Обнаружение и захват инвазивных клеточных субпопуляций из кокультур в режиме реального времени
Summary
Описан подход к обнаружению и захвату инвазивных клеточных субпопуляций в режиме реального времени. Экспериментальный проект использует клеточный анализ в реальном времени путем мониторинга изменений электрического импеданса клеток. Инвазивные раковые, иммунные, эндотелиальные или стромальные клетки в сложных тканях могут быть захвачены, и влияние кокультур может быть оценено.
Abstract
Инвазия и метастатическое распространение раковых клеток являются основной причиной смерти от рака. Анализы, разработанные на ранней стадии для измерения инвазивного потенциала популяций раковых клеток, обычно генерируют одно измерение конечной точки, которое не различает субпопуляции раковых клеток с различным инвазивным потенциалом. Кроме того, микроокружение опухоли состоит из различных резидентных стромальных и иммунных клеток, которые изменяют и участвуют в инвазивном поведении раковых клеток. Инвазия в ткани также играет роль в субпопуляциях иммунных клеток, отбивающихся от микроорганизмов или устраняющих больные клетки из паренхимы и эндотелиальных клеток во время ремоделирования тканей и ангиогенеза. Клеточный анализ в реальном времени (RTCA), который использует импедансные биосенсоры для мониторинга клеточной инвазии, был важным шагом вперед после измерения инвазии в конечной точке: это обеспечивает непрерывные измерения с течением времени и, таким образом, может выявить различия в скорости инвазии, которые теряются в анализе конечной точки. Используя современную технологию RTCA, мы расширили двухкамерные массивы, добавив дополнительную камеру, которая может содержать стромальные и / или иммунные клетки и позволяет измерять скорость инвазии под воздействием секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток с течением времени. Помимо этого, уникальная конструкция позволяет в любое время отсоединять камеры и выделять наиболее инвазивные раковые клетки или другие клеточные субпопуляции, которые присутствуют в гетерогенных смесях тестируемых изолятов опухолей. Эти наиболее инвазивные раковые клетки и другие клеточные субпопуляции приводят к злокачественному прогрессированию до метастатического заболевания, и их молекулярные характеристики важны для углубленных механистических исследований, разработки диагностических зондов для их обнаружения и оценки уязвимостей. Таким образом, включение низкомолекулярных или крупномолекулярных препаратов может быть использовано для проверки потенциала методов лечения, нацеленных на рак и/или субпопуляции стромальных клеток, с целью ингибирования (например, раковых клеток) или усиления (например, иммунных клеток) инвазивного поведения.
Introduction
Клеточная инвазия является важным процессом, который позволяет клеткам пересекать барьеры базальной мембраны в ответ на сигналы окружающей среды, предоставляемые стромальными клетками. Это важный шаг на нескольких этапах развития иммунных реакций, заживления ран, восстановления тканей и злокачественных новообразований, которые могут прогрессировать от локальных поражений до инвазивного и метастатического рака1. Анализы, разработанные на ранней стадии для измерения инвазивного потенциала клеточных популяций, обычно генерируют измерение одной конечной точки или требуют предварительной маркировки инвазивных клеток2. Интеграция методов микроэлектроники и микрофлюидики в настоящее время разрабатывается для обнаружения различных аспектов клеточной биологии, таких как жизнеспособность, движение и прикрепление, с использованием электрического импеданса живых клеток на микроэлектродах 3,4. Измерение импеданса позволяет проводить безметочную, неинвазивную и количественную оценку состояния клеток3. Здесь мы описываем трехкамерный массив, основанный на конструкции системы анализа клеток реального времени (RTCA), которая была разработана Abassi et al.5. Трехкамерный массив позволяет оценивать совместно культивируемые клетки при клеточной инвазии и восстановлении инвазивных клеток для дополнительного анализа или расширения.
В системе клеточного анализатора клетки проникают через внеклеточный матрикс, покрытый пористой мембраной, и достигают междигитированного электродного массива, расположенного на противоположной стороне барьера. Поскольку инвазивные клетки продолжают присоединяться и занимать этот электродный массив с течением времени, электрическое сопротивление изменяется параллельно. Нынешняя система содержит инвазию и миграцию ячеек (CIM) из 16-луночной пластины с двумя камерами. Прибор RTCA-DP (двойного назначения) (далее называемый анализатором ячеек двойного назначения) содержит датчики для измерения импеданса и интегрированное программное обеспечение для анализа и обработки данных об импедансе. Значения импеданса на исходном уровне зависят от ионной прочности среды в скважинах и изменяются по мере присоединения ячеек к электродам. Изменения импеданса зависят от количества ячеек, их морфологии и степени, в которой ячейки прикрепляются к электродам. Измерение скважин средой до добавления ячеек рассматривается как фоновый сигнал. Фон вычитается из измерений импеданса после достижения равновесия с прикреплением и распространением ячеек на электроды. Безудельный параметр состояния ячеек на электроде, называемый Cell Index (CI), рассчитывается следующим образом: CI = (импеданс после равновесия – импеданс при отсутствии ячеек) / номинальное значение импеданса6. При сравнении скоростей миграции различных клеточных линий Delta CI можно использовать для сравнения состояния клеток независимо от разницы в прикреплении, представленной в первых нескольких измерениях.
Недавно разработанный трехкамерный массив основан на существующей конструкции и использует верхнюю камеру от системы анализатора ячеек двойного назначения, которая содержит электроды. Модифицированные средняя и нижняя камеры адаптированы для установки сборки в анализатор ячеек двойного назначения для измерения и анализа импеданса с использованием интегрированного программного обеспечения. Двумя основными достижениями, которые новая конструкция обеспечивает по сравнению с существующей двухкамерной CIM-пластиной (впредь называемой пластиной клеточного анализатора), являются: i) способность восстанавливаться, а затем анализировать инвазивные клеточные субпопуляции, которые присутствуют в гетерогенных клеточных смесях, и ii) возможность оценки влияния секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток на инвазию клеток (рисунок 1).
Эта технология может быть полезна при изучении субпопуляций клеток с различной инвазивной способностью. Это включает в себя (a) инвазивные раковые клетки, которые вторгаются в окружающие ткани или кровеносные и лимфатические сосуды или экстравазируются в местах метастатического посева в отдаленных органах, (b) клетки иммунной системы, которые вторгаются в ткани для борьбы с патогенами или больными клетками, (c) эндотелиальные клетки, которые вторгаются в ткани с образованием новых кровеносных сосудов во время реорганизации тканей или заживления ран, а также (d) стромальные клетки из микроокружения опухоли, которые поддерживают и вторгаются вместе с раковыми клетками. Этот подход позволяет включить стромальные перекрестные помехи, которые могут модулировать подвижность и инвазию клеток. Технико-экономические обоснования, показанные здесь, используют этот модифицированный массив, ориентированный на инвазию раковых клеток и взаимодействие со стромой в качестве модельной системы, включая эндотелиальную инвазию в ответ на дифференциальные сигналы от раковых клеток. Этот подход может быть экстраполирован для выделения раковых клеток и других типов клеток, таких как субпопуляции иммунных клеток, фибробластов или эндотелиальных клеток. Мы протестировали инвазивные и неинвазивные установленные клеточные линии рака молочной железы в качестве доказательства принципа. Мы также использовали клетки из инвазии ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, в ответ на иммунные клетки из костного мозга человека, чтобы показать возможность будущего использования также в клинических диагностических условиях. PDX – это опухолевые ткани пациента, которые имплантируются в модель мышей с ослабленным иммунитетом или гуманизированным иммунитетом, чтобы обеспечить изучение роста, прогрессирования и вариантов лечения для исходного пациента 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы модифицировали конструкцию двухкамерного массива, включив в него третью камеру для мониторинга инвазии клеток в режиме реального времени в присутствии стромальных клеток. Мы наблюдали различные эффекты совместно культивируемых фибробластов на инвазивные и неинвазивные раковые к…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить доктора Алану Уэлмс, Институт рака Хантсмана, Университет штата Юта, за предоставление нам ксенотрансплантатов, полученных от пациента (HCI-010). Эта работа была поддержана грантами NIH R01CA205632, R21CA226542 и частично грантом от Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Recherche en cancérologie. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
