellules sont dispersées uniformément dans les puits et que la confluence est d’environ 50%. Si les cellules ne se trouvent pas dans une plage de confluence de 45 % à 55 %, répétez le protocole du « Jour 1 » et ajustez la concentration cellulaire initiale en conséquence.
  2. Générer des dilutions en série des échantillons de sérum d’intérêt dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL en utilisant du DMEM complet préchauffé comme diluant. Le tableau 1 illustre la génération d’une cascade de dilution pour les échantillons triples.
    1. Pour effectuer le dosage en triplicate, préparer un 7,5 x 106 génomes vectoriels (vg)/μL de solution de travail d’AAV6-hPLAP (voir Tableau des matériaux) en diluant une solution mère de virus dans 1x PBS.
    2. Ajouter 66 μL de la solution de travail du virus 7,5 x 106 vg/μL à chaque tube contenant 264 μL de dilution sérique/milieu (330 μL de volume total/dilution, voir tableau 1).
      REMARQUE: Il s’agit d’un test robuste qui ne nécessite pas de conditions de culture parfaites. Cependant, pour quantifier avec précision et s’assurer que chaque essai est fiable, il est nécessaire d’inclure les éléments suivants: (1) un contrôle du virus et du milieu uniquement, (2) un contrôle du milieu uniquement et (3) un échantillon de contrôle positif NAb sur toutes les plaques dans les mêmes conditions expérimentales. Le volume décrit (330 μL) représente des échantillons triples +10% du mélange sérum et virus. L’exécution de répétitions est fortement recommandée pour la détermination précise de l’activité de neutralisation.
  3. Mélanger les dilutions virus/sérum par pipetage et placer les tubes contenant les mélanges virus/sérum dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre une neutralisation potentielle.
  4. Pipette 100 μL du mélange virus/sérum dans chaque puits sur la plaque de 96 puits contenant 1 x 104 cellules/puits pour chaque dilution.
    REMARQUE: Cela générera une concentration virale finale de 15k virus / multiplicité cellulaire de l’infection (MOI) dans chaque puits. Le tableau 2 fournit un exemple de disposition de plaque d’échantillonnage de 96 puits pour évaluer les échantillons à une dilution de 1/512.
  5. Envelopper la plaque de 96 puits contenant des cellules, du sérum et de l’AAV-hPLAP dans une feuille et placer dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pendant la nuit pendant 16-24 h pour permettre à l’AAV d’entrer dans les cellules.
Étiquette de cascade de dilution Dilution 3 x échantillon (240 μL) + 10 % de volume tampon (24 μL) Rapport sérum:média
Dilution 1 (D1) 1/2 264 μL de sérum 264 μL de milieu 50:50
Dilution 2 (D2) 1/4 264 μL D1 + 264 μL 25:75
Dilution 3 (D3) 1/8 264 μL D2 + 264μL média 12.5:87.5
Dilution 4 (D4) 1/16 264 μL D3 +264 μL média 6.25:93.75
Dilution 5 (D5) 1/32 264 μL D4 +264 μL média 3.13:96.87
Dilution 6 (D6) 1/64 264 μL D5 +264 μL média 1.56:98.44
Dilution 7 (D7) 1/128 264 μL D5 +264 μL média 0.78:99.22
Dilution 8 (D8) 1/256 264 μL D5 +264 μL média 0.39:99.61
Dilution 9 (D9) 1/512 264 μL D7 + 264 μL de média 0.2:99.8
Dilution 10 (D10) 1/2048 132 μL D8 + 396 μL de média 0.05:99.95
Dilution 11 (D11) 1/8192 132 μL D9 + 396 μL de média 0.01:99.99
Dilution 12 (D12) 1/32768 132 μL D10 + 396 μL de média 0.003:99.997

Tableau 1 : Volumes de sérum et de diluant nécessaires pour générer des dilutions en série du sérum en triple.

Échantillon de sérum #1 Échantillon de sérum #2 Échantillon de sérum #3 Mono AB (mAB), commandes et échantillons supplémentaires
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 50 ng MAb 50 ng MAb 50 ng MAb
B 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 5 ng MAb 5 ng MAb 5 ng MAb
C 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 0,5 ng MAb 0,5 ng MAb 0,5 ng MAb
D 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 MO (-C) MO (-C) MO (-C)
E 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 VO (+C) VO (+C) VO (+C)
F 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 Exemple #1 1/512 Exemple #1 1/512 Exemple #1 1/512
G 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 Exemple #2 1/512 Exemple #2 1/512 Exemple #2 1/512
H 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 Exemple #3 1/512 Exemple #3 1/512 Exemple #3 1/512

Tableau 2 : Exemple de disposition de plaques à 96 puits pour l’évaluation d’échantillons de sérum naïfs dans des dilutions allant de 1/2 à 1/512. Des dilutions plus élevées sont incorporées dans le test si l’on évalue un échantillon connu pour être positif pour les NAbs AAV (échantillons post-administration) ou si un titre plus élevé est nécessaire. MO (-C) : Contrôle des supports uniquement. VO (+C) : Contrôle des virus et des médias uniquement. mAb : Anticorps monoclonal contre l’AAV (NAb positif témoin).

4. Jour 3 - Fixation et ajout de substrat aux cellules

  1. Préchauffez une aliquote de 1x PBS à 37 °C (~25 mL/plaque de 96 puits). Refroidir les aliquotes séparées de PBS (~25 mL/plaque de 96 puits) et de H2O double distillé (DDW, ~25 mL/plaque de 96 puits) à 4 °C. Dissoudre une pastille de BCIP/NBT (voir Tableau des matériaux) dans 10 mL de DDW dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL par vortex (10 mL suffisent pour 2 x 96 plaques de puits).
  2. Aspirer le milieu des puits de la plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette sérologique ou similaire fixée à un système d’aspiration à base d’aspiration ou à un aspirateur de hotte. Placez doucement l’extrémité de la pipette sérologique dans le puits et retirez le milieu en prenant soin de ne pas perturber les cellules adhérentes.
    1. Ajouter 50 μL de RT 4 % de PFA à chaque puits à l’aide d’une pipette. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et laissez-la à TA pendant 10 minutes pour fixer les cellules.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde (PFA) est probablement cancérogène et toxique par contact cutané, visuel ou par inhalation. Manipuler dans une hotte avec un équipement de protection individuelle approprié ainsi qu’un masque facial. Faire du PFA frais à 4 % dilué dans du PBS (~ 7 mL requis par plaque de 96 puits).
  3. Lavez et aspirez les cellules avec 200 μL de RT 1x PBS. Répétez cette étape deux fois.
    REMARQUE: Une pipette multicanal est une option efficace pour les étapes de pipetage.
  4. Pipette 200 μL de PBS préchauffé dans chaque puits, envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et incuber à 65 °C pendant 90 min pour dénaturer l’activité endogène de la phosphatase alcaline30.
  5. Aspirer les puits et laver les cellules avec 200 μL de PBS froid (4 °C). Aspirer à nouveau, laver dans 200 μl de DDW froid et aspirer à nouveau.
  6. Pipette 50 μL du BCIP/NBT dissous (préparé à l’étape 4.1) dans chaque puits.
  7. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et incuber à RT pendant 2-24 h.
    REMARQUE: Soyez cohérent avec le temps d’incubation entre les exécutions; la flexibilité temporelle permet aux utilisateurs de photographier les puits le jour 3 ou le lendemain.
  8. À l’aide d’un appareil photo au microscope optique, prenez des photos de chaque puits à l’aide d’un objectif 4x, en veillant à ce que la même exposition, le même équilibrage des blancs et les mêmes réglages de lumière soient utilisés de manière cohérente pour tous les tests effectués.
    1. Positionnez chaque puits de manière identique et assurez-vous que les bords du puits ne sont pas visibles sur les photos. Enregistrez des photos au format TIF ou similaire.
      REMARQUE : Les réglages spécifiques varient d’un microscope à l’autre, mais la quantification sera plus efficace si l’éclairage de fond est élevé et constant dans l’ensemble des puits (Figure 1B).

5. Quantification pour déterminer l’activité de neutralisation à l’aide d’ImageJ

  1. Téléchargez et installez le logiciel gratuit « ImageJ » (voir Tableau des matériaux).
  2. Ouvrez l’image à analyser dans ImageJ en sélectionnant Fichier > Ouvrir (Figure 2).
  3. Si vous utilisez des images colorées, convertissez-les en niveaux de gris en sélectionnant Image > Type > 8 bits.
  4. Cliquez sur Image > Ajuster > seuil. Ajustez le seuil jusqu’à ce que toutes les zones colorées soient colorées en rouge, mais pas l’arrière-plan. Lors de l’ajout de NBT / BCIP, le produit coloré se déposera dans la zone autour des cellules exprimant hPLAP.
    REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser le même paramètre de seuil pour toutes les images capturées sur la même plaque.
  5. Cliquez sur Analyser > Définir les mesures et cochez les cases à cocher Zone, Limite au seuil, Fraction de surface et Afficher et cliquez sur OK.
  6. Pour déterminer la lecture du signal (pourcentage de coloration) d’un puits donné, cliquez sur Analyser > Mesurer. La colonne '% Area' de la fenêtre contextuelle affiche la lecture du signal.
  7. Effectuer la quantification pour tous les réplicats d’échantillons. Exclure les puits contaminés, les puits présentant une distribution cellulaire inégale ou les puits dont la densité cellulaire ou l’éclairage varie.
    REMARQUE : Voir la figure supplémentaire 1 pour des exemples de puits dont l’exclusion devrait être envisagée. En règle générale, 3 à 4 puits peuvent nécessiter une exclusion d’une plaque de 96 puits. La figure 2 fournit une représentation visuelle du processus de quantification à l’aide d’ImageJ.

Figure 2
Figure 2 : Étapes permettant de déterminer le pourcentage de coloration à l’aide du logiciel ImageJ. (A) Ouvrez l’image à analyser avec le logiciel ImageJ. (B) Convertissez l’image en niveaux de gris 8 bits. (C) Ouvrez la fenêtre de seuil. (D) Ajustez le seuil maximal pour que toutes les zones colorées soient couvertes, mais pas la zone d’arrière-plan (ce seuil doit être cohérent sur une plaque entière). (E) Sélectionnez la dropbox 'Analyser', cliquez sur 'Définir les mesures' et cochez 'Zone', 'Fraction de surface', 'Seuil limite' et 'Afficher l’étiquette', puis cliquez sur 'OK'. (F) Cliquez sur « Mesurer » pour mesurer la zone couverte. La zone % indique la proportion de l’image qui a été colorée. Cela peut ensuite être utilisé avec les échantillons de contrôle pour déterminer le titre TI50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Détermination du titre d’inhibition de la transduction (TI50)

  1. Déterminez la lecture moyenne des réplications (à l’aide des étapes décrites à l’étape 5) pour les éléments suivants : (1) Contrôle du média uniquement (lecture du signal de référence). (2) Contrôle du virus + média uniquement (lecture maximale du signal). (3) Virus + échantillons de sérum d’intérêt.
  2. Calculez le pourcentage d’inhibition à l’aide de la formule suivante :
    100 - [(Lecture du signal de l’échantillon d’essai (virus + échantillon sérique d’intérêt) - lecture du signal de base (contrôle du média uniquement)) / (lecture maximale du signal (média et virus uniquement) - lecture du signal de base) x 100] = % Inhibition de la transduction13.
  3. Calculer le pourcentage d’inhibition de la transduction à partir de tous les réplicats de chaque dilution pour tous les échantillons en utilisant la formule indiquée au point 6.2. Déterminer l’inhibition moyenne de la transduction entre les répétitions techniques pour chaque dilution pour tous les échantillons et témoins.
  4. Calculer le titre d’inhibition de la transduction à 50 % (titre TI50 ) d’un échantillon d’intérêt en déterminant la dilution la plus faible de l’échantillon qui produit une inhibition de transduction de 50 % ou plus de l’activité hPLAP. Par exemple, si une dilution de 1/8 d’un échantillon présente une inhibition de transduction supérieure à 50 % d’après le calcul effectué au point 6.2 (et qu’une dilution de 1/4 ne le fait pas), indiquez que le titre TI50 est de 1/8.

7. Détermination des particules d’AAV neutralisées

  1. Calculer le nombre de particules DVA neutralisées par μL de sérum pour un échantillon donné en utilisant la formule suivante :
    ((MOI x nombre de cellules/puits) / (volume de sérum / facteur de dilution du titre TI50 )) / 2 = particules AAV neutralisées / μL de sérum9.
    NOTE: La division par 2 représente le TI50 mesurant 50% des particules neutralisées. Pour un échantillon qui donne un titre TI50 de 1/4 (25% de sérum, 75% de diluant) dans lequel le dosage a utilisé 80 μL de sérum non dilué et un MOI de 15k plaqué sur 1 x 104 cellules, le calcul suivant serait utilisé: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3,75x106 particules neutralisées / μL de sérum.

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Representative Results

Test de transduction pour établir le dosage viral optimal pour la couverture des plaques
Les cellules HT1080, une lignée cellulaire de fibrosarcome bien établie, ont été sélectionnées pour ce test. Une concentration de 1 x 104 cellules HT1080 / puits a fourni ~ 50% de confluence cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Pour déterminer la concentration virale optimale pour le dosage, un rAAV codant pour un gène rapporteur hPLAP (phosphatase alcaline placentaire humaine) (AAV6-hPLAP)31 a été ajouté en triple exemplaire à une gamme de concentrations de vg contenant des particules par cellule (MOI: 0, 150, 500, 1500, 5000, 15000, 50000 et 150000 (Figure 3A)). Un MOI de 15000 (1,5 x 108 vg/puits) conférait 36% de coloration des plaques et a été sélectionné comme dosage viral optimal. Une corrélation positive a été observée entre la coloration et les concentrations virales pour tous les MOI compris entre 0 et 15000 (n = 6, r = 0,995, P<0,001). Cette concentration affichait adéquatement le signal du gène rapporteur au-dessus de l’arrière-plan en présence de concentrations élevées de NAbs (faible coloration des plaques) sans perdre de sensibilité en raison de la saturation des couleurs en l’absence de NAbs (coloration élevée, figure 3B).

L’efficacité du test, lorsqu’il est exposé à des éléments neutralisants, a été testé en utilisant des dilutions en série d’un anticorps monoclonal de souris anti-AAV6 (mAb) en triple. L’approche standard consistant à utiliser la première dilution pour afficher une inhibition de transduction de 50 % ou plus (TI50) a été appliquée pour déterminer le titre neutralisant d’un échantillon donné (étape 6). En évaluant les dilutions log10 , l’anti-AAV6 mAb a montré un titre TI50 d’environ 10 ng/mL (1 ng de mAb total), tandis qu’une concentration de 500 ng/mL (50 ng d’Ab total) et plus a complètement inhibé l’expression du gène rapporteur (Figure 3C).

Figure 3
Figure 3 : Optimisation de la dose virale et évaluation de l’efficacité du test contre un anticorps monoclonal anti-AAV6 (mAB). (A) La proportion de coloration (% de la surface totale) pour les puits individuels à différentes multiplicités d’infection (MOI) et des images représentatives (ci-dessous) montrant la réaction chromogène correspondante entre la phosphatase alcaline (hPLAP) et le NBT/BCIP pour chaque dose virale (à gauche). La couverture de la plaque en pourcentage est également indiquée sous forme de tableau (à droite). Chaque point de données représente une réplication technique (n = 3 réplications par MOI). (B) Une représentation de la corrélation entre la coloration et le MOI est représentée à la figure 3A. La ligne pointillée rouge représente la concentration la plus élevée testée qui n’a pas affecté la corrélation linéaire entre la coloration et la concentration virale. (C) Activité neutralisante contre AAV6 à partir d’un anticorps monoclonal anti-AAV6 à des dilutions log10. Une inhibition de 50 % de la transduction de l’AAV6 (TI50) est observée à une concentration d’environ 10 ng/mL. n = 3 répliques par dilution. Les données représentent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Évaluation des NAbs par rapport à l’AAV6 dans des échantillons de moutons
Le sérum a été prélevé dans la veine carotide à l’aide d’une aiguille de 16 G (coupure de pointe) et d’une seringue de moutons adultes naïfs et conscients (brebis mérinos de 1,5 à 3 ans) (n = 11) et examiné pour déterminer le titre TI50 à l’aide du test colorimétrique NAb. Des dilutions en série doubles allant d’une dilution de 1/2 à une dilution de 1/512 ont été évaluées pour chaque échantillon de sérum en double ou en triple. La dilution 1/2 contenait un total de 40 μL de sérum, ce qui correspondait à une concentration de 1,88 x 106 particules AAV par μL de sérum. Le degré de neutralisation de l’AAV variait au sein de la population d’échantillons naïfs, avec des valeurs de titre TI50 allant de 1/2 (ligne bleue) à 1/80 (ligne verte, 1,88 x 106 à 7,5 x 107 particules DVA neutralisées/μL de sérum) (figure 4A).

Par la suite, une injection cardiaque directe (n = 5) d’AAV6 a été réalisée à des doses comprises entre 5 x 1012 et 3 x 1013 vg à des moutons naïfs. En bref, les moutons ont été anesthésiés comme décrit précédemment32. Le cœur a été exposé de la position latérale gauche. Le péricarde a été ouvert et l’AAV a été administré par des injections de 10 à 40 ~ 20 μL dans le myocarde ventriculaire gauche (antérieur) dans la région autour de la deuxième branche de l’artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD). Le péricarde, le muscle intercostal, le tissu sous-cutané et la peau ont été fermés et l’anesthésique a été retiré. Le sérum a été prélevé sur tous les animaux avant et six à huit semaines après l’administration d’AAV dans la veine jugulaire droite précanulée à l’aide d’une aiguille de 16 G et d’une seringue (~ 5 mL de sérum / animal). Le test colorimétrique NAb a été utilisé pour déterminer le changement de titre NAb après l’administration d’AAV6. Les échantillons de sérum post-AAV ont été examinés en trois exemplaires sous forme de dilutions en série de 2 à 4 fois allant d’une dilution de 1/2 à une dilution de 1/32768. Les résultats du test ont indiqué que les valeurs de titre TI50 d’inhibition de l’AAV avant l’administration de l’AAV variaient de 1/4 à 1/80 (3,75 x 106 à 7,5 x 107 particules d’AAV neutralisées/μL de sérum; Figure 4B). Après l’injection cardiaque d’AAV, un contraste clair et constant dans le titre NAb a été observé par rapport aux titres sériques pré-AAV (Figure 4B, Tableau 3). La dose d’AAV la plus faible (5 x1012 vg) affichait un titre TI50 de 1/2048 (ligne bleue pointillée, 1,92 x 109 particules d’AAV neutralisées/sérum μL) et le reste des doses (1-3 x 1013 vg) affichait des titres TI50 allant de 1/12000 à >1/32768 (1,13 x1010 à >3 x 1010 particules d’AAV neutralisées/μL de sérum).

Figure 4
Figure 4 : Exemple de résultats d’essais d’anticorps neutralisants (Nab) à l’aide d’échantillons de sérum ovin. (A) Des échantillons de sérum neutralisant le virus adéno-associé (AAV) ont été prélevés sur 11 moutons naïfs, mesurés dans des dilutions en série 2 fois allant de 1/2 à 1/512. Les lignes colorées représentent des échantillons avec une activité neutralisante faible et élevée; les lignes grises représentent les neuf échantillons supplémentaires. La ligne pointillée représente 50% d’inhibition de la transduction (TI50) et les titres TI50 correspondants pour les échantillons représentatifs bas (bleu) et haut (vert). (B) Activité neutralisante de l’AAV d’échantillons de sérum prélevés sur cinq moutons avant et après avoir reçu une dose d’AAV par injection cardiaque directe. L’activité neutralisante a été évaluée dans des dilutions en série 2 fois allant de 1/2 à 1/32768. Chaque couleur représente le sérum d’un animal différent, les lignes remplies représentent l’administration pré-AAV et les lignes pointillées représentent l’administration post-AAV. n = 2-3 répétitions par dilution pour chaque échantillon. Les données représentent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Id du mouton État de l’administration Dose reçue (vg) Titre NAb (TI50) Sérum AAV neutralisé / μL Changement de pliage Pre vs Post
Mouton 1 Pré-AAV 1x1013 1/5 5,6 x 106 6400
Après –AAV 1/32000 3x1010
Mouton 2 Pré-AAV 1x1013 1/80 7,5 x 107 200
Après –AAV 1/16000 1,5x1010
Moutons 3 Pré-AAV 5x1012 1/16 1,5 x 107 125
Après –AAV 1/2000 1,9 x 109
Moutons 4 Pré-AAV 2x1013 1/4 3,8 x 106 >10000
Après –AAV >1/32000 >3x1010
Moutons 5 Pré-AAV 3x1013 1/8 7,5 x 106 1700
Après –AAV 1/12000 2,3x1010

Tableau 3 : Incidence de l’exposition au VAA sur l’activité neutralisante. L’activité neutralisante des moutons a été évaluée avant et après avoir reçu une injection cardiaque directe d’un rAAV6 à des doses variables. La dose reçue avant et après les titres TI50 et le changement de pli après l’administration sont affichés.

Figure supplémentaire 1 : Exemples visuels de différentes raisons d’exclure les puits d’échantillonnage. (A) La présence de contamination peut être observée par des amas au centre. (B) Densité cellulaire élevée. (C) Éclairage inégal du puits (image de gauche), seuil correspondant du même puits affichant une couverture excédentaire dans le coin inférieur droit (image de droite). (D) Images répliquées techniques, l’image de gauche représentant des résultats avec une densité cellulaire normale, l’image de droite reflétant des résultats avec une faible densité de cellules. (E) Les cellules sont inégalement réparties dans un puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Carte plasmidique simplifiée affichant l’insert hPLAP. CMV : Promoteur du cytomégalovirus. hPLAP : phosphatase alcaline placentaire humaine. SV40 : Signal de polyadénylation du virus Simien 40. ITR : Séquences de répétition terminales inversées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ce rapport décrit un test colorimétrique qui évalue l’étendue de la neutralisation de l’AAV dans un échantillon de sérum donné en évaluant une réaction chromogène correspondant au degré de transduction virale in vitro. Le développement du protocole était basé sur la réaction chromogène connue entre l’enzyme phosphatase alcaline et nbT / BCIP, qui a été largement utilisée comme outil de coloration pour la détection de cibles protéiques dans des applications telles que l’immunohistochimie et comme outil rapporteur pour évaluer la transduction virale24,33,34,35 . Son mérite provient de son temps et de sa rentabilité, de son accessibilité, de sa facilité d’installation et de performance tout en démontrant un haut degré d’efficacité. Le rAAV6 utilisé dans ce test (AAV-hPLAP) porte le gène rapporteur de la phosphatase alcaline placentaire humaine (hPLAP) et est entraîné par un promoteur de cytomégalovirus (CMV)34 (Figure supplémentaire 2). NBT/BCIP est un substrat hPLAP qui est initialement déphosphorylé par la phosphatase alcaline et subit séquentiellement une oxydation pour former un dimère, ce qui donne un produit insoluble de couleur pourpre vif36.

En sélectionnant le MOI optimal pour ce test, l’objectif était d’établir une concentration virale qui exprimerait suffisamment le gène rapporteur AAV par liaison virus-cellule et, en conjonction avec le substrat NBT/BCIP, fournirait une coloration dans une plage qui pourrait être mesurée avec précision. Un MOI de 15 000 a été sélectionné, car il s’agissait de la concentration la plus élevée testée qui n’affectait pas la corrélation linéaire entre la coloration et la concentration virale. Des concentrations plus élevées (50 000 et 150 000 MOI) ont provoqué un plateau de la courbe concentration-réponse couleur, indiquant une saturation des couleurs (Figure 3B). L’évaluation des AMI viraux compris entre 0 et 15 000 (n = 6) et leur niveau de coloration correspondant ont abouti à r = 0,995 (P < 0,001), validant la sensibilité du test en établissant une très forte corrélation positive entre la concentration virale et la coloration induite par les gènes rapporteurs. Compte tenu de la variabilité potentielle de facteurs tels que les conditions de culture cellulaire, les techniciens de laboratoire, les techniques et l’équipement, ainsi que les variations des lots viraux, il est recommandé à tout nouvel utilisateur d’effectuer une évaluation préliminaire de l’IMR optimal lors de l’établissement d’un test NAb.

Le MOI choisi pour un test NAb donné est un facteur majeur contribuant au titre global observé pour un échantillon de sérum donné. Si un MOI de 5 000 au lieu de 15 000 avait été sélectionné, une différence de 3 fois dans la valeur du titre serait anticipée. Cela a toujours été problématique dans le domaine de la thérapie génique AAV, car différents essais précliniques et cliniques ont mis en œuvre des tests AAV NAb avec des valeurs MOI allant de moins de 1 000 à 25 00037, ce qui signifie que tout type de comparaison croisée des titres NAb pour un sérotype AAV donné a peu ou pas de valeur. Il a récemment été suggéré que la déclaration des titres sous forme de particules d’AAV neutralisées par μL de sérum peut fournir des valeurs plus comparables dans différentes études9,38. De nombreux autres facteurs peuvent contribuer à la variation des titres entre les études, tels que le choix de la lignée cellulaire, le gène rapporteur, les temps d’incubation et les conditions de culture. Pour faciliter la normalisation des tests AAV NAb, les valeurs de titre et les particules AAV neutralisées / μL de sérum ont été rapportées.

Il est essentiel d’inclure une dilution en série d’un échantillon de NAb connu sur chaque plaque pour agir à la fois comme un témoin positif et un échantillon commun entre les plaques. Ceci est important pour identifier toute variabilité possible entre des exécutions distinctes. Un anticorps monoclonal neutralisant contre l’AAV d’intérêt est un contrôle positif et une norme idéaux, mais un échantillon de sérum positif pour les NAbs est également acceptable. L’efficacité du test a été validée en démontrant qu’un anticorps monoclonal spécifique aux particules intactes d’AAV6 (ADK6) peut inhiber quantitativement la transduction en fonction de la concentration.

Sur la base de la fiche technique du fabricant, le système de substrat BCIP / NBT produit le produit bleu-violet insoluble en ~ 10 minutes et est très stable. Cependant, il est à noter que les procédures peuvent affecter la durée du temps d’incubation. Sur la base de rapports antérieurs, des délais de 1 à 24 heures ont été utilisés30,39. Pour ce test, les temps d’incubation doivent être cohérents entre les cycles. La flexibilité du temps permet aux utilisateurs de photographier les puits soit le jour 3 du protocole, soit le lendemain.

Les essais précliniques utilisant de grands modèles animaux constituent un tremplin crucial entre le laboratoire et la clinique en raison de la ressemblance physiologique que les animaux tels que les moutons et les porcs partagent avec les humains1,40,41. Historiquement, la plupart des thérapies géniques AAV candidates qui ont fait l’objet d’essais cliniques ont fait l’objet d’essais préliminaires sur de grands animaux1. De nombreuses études ont démontré que les humains et une gamme de grands animaux, y compris les moutons, les porcs, les chiens, les lapins et les primates non humains, peuvent héberger des anticorps neutralisants contre AAV6 ainsi que de nombreux autres sérotypes AAV42,43. Cela souligne l’importance du dépistage préliminaire des NAbs avant les essais sur de grands modèles animaux et chez l’homme. Le statut NAb des échantillons de sérum de moutons qui n’avaient pas d’exposition connue auparavant à l’AAV a été évalué, dont 10 sur 11 présentaient des titres TI50 <1/30 (<3 x 107 particules d’AAV neutralisées/μL de sérum). En revanche, l’un d’eux affichait un titre TI50 de 1/80 (7,5 x 107 particules AAV neutralisées/μL de sérum). Cinq des moutons ont ensuite reçu une injection directe de rAV dans le muscle cardiaque. Parmi tous les échantillons, l’administration d’AAV a radicalement modifié l’activité de neutralisation, avec des augmentations du changement de pli allant de 125 à > 10 000 fois les valeurs de titre TI50 entre l’exposition avant et après l’AAV (tableau 3). Il convient de noter que la dose d’AAV6 la plus faible administrée (5 x 1012 vg) correspondait à la valeur de titre TI50 post-AAV la plus faible (titre TI50 1/2000) et à l’augmentation du changement de pli (125 fois). En comparaison, aucune preuve claire de NAbs préexistants chez les 11 moutons naïfs n’a été observée à des niveaux qui empêcheraient la transduction de l’AAV (toutes les valeurs de titre TI50 <1/100). Les données des 5 moutons qui ont reçu une injection directe d’AAV suggèrent qu’un seuil de positivité au NAb serait de >1/1000 (sur la base des valeurs pré et post-AAV). La différence frappante entre le titre pré et post-NAb et la capacité de détecter les titres >1/32 000 fournit une validation supplémentaire de l’efficacité et de la sensibilité du test. L’établissement d’un point de coupure auquel un échantillon est jugé positif pour l’activité neutralisante est une étape ultérieure essentielle pour déterminer un seuil pour les animaux positifs au NAb. Cela peut être déterminé en évaluant la variabilité dans un groupe (~n ≥ 30) d’échantillons naïfs provenant d’une population d’intérêt spécifique. Cela permet d’établir des critères pour choisir un point de coupure statistiquement dérivé dans lequel un échantillon est jugé positif pour neutraliser l’activité. Alternativement, des échantillons témoins positifs d’animaux avant et après l’administration d’AAV, comme le montre la figure 4B, peuvent indiquer la plage de titre positive pour l’activité neutralisante. Les recommandations concernant l’établissement de seuils de coupure et la validation et l’optimisation des essais de neutralisation in vitro ont été décrites en détail dans la littérature44,45,46,47.

La technique implique certaines limitations. L’utilisation de la caméra de microscope pour imager les puits est utile car elle fournit des images de très haute qualité qui peuvent différencier avec précision le degré de neutralisation. Cependant, la microscopie peut nécessiter beaucoup de main-d’œuvre et peut ne pas être pratique si elle traite de nombreux échantillons (>100). Un scanner à plat ou à plaques haute résolution peut fournir une approche plus rapide de l’imagerie des puits si la qualité et l’éclairage des images peuvent être maintenus. Des MMI élevées ont été signalées pour réduire la sensibilité de détection des tests. Il a été suggéré que des doses élevées d’AAV peuvent échapper à l’activité neutralisante ou que la transduction de l’AAV peut se produire en présence de NAbs48,49,50. Ce test utilise un MOI modérément élevé (15 000); toutefois, la sensibilité ne semble pas être entravée car elle peut détecter une activité neutralisante à des dilutions très élevées (>1:32 000) (figure 4B). Enfin, comme ce test utilise un vecteur viral, une approbation appropriée par un organe directeur est généralement requise pour utiliser l’AAV recombinant; cela variera d’un pays à l’autre.

En résumé, ce test in vitro fournit une méthode rapide, rentable, facilement accessible et simple pour détecter la présence d’anticorps neutralisants contre le rAAV6. Ce test peut être ajusté et optimisé pour fonctionner avec différents sérotypes AAV avec une relative facilité. Le vecteur AAV6-hPLAP peut être fourni pour ce test sur demande.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par une subvention de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale à JRM et CJT (ID 1163732) et en partie par le programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement victorien. SB est soutenu par une bourse de doctorat conjointe baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. KLW est soutenu par la Shine On Foundation et une future bourse Future Leader de la National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM est soutenu par une bourse de recherche principale du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (ID 1078985).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath

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References

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Biologie numéro 178
Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules
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Bass-Stringer, S., Thomas, C. J.,… More

Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).

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