Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas
Summary
Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.
Abstract
Invasão e propagação metastática de células cancerígenas são a principal causa de morte por câncer. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações de células cancerosas normalmente geram uma única medição de ponto final que não distingue entre subpopulações de células cancerosas com diferentes potenciais invasivos. Além disso, o microambiente tumoral consiste em diferentes células estrômicas residentes e imunes que alteram e participam do comportamento invasivo das células cancerosas. A invasão aos tecidos também desempenha um papel nas subpopulações de células imunes que se defendem de microrganismos ou eliminam células doentes das células parenchyma e endotelial durante a remodelação tecidual e angiogênese. A Análise Celular em Tempo Real (RTCA) que utiliza biosensores de impedância para monitorar a invasão celular foi um grande passo em frente além da medição do ponto final da invasão: isso fornece medições contínuas ao longo do tempo e, portanto, pode revelar diferenças nas taxas de invasão que são perdidas no ensaio de ponto final. Usando a tecnologia RTCA atual, expandimos matrizes de câmara dupla adicionando uma câmara adicional que pode conter células estrômicas e/ou imunes e permite medir a taxa de invasão sob a influência de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas ao longo do tempo. Além disso, o design único permite desprender câmaras a qualquer momento e isolar a célula cancerígena mais invasiva, ou outras subpopulações celulares que estão presentes em misturas heterogêneas de isolados tumorais testados. Essas células cancerígenas mais invasivas e outras subpopulações celulares impulsionam a progressão maligna para doenças metastáticas, e suas características moleculares são importantes para estudos mecanicistas aprofundados, o desenvolvimento de sondas diagnósticas para sua detecção e a avaliação de vulnerabilidades. Assim, a inclusão de drogas de pequenas ou grandes moléculas pode ser usada para testar o potencial de terapias que visam o câncer e/ou subpopulações de células estromicas com o objetivo de inibir (por exemplo, células cancerosas) ou melhorar (por exemplo, células imunes) comportamento invasivo.
Introduction
A invasão celular é um processo importante que permite que as células cruzem barreiras de membrana de porão em resposta a pistas ambientais fornecidas por células estromas. É um passo crucial durante vários estágios de desenvolvimento para respostas imunes, cicatrização de feridas, reparação de tecidos e malignidades que podem progredir de lesões locais para cânceres invasivos e metastáticos1. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações celulares normalmente geram uma única medição de ponto final ou requerem pré-rotulagem de células invasoras2. A integração das técnicas de microeletrônica e microfluido é agora desenvolvida para detectar diferentes aspectos da biologia celular, como viabilidade, movimento e apego usando a impedância elétrica de células vivas em microeletrodos 3,4. A medição de impedância permite uma avaliação não invasiva e quantitativa do statuscelular 3. Aqui descrevemos uma matriz de três câmaras baseada no design do sistema RTCA (Real-Time Cellular Analysis, análise celular em tempo real) que foi desenvolvido pela Abassi et al.5. O conjunto de três câmaras permite a avaliação de células co-cultivadas sobre invasão celular e recuperação de células invasoras para análises adicionais ou expansão.
No sistema de analisador celular, as células invadem através de uma matriz extracelular revestida em uma membrana porosa e atingem uma matriz de eletrodos interdigitadas posicionada no lado oposto da barreira. À medida que as células invasoras continuam a prender e ocupar esta matriz de eletrodos ao longo do tempo, a impedância elétrica muda em paralelo. O sistema atual compreende uma placa de invasão e migração celular (CIM) de 16 poços com duas câmaras. O instrumento RTCA-DP (dual purpose cell analyzer a partir de agora) contém sensores para medição de impedância e software integrado para analisar e processar os dados de impedância. Os valores de impedância na linha de base dependem da força iônica da mídia nos poços e são alterados à medida que as células se ligam aos eletrodos. As mudanças de impedância dependem do número de células, sua morfologia, e até que ponto as células se ligam aos eletrodos. Uma medição dos poços com mídia antes que as células sejam adicionadas é considerada como o sinal de fundo. O fundo é subtraído de medidas de impedância depois de atingir o equilíbrio com células anexando e se espalhando para os eletrodos. Um parâmetro sem unidade do status das células em um índice celular denominado eletrodo (IC) é calculado da seguinte forma: IC = (impedância após equilíbrio – impedância na ausência de células) / valor de impedância nominal6. Quando as taxas de migração de diferentes linhas celulares são comparadas, o CI Delta pode ser usado para comparar o status da célula, independentemente da diferença de apego representada nas primeiras medições.
O recém-projetado array de três câmaras se baseia no design existente e usa a câmara superior do sistema de analisador de células de dupla finalidade que contém os eletrodos. As câmaras média e inferior modificadas são adaptadas para encaixar o conjunto no analisador de células de dupla finalidade para medição e análise de impedância usando o software integrado. Os dois principais avanços que o novo projeto proporciona sobre a placa CIM de duas câmaras existente (chamada placa analisador de células a partir de agora) são: i) a capacidade de recuperação e, em seguida, analisar subpopulações celulares invasivas que estão presentes em misturas de células heterogêneas e ii) a opção de avaliar o impacto de fatores secretados de células estromes ou imunes co-cultivadas na invasão celular (Figura 1).
Essa tecnologia pode ser útil no estudo das subpopulações de células com diferentes capacidades invasivas. Isso inclui (a) células cancerígenas invasivas que invadem tecidos ou sangue ao redor e vasos linfáticos ou extravasados em locais de semeadura metastática em órgãos distantes, (b) células do sistema imunológico que invadem tecidos para combater patógenos ou células doentes, (c) células endoteliais que invadem tecidos para formar novos vasos sanguíneos durante a reorganização tecidual ou cicatrização de feridas, assim como (d) células estromas do microambiente tumoral que suportam e invadem junto com células cancerígenas. A abordagem permite a inclusão de conversas cruzadas estromicas que podem modular a motilidade celular e a invasão. Os estudos de viabilidade aqui mostrados utilizam este conjunto modificado focado na invasão de células cancerosas e na interação com o estroma como um sistema modelo, incluindo a invasão endotelial em resposta a sinais diferenciais de células cancerosas. A abordagem pode ser extrapolada para isolar células cancerígenas e outros tipos de células, como subpopulações de células imunes, fibroblastos ou células endoteliais. Testamos linhas invasivas e não invasivas estabelecidas células cancerígenas de mama como prova de princípio. Também usamos células da invasão de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) em resposta às células imunes da medula óssea humana para mostrar viabilidade para uso futuro também em ambientes de diagnóstico clínico. PDX são tecidos tumorais do paciente que são implantados em camundongos imunocomprometidos ou humanizados para permitir o estudo do crescimento, progressão e opções de tratamento para o paciente original 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificamos o projeto de uma matriz de câmara dupla para incluir uma terceira câmara para monitorar a invasão celular em tempo real na presença de células estromicas. Observamos efeitos distintos de fibroblastos co-cultivados em células cancerígenas invasivas e não invasivas indicando que a matriz pode ser usada para distinguir entre subpopulações de células cancerosas que respondem de forma diferente aos fatores produzidos por células estrogonais co-cultivadas. A matriz também foi usada para monitorar a inv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA205632, R21CA226542 e, em parte, por subvenção da Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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