공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획
Summary
우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.
Abstract
암세포의 침윤 및 전이성 확산은 암으로 인한 사망의 주요 원인입니다. 암 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 상이한 침습적 잠재력을 갖는 암 세포 하위집단을 구별하지 않는 단일 종점 측정을 생성한다. 또한, 종양 미세환경은 암세포의 침습적 거동을 변화시키고 참여하는 상이한 상주 기질 및 면역 세포로 구성된다. 조직으로의 침윤은 또한 조직 리모델링 및 혈관형성 동안 미생물을 방어하거나 실질 및 내피 세포로부터 병든 세포를 제거하는 면역 세포 하위 집단에서 중요한 역할을 한다. 임피던스 바이오센서를 활용하여 세포 침윤을 모니터링하는 실시간 세포 분석(RTCA)은 침윤의 종점 측정을 넘어 중요한 진전이었습니다: 이는 시간이 지남에 따라 지속적인 측정을 제공하므로 종점 분석에서 손실되는 침윤율의 차이를 나타낼 수 있습니다. 현재의 RTCA 기술을 사용하여, 우리는 기질 및 / 또는 면역 세포를 포함 할 수있는 챔버를 추가로 추가하여 이중 챔버 어레이를 확장했으며 시간이 지남에 따라 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포에서 분비 된 인자의 영향으로 침윤 속도를 측정 할 수 있습니다. 이 외에도, 독특한 디자인은 언제든지 챔버를 분리하고 가장 침습적 인 암 세포 또는 테스트 된 종양 분리 물의 이종 혼합물에 존재하는 다른 세포 하위 집단을 분리 할 수있게합니다. 이러한 가장 침습적 인 암세포 및 기타 세포 하위 집단은 전이성 질환으로의 악성 진행을 유도하며, 분자 특성은 심층적 인 기계론 연구, 탐지를위한 진단 프로브 개발 및 취약성 평가에 중요합니다. 따라서, 소분자 또는 거대 분자 약물의 포함은 침습적 행동을 억제(예를 들어, 암 세포) 또는 증강(예를 들어, 면역 세포)하는 것을 목표로 암 및/또는 기질 세포 하위집단을 표적으로 하는 치료법의 잠재력을 시험하는데 사용될 수 있다.
Introduction
세포 침윤은 세포가 기질 세포에 의해 제공되는 환경 단서에 반응하여 기저막 장벽을 통과 할 수있게 해주는 중요한 과정입니다. 면역 반응, 상처 치유, 조직 복구 및 국소 병변에서 침습성 및 전이성 암으로 진행될 수있는 악성 종양을위한 개발의 여러 단계에서 중요한 단계입니다1. 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 단일 종점 측정을 생성하거나 침습성 세포의 사전 표지를 필요로한다2. 마이크로 일렉트로닉스 및 미세 유체 공학 기술의 통합은 이제 마이크로 전극 3,4에서 살아있는 세포의 전기 임피던스를 사용하여 생존력, 이동 및 부착과 같은 세포 생물학의 다양한 측면을 감지하기 위해 개발되었습니다. 임피던스 측정은 세포 상태에 대한 라벨 프리, 비침습적 및 정량적 평가를 가능하게한다3. 여기에서는 Abassi et al.5에 의해 개발 된 RTCA(Real-Time Cellular Analysis) 시스템의 설계를 기반으로 한 3개의 챔버 어레이에 대해 설명합니다. 세 개의 챔버형 어레이는 추가적인 분석 또는 확장을 위해 침습적 세포의 세포 침윤 및 회복에 대한 공동 배양된 세포의 평가를 가능하게 한다.
세포 분석기 시스템에서, 세포는 다공성 막 상에 코팅된 세포외 매트릭스를 통해 침범하여 장벽의 반대편에 위치하는 인터디지타이징된 전극 어레이에 도달한다. 침습 셀이 시간이 지남에 따라 이 전극 어레이를 계속 부착하고 점유함에 따라 전기 임피던스가 병렬로 변합니다. 현재 시스템은 두 개의 챔버를 갖는 세포 침윤 및 이동(CIM) 16-웰 플레이트를 포함한다. RTCA-DP(이중 목적)(이중 목적 셀 분석기라고 함) 계측기에는 임피던스 측정용 센서와 임피던스 데이터를 분석하고 처리하기 위한 통합 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 기준선에서의 임피던스 값은 웰 내의 매체의 이온 강도에 의존하며, 전지가 전극에 부착될 때 변화된다. 임피던스 변화는 셀의 수, 그 형태 및 셀이 전극에 부착되는 정도에 따라 달라집니다. 세포가 추가되기 전에 배지를 가진 웰의 측정은 배경 신호로 간주됩니다. 배경은 전극에 부착되고 확산되는 셀과 평형에 도달 한 후 임피던스 측정에서 뺍니다. 전극 상의 셀 상태에 대한 무단위 파라미터는 셀 인덱스(CI)로 명명된다: CI = (평형 후 임피던스 – 셀의 부재 하에서의 임피던스)/공칭 임피던스 값6. 상이한 세포주의 이동 속도가 비교될 때, 델타 CI는 처음 몇 번의 측정에서 표현되는 부착의 차이에 관계없이 세포 상태를 비교하는데 사용될 수 있다.
새로 설계된 세 개의 챔버 어레이는 기존 설계를 기반으로 하며 전극이 포함된 이중 용도 셀 분석기 시스템의 상단 챔버를 사용합니다. 수정된 중간 및 하단 챔버는 통합 소프트웨어를 사용하여 임피던스 측정 및 분석을 위해 조립품을 이중 용도 셀 분석기에 적합하도록 조정됩니다. 새로운 설계가 기존의 이중 챔버 CIM-플레이트 (이후 세포 분석기 플레이트라고 함)를 통해 제공하는 두 가지 주요 진보는 i) 이종 세포 혼합물에 존재하는 침습적 세포 하위 집단을 회수 한 다음 분석 할 수있는 능력 및 ii) 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포로부터 분비 된 인자가 세포 침윤에 미치는 영향을 평가하는 옵션 (그림 1).
이 기술은 다른 침습적 능력을 가진 세포의 하위 집단을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 여기에는 (a) 주변 조직이나 혈액 및 림프관을 침범하거나 먼 장기의 전이성 시딩 부위에서 혈관을 침범하는 침습성 암세포, (b) 병원균 또는 병든 세포를 다루기 위해 조직을 침범하는 면역계로부터의 세포, (c) 조직 재구성 또는 상처 치유 중에 새로운 혈관을 형성하기 위해 조직을 침범하는 내피 세포, 뿐만 아니라 (d) 종양 미세환경으로부터의 기질 세포는 암 세포와 함께 지지하고 침범한다. 이 접근법은 세포 운동성과 침윤을 조절할 수있는 기질 교차 대화의 포함을 허용합니다. 여기에 제시된 타당성 연구는 암 세포로부터의 차등 신호에 반응하여 내피 침윤을 포함하는 모델 시스템으로서 암 세포 침윤 및 스트로마와의 상호작용에 초점을 맞춘 이 변형된 어레이를 사용한다. 상기 접근법은 암 세포 및 다른 세포 유형, 예컨대 면역 세포, 섬유아세포, 또는 내피 세포의 하위집단을 분리하기 위해 외삽될 수 있다. 우리는 원칙의 증거로 침습적이고 비 침습적 인 확립 된 유방암 세포주를 테스트했습니다. 우리는 또한 인간 골수의 면역 세포에 반응하여 환자 유래 이종이식편 (PDX) 침윤의 세포를 사용하여 임상 진단 설정에서도 향후 사용에 대한 타당성을 보여주었습니다. PDX는 원래 환자(7,8)에 대한 성장, 진행 및 치료 옵션의 연구를 허용하기 위해 면역저하 또는 인간화 마우스 모델에 이식되는 환자 종양 조직이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 기질 세포의 존재하에 실시간으로 세포 침윤을 모니터링하기위한 세 번째 챔버를 포함하도록 이중 챔버 어레이의 설계를 수정했습니다. 우리는 침습성 및 비침습적 암 세포에 대한 공동 배양된 섬유아세포의 뚜렷한 효과를 관찰하였는데, 이는 어레이가 공동 배양된 기질 세포에 의해 생성된 인자에 다르게 반응하는 암 세포 하위집단을 구별하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이 어레이?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유타 대학교 헌츠만 암 연구소의 알라나 웰름스 박사에게 환자 유래 이종이식편(HCI-010)을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01CA205632, R21CA226542 및 부분적으로 애질런트 테크놀로지스의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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