实时检测和捕获共培养物中的侵袭细胞亚群
Summary
我们描述了一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。实验设计使用实时细胞分析，通过监测细胞电阻抗的变化。可以捕获复杂组织中的浸润性癌症，免疫，内皮或基质细胞，并且可以评估共培养物的影响。
Abstract
癌细胞的侵袭和转移扩散是癌症死亡的主要原因。早期开发的用于测量癌细胞群侵袭潜力的测定通常产生单一终点测量，不区分具有不同侵袭潜力的癌细胞亚群。此外，肿瘤微环境由不同的常驻基质和免疫细胞组成，这些细胞改变和参与癌细胞的侵袭行为。侵入组织在免疫细胞亚群中也起作用，在组织重塑和血管生成期间抵御微生物或从薄壁和内皮细胞中消除患病细胞。实时细胞分析（RTCA）利用阻抗生物传感器来监测细胞侵袭是超越侵袭终点测量的重要一步：这提供了随时间推移的连续测量，因此可以揭示终点测定中丢失的侵袭率的差异。使用目前的RTCA技术，我们通过添加另一个可以包含基质和/或免疫细胞的腔室来扩展双室阵列，并允许随着时间的推移测量在共培养基质或免疫细胞分泌因子的影响下的侵袭速率。除此之外，独特的设计允许随时分离腔室并分离最具侵入性的癌细胞，或存在于测试的肿瘤分离物的异质混合物中的其他细胞亚群。这些最具侵袭性的癌细胞和其他细胞亚群推动恶性进展为转移性疾病，其分子特征对于深入的机理研究，用于检测它们的诊断探针的开发以及脆弱性的评估非常重要。因此，小分子或大分子药物的纳入可用于测试靶向癌症和/或基质细胞亚群的疗法的潜力，目的是抑制（例如，癌细胞）或增强（例如，免疫细胞）侵袭行为。
Introduction
细胞侵袭是一个重要的过程，它允许细胞根据基质细胞提供的环境线索穿过基底膜屏障。它是免疫反应、伤口愈合、组织修复和恶性肿瘤发展的几个阶段的关键步骤，这些肿瘤可以从局部病变进展为浸润性和转移性癌症1。早期开发的用于测量细胞群侵入潜力的测定通常产生单个终点测量或需要对侵入性细胞进行预标记2。现在开发了微电子学和微流体技术的集成，以使用微电极上活细胞的电阻抗来检测细胞生物学的不同方面，例如活力，运动和附着力3，4。阻抗测量允许对细胞状态进行无标记、无创和定量评估3.在这里，我们描述了一个基于Abassi等人开发的实时蜂窝分析（RTCA）系统设计的三腔阵列。三腔阵列允许评估共培养细胞的细胞侵袭和侵袭细胞的恢复，以进行额外的分析或扩增。
在细胞分析仪系统中，细胞通过包被到多孔膜上的细胞外基质侵入，并到达位于屏障另一侧的叉指电极阵列。随着侵入细胞继续附着并占据该电极阵列，电阻抗平行变化。目前的系统包括一个细胞侵袭和迁移（CIM）16孔板，带有两个腔室。RTCA-DP（双用途）（以下称为双用途电池分析仪）仪器包含用于阻抗测量的传感器和用于分析和处理阻抗数据的集成软件。基线阻抗值取决于孔中介质的离子强度，并且随着细胞附着在电极上而变化。阻抗的变化取决于细胞的数量，它们的形态以及细胞附着在电极上的程度。在添加细胞之前用培养基测量孔被认为是背景信号。在电池附着并扩散到电极上达到平衡后，从阻抗测量中减去背景。电极上称为细胞指数（CI）的电极状态的无单位参数计算如下：CI =（平衡后的阻抗 -无电池时的阻抗）/标称阻抗值6。当比较不同细胞系的迁移速率时，Delta CI可用于比较细胞状态，而不管前几次测量中表示的附着差异如何。
新设计的三腔室阵列建立在现有设计的基础上，并使用包含电极的双用途细胞分析仪系统的顶部腔室。改进的中腔室和底部腔室经过调整，可将组件安装到双用途单元分析仪中，以便使用集成软件进行阻抗测量和分析。与现有的双室CIM板（以下称为细胞分析仪板）相比，新设计提供的两个主要进步是：i）恢复能力，然后分析存在于异质细胞混合物中的侵入性细胞亚群，以及ii）评估共培养基质或免疫细胞分泌因子对细胞侵袭的影响的选项（图1）。
该技术可用于研究具有不同侵入能力的细胞亚群。这包括（a）侵入周围组织或血液和淋巴管或在远处器官的转移接种部位外渗的侵袭癌细胞，（b）来自免疫系统的细胞侵入组织以处理病原体或患病细胞，（c）内皮细胞在组织重组或伤口愈合期间侵入组织以形成新血管， 以及来自肿瘤微环境的（d）基质细胞，它们与癌细胞一起支持和入侵。该方法允许包含可以调节细胞运动和侵袭的基质串扰。这里显示的可行性研究使用这种专注于癌细胞侵袭和与基质相互作用的修饰阵列作为模型系统，包括内皮侵袭以响应来自癌细胞的差异信号。可以推断出这种方法来分离癌细胞和其他细胞类型，例如免疫细胞，成纤维细胞或内皮细胞的亚群。我们测试了侵入性和非侵入性已建立的乳腺癌细胞系作为原理证明。我们还使用来自患者来源的异种移植物（PDX）侵袭的细胞来响应来自人类骨髓的免疫细胞，以显示未来在临床诊断环境中使用的可行性。PDX是植入免疫功能低下或人源化小鼠模型中的患者肿瘤组织，以允许研究原始患者的生长，进展和治疗方案7，8。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们修改了双腔室阵列的设计，以包括第三个腔室，用于在基质细胞存在的情况下实时监测细胞侵袭。我们已经观察到共培养成纤维细胞对侵袭性和非侵袭性癌细胞的不同影响，这表明该阵列可用于区分对共培养基质细胞产生的因子反应不同的癌细胞亚群。该阵列还用于监测内皮细胞侵入基质组织，这是血管在存在具有不同侵袭潜力的癌细胞的情况下向血管生成刺激萌发的关键步骤。这些实验表?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢犹他大学亨斯迈癌症研究所的Alana Welms博士为我们提供患者来源的异种移植物（HCI-010）。这项工作得到了NIH拨款R01CA205632，R21CA226542的支持，部分得到了安捷伦科技公司的资助。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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