الكشف في الوقت الحقيقي والتقاط المجموعات الفرعية للخلايا الغازية من الثقافات المشتركة
Summary
نحن نصف نهجا للكشف عن المجموعات الفرعية للخلايا الغازية والتقاطها في الوقت الفعلي. يستخدم التصميم التجريبي التحليل الخلوي في الوقت الفعلي من خلال مراقبة التغيرات في المعاوقة الكهربائية للخلايا. يمكن التقاط السرطان الغازي أو الخلايا المناعية أو البطانية أو اللحمية في الأنسجة المعقدة ، ويمكن تقييم تأثير الثقافات المشتركة.
Abstract
الغزو والانتشار النقيلي للخلايا السرطانية هي السبب الرئيسي للوفاة من السرطان. عادة ما تولد الفحوصات التي تم تطويرها في وقت مبكر لقياس الإمكانات الغازية لمجموعات الخلايا السرطانية قياسا واحدا لنقطة النهاية لا يميز بين المجموعات الفرعية للخلايا السرطانية ذات الإمكانات الغازية المختلفة. أيضا ، تتكون البيئة الدقيقة للورم من خلايا لحمية ومناعية مقيمة مختلفة تتغير وتشارك في السلوك الغازي للخلايا السرطانية. يلعب غزو الأنسجة أيضا دورا في المجموعات الفرعية للخلايا المناعية التي تتصدى للكائنات الحية الدقيقة أو تقضي على الخلايا المريضة من الحمة والخلايا البطانية أثناء إعادة تشكيل الأنسجة وتكوين الأوعية. كان التحليل الخلوي في الوقت الفعلي (RTCA) الذي يستخدم أجهزة الاستشعار الحيوية للمعاوقة لمراقبة غزو الخلايا خطوة كبيرة إلى الأمام تتجاوز قياس نقطة النهاية للغزو: وهذا يوفر قياسات مستمرة بمرور الوقت وبالتالي يمكن أن يكشف عن الاختلافات في معدلات الغزو التي يتم فقدانها في فحص نقطة النهاية. باستخدام تقنية RTCA الحالية ، قمنا بتوسيع صفائف الحجرة المزدوجة عن طريق إضافة غرفة أخرى يمكن أن تحتوي على خلايا لحمية و / أو مناعية وتسمح بقياس معدل الغزو تحت تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة مع مرور الوقت. علاوة على ذلك ، يسمح التصميم الفريد بفصل الغرف في أي وقت وعزل الخلايا السرطانية الأكثر توغلا ، أو المجموعات الفرعية الأخرى من الخلايا الموجودة في مزيج غير متجانس من عزلات الورم التي تم اختبارها. هذه الخلايا السرطانية الأكثر توغلا وغيرها من المجموعات الفرعية للخلايا تدفع التقدم الخبيث إلى مرض النقيلي ، وخصائصها الجزيئية مهمة للدراسات الميكانيكية المتعمقة ، وتطوير تحقيقات تشخيصية للكشف عنها ، وتقييم نقاط الضعف. وبالتالي ، يمكن استخدام تضمين الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة أو الكبيرة لاختبار إمكانات العلاجات التي تستهدف السرطان و / أو المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية بهدف تثبيط (على سبيل المثال ، الخلايا السرطانية) أو تعزيز (على سبيل المثال ، الخلايا المناعية) السلوك الغازي.
Introduction
غزو الخلايا هو عملية مهمة تسمح للخلايا بعبور حواجز الغشاء السفلي استجابة للإشارات البيئية التي توفرها الخلايا اللحمية. إنها خطوة حاسمة خلال عدة مراحل من التطور للاستجابات المناعية ، والتئام الجروح ، وإصلاح الأنسجة ، والأورام الخبيثة التي يمكن أن تتطور من الآفات المحلية إلى السرطانات الغازية والنقيلية1. عادة ما تولد الفحوصات التي تم تطويرها في وقت مبكر لقياس الإمكانات الغازية لمجموعات الخلايا قياسا واحدا لنقطة النهاية أو تتطلب وضع علامات مسبقة على الخلايا الغازية2. تم الآن تطوير تكامل تقنيات الإلكترونيات الدقيقة والموائع الدقيقة للكشف عن الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلية مثل الجدوى والحركة والتعلق باستخدام المعاوقة الكهربائية للخلايا الحية على الأقطاب الكهربائية الدقيقة 3,4. يسمح قياس المعاوقة بإجراء تقييم كمي خال من الملصقات وغير جراحي وكمي لحالة الخلية3. هنا نصف مصفوفة من ثلاث غرف تستند إلى تصميم نظام التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي (RTCA) الذي طوره Abassi et al.5. تسمح المجموعة المكونة من ثلاث غرف بتقييم الخلايا المستزرعة بشكل مشترك على الغزو الخلوي واستعادة الخلايا الغازية لإجراء تحليلات إضافية أو توسيع.
في نظام محلل الخلايا ، تغزو الخلايا من خلال مصفوفة خارج الخلية مغلفة بغشاء مسامي وتصل إلى مجموعة أقطاب كهربائية متداخلة الهوية موضوعة على الجانب الآخر من الحاجز. مع استمرار الخلايا الغازية في التعلق واحتلال مجموعة الأقطاب الكهربائية هذه بمرور الوقت ، تتغير المعاوقة الكهربائية بالتوازي. يتكون النظام الحالي من لوحة غزو وهجرة الخلايا (CIM) المكونة من 16 بئرا مع غرفتين. يحتوي جهاز RTCA-DP (الغرض المزدوج) (يسمى محلل الخلايا ثنائي الغرض من الآن فصاعدا) على أجهزة استشعار لقياس المعاوقة وبرامج متكاملة لتحليل ومعالجة بيانات المعاوقة. تعتمد قيم المقاومة عند خط الأساس على القوة الأيونية للوسائط في الآبار ويتم تغييرها عندما تلتصق الخلايا بالأقطاب الكهربائية. تعتمد تغيرات المعاوقة على عدد الخلايا ومورفولوجيتها ومدى ارتباط الخلايا بالأقطاب الكهربائية. يعتبر قياس الآبار باستخدام الوسائط قبل إضافة الخلايا بمثابة إشارة خلفية. يتم طرح الخلفية من قياسات المعاوقة بعد الوصول إلى التوازن مع الخلايا التي تعلق وتنتشر على الأقطاب الكهربائية. يتم حساب معلمة غير موحدة لحالة الخلايا على قطب كهربائي يسمى مؤشر الخلية (CI) على النحو التالي: CI = (المعاوقة بعد التوازن – المعاوقة في حالة عدم وجود خلايا) / قيمة المعاوقة الاسمية6. عند مقارنة معدلات ترحيل خطوط الخلايا المختلفة، يمكن استخدام Delta CI لمقارنة حالة الخلية بغض النظر عن الفرق في المرفق الذي يتم تمثيله في القياسات القليلة الأولى.
تعتمد المصفوفة ثلاثية الغرف المصممة حديثا على التصميم الحالي وتستخدم الغرفة العلوية من نظام محلل الخلايا ثنائي الغرض الذي يحتوي على الأقطاب الكهربائية. يتم تكييف الغرف الوسطى والسفلية المعدلة لتناسب التجميع في محلل الخلايا ثنائي الغرض لقياس وتحليل المعاوقة باستخدام البرنامج المتكامل. التقدمان الرئيسيان اللذان يوفرهما التصميم الجديد على لوحة CIM الحالية ثنائية الغرفة (تسمى لوحة محلل الخلايا من الآن فصاعدا) هما: i) القدرة على التعافي ، ثم تحليل المجموعات الفرعية للخلايا الغازية الموجودة في خلطات الخلايا غير المتجانسة و ii) خيار تقييم تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة على غزو الخلايا (الشكل 1).
يمكن أن تكون هذه التكنولوجيا مفيدة في دراسة المجموعات الفرعية للخلايا ذات القدرات الغازية المختلفة. ويشمل ذلك (أ) الخلايا السرطانية الغازية التي تغزو الأنسجة المحيطة أو الأوعية الدموية واللمفاوية أو تتكاثر في مواقع البذر النقيلي في الأعضاء البعيدة، (ب) الخلايا من الجهاز المناعي التي تغزو الأنسجة لمعالجة مسببات الأمراض أو الخلايا المريضة، (ج) الخلايا البطانية التي تغزو الأنسجة لتشكيل أوعية دموية جديدة أثناء إعادة تنظيم الأنسجة أو التئام الجروح، وكذلك (د) الخلايا اللحمية من البيئة الدقيقة للورم التي تدعم وتغزو جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية. يسمح هذا النهج بإدراج الحديث المتبادل اللحمي الذي يمكن أن يعدل حركة الخلايا والغزو. تستخدم دراسات الجدوى الموضحة هنا هذه المجموعة المعدلة التي تركز على غزو الخلايا السرطانية والتفاعل مع السدى كنظام نموذجي ، بما في ذلك الغزو البطاني استجابة للإشارات التفاضلية من الخلايا السرطانية. يمكن استقراء هذا النهج لعزل الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى مثل المجموعات الفرعية للخلايا المناعية أو الخلايا الليفية أو الخلايا البطانية. اختبرنا خطوط خلايا سرطان الثدي الغازية وغير الغازية كدليل على المبدأ. كما استخدمنا خلايا من غزو xenograft (PDX) المشتق من المريض استجابة للخلايا المناعية من نخاع العظم البشري لإظهار جدوى للاستخدام المستقبلي أيضا في إعدادات التشخيص السريري. PDX هي أنسجة ورم المريض التي يتم زرعها في نموذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة أو البشرية للسماح بدراسة النمو والتقدم وخيارات العلاج للمريض الأصلي 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتعديل تصميم مصفوفة مزدوجة الغرف لتشمل غرفة ثالثة لمراقبة غزو الخلايا في الوقت الفعلي في وجود خلايا لحمية. لقد لاحظنا تأثيرات متميزة للخلايا الليفية المستزرعة بشكل مشترك على الخلايا السرطانية الغازية وغير الغازية مما يشير إلى أنه يمكن استخدام المصفوفة للتمييز بين المجموعات الف…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتورة ألانا ويلمز ، معهد هانتسمان للسرطان ، جامعة يوتا ، على تزويدنا ب xenografts المشتقة من المريض (HCI-010). تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA205632 و R21CA226542 ، وجزئيا ، بمنحة من Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Recherche en cancérologie. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
