Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen
Summary
Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.
Abstract
Invasion und metastasierende Ausbreitung von Krebszellen sind die Haupttodesursache durch Krebs. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Krebszellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung, die nicht zwischen Krebszellsubpopulationen mit unterschiedlichem invasivem Potenzial unterscheidet. Außerdem besteht die Tumormikroumgebung aus verschiedenen residenten Stroma- und Immunzellen, die das invasive Verhalten von Krebszellen verändern und daran teilnehmen. Das Eindringen in Gewebe spielt auch eine Rolle bei Immunzellsubpopulationen, die Mikroorganismen abwehren oder erkrankte Zellen aus dem Parenchym und den Endothelzellen während des Gewebeumbaus und der Angiogenese eliminieren. Die Echtzeit-Zellanalyse (Real-Time Cellular Analysis, RTCA), die Impedanz-Biosensoren zur Überwachung der Zellinvasion verwendet, war ein wichtiger Schritt über die Endpunktmessung der Invasion hinaus: Sie ermöglicht kontinuierliche Messungen im Laufe der Zeit und kann somit Unterschiede in den Invasionsraten aufdecken, die im Endpunktassay verloren gehen. Mit der aktuellen RTCA-Technologie haben wir Zweikammer-Arrays erweitert, indem wir eine weitere Kammer hinzugefügt haben, die Stroma- und / oder Immunzellen enthalten kann und es ermöglicht, die Invasionsrate unter dem Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen im Laufe der Zeit zu messen. Darüber hinaus ermöglicht das einzigartige Design jederzeit das Ablösen von Kammern und die Isolierung der invasivsten Krebszelle oder anderer Zellsubpopulationen, die in heterogenen Mischungen von getesteten Tumorisolaten vorhanden sind. Diese invasivsten Krebszellen und andere Zellsubpopulationen treiben das maligne Fortschreiten zu metastasierenden Erkrankungen voran, und ihre molekularen Eigenschaften sind wichtig für eingehende mechanistische Studien, die Entwicklung diagnostischer Sonden für ihre Erkennung und die Bewertung von Schwachstellen. So kann die Einbeziehung von nieder- oder großmolekularen Medikamenten genutzt werden, um das Potenzial von Therapien zu testen, die auf Krebs und/oder Stromazellsubpopulationen abzielen, mit dem Ziel, invasives Verhalten zu hemmen (z. B. Krebszellen) oder zu verstärken (z. B. Immunzellen).
Introduction
Die Zellinvasion ist ein wichtiger Prozess, der es Zellen ermöglicht, Basalmembranbarrieren als Reaktion auf Umwelthinweise von Stromazellen zu überwinden. Es ist ein entscheidender Schritt in mehreren Entwicklungsstadien für Immunantworten, Wundheilung, Gewebereparatur und Malignome, die von lokalen Läsionen zu invasiven und metastasierenden Krebsarten übergehen können1. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Zellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung oder erfordern eine Vormarkierung invasiver Zellen2. Die Integration von Mikroelektronik- und Mikrofluidik-Techniken wird nun entwickelt, um verschiedene Aspekte der Zellbiologie wie Lebensfähigkeit, Bewegung und Befestigung unter Verwendung der elektrischen Impedanz lebender Zellen auf Mikroelektroden 3,4 zu erkennen. Die Impedanzmessung ermöglicht eine markierungsfreie, nicht-invasive und quantitative Beurteilung des Zellstatus3. Hier beschreiben wir ein dreikammeriges Array, das auf dem Design des Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -Systems basiert, das von Abassi et al.5 entwickelt wurde. Das dreikammerige Array ermöglicht die Beurteilung von kokultivierten Zellen auf zelluläre Invasion und die Erholung invasiver Zellen für zusätzliche Analysen oder Expansion.
Im Zellanalysatorsystem dringen Zellen durch eine extrazelluläre Matrix ein, die auf eine poröse Membran aufgetragen ist, und erreichen ein interdigitalisiertes Elektrodenarray, das auf der gegenüberliegenden Seite der Barriere positioniert ist. Da die invasiven Zellen dieses Elektrodenarray im Laufe der Zeit weiter anheften und besetzen, ändert sich die elektrische Impedanz parallel. Das aktuelle System besteht aus einer CIM-Platte (Cell Invasion and Migration) mit zwei Kammern. Das RTCA-DP (Dual Purpose) (fortan Dual Purpose Cell Analyzer genannt) Gerät enthält Sensoren zur Impedanzmessung und integrierte Software zur Analyse und Verarbeitung der Impedanzdaten. Die Impedanzwerte zu Studienbeginn hängen von der Ionenstärke der Medien in den Vertiefungen ab und werden geändert, wenn sich die Zellen an die Elektroden anlagern. Die Impedanzänderungen hängen von der Anzahl der Zellen, ihrer Morphologie und dem Ausmaß ab, in dem sich die Zellen an die Elektroden anheften. Eine Messung der Vertiefungen mit Medien vor der Zugabe der Zellen wird als Hintergrundsignal betrachtet. Der Hintergrund wird von den Impedanzmessungen abgezogen, nachdem das Gleichgewicht erreicht wurde, wobei sich die Zellen an die Elektroden anheften und sich auf sie ausbreiten. Ein einheitsloser Parameter des Status der Zellen auf einer Elektrode namens Cell Index (CI) wird wie folgt berechnet: CI = (Impedanz nach Gleichgewicht – Impedanz in Abwesenheit von Zellen) / Nennimpedanzwert6. Wenn Migrationsraten verschiedener Zelllinien verglichen werden, kann der Delta CI verwendet werden, um den Zellstatus unabhängig von dem Unterschied in der Befestigung zu vergleichen, der in den ersten Messungen dargestellt wird.
Das neu entwickelte dreikammerige Array baut auf dem bestehenden Design auf und verwendet die obere Kammer des Zweizweck-Zellanalysatorsystems, das die Elektroden enthält. Die modifizierten mittleren und unteren Kammern sind so angepasst, dass sie mit der integrierten Software in den Zweizweck-Zellanalysator zur Impedanzmessung und -analyse passen. Die beiden wichtigsten Fortschritte, die das neue Design gegenüber der bestehenden Zweikammer-CIM-Platte (von nun an Zellanalysatorplatte genannt) bietet, sind: i) die Fähigkeit, sich zu erholen und dann invasive Zellsubpopulationen zu analysieren, die in heterogenen Zellmischungen vorhanden sind, und ii) die Option, den Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen auf die Zellinvasion zu bewerten (Abbildung 1).
Diese Technologie kann bei der Untersuchung der Subpopulationen von Zellen mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten nützlich sein. Dazu gehören (a) invasive Krebszellen, die in umliegende Gewebe oder Blut- und Lymphgefäße eindringen oder an metastasierten Aussaatstellen in entfernten Organen extravasieren, (b) Zellen des Immunsystems, die in Gewebe eindringen, um Krankheitserreger oder erkrankte Zellen zu bekämpfen, (c) Endothelzellen, die während der Gewebereorganisation oder Wundheilung in Gewebe eindringen, um neue Blutgefäße zu bilden, sowie (d) Stromazellen aus der Tumormikroumgebung, die zusammen mit Krebszellen unterstützen und eindringen. Der Ansatz ermöglicht die Einbeziehung von stromalem Cross-Talk, das die Zellmotilität und -invasion modulieren kann. Die hier gezeigten Machbarkeitsstudien verwenden dieses modifizierte Array, das sich auf die Invasion von Krebszellen und die Interaktion mit dem Stroma als Modellsystem konzentriert, einschließlich der endothelialen Invasion als Reaktion auf differentielle Signale von Krebszellen. Der Ansatz kann extrapoliert werden, um Krebszellen und andere Zelltypen wie Subpopulationen von Immunzellen, Fibroblasten oder Endothelzellen zu isolieren. Wir haben invasive und nicht-invasive etablierte Brustkrebszelllinien als Proof of Principle getestet. Wir verwendeten auch Zellen aus der Invasion von Patienten-abgeleiteten Xenotransplantaten (PDX) als Reaktion auf Immunzellen aus menschlichem Knochenmark, um die Machbarkeit für den zukünftigen Einsatz auch in klinischen Diagnoseumgebungen zu zeigen. PDX sind Patiententumorgewebe, die in ein immungeschwächtes oder humanisiertes Mäusemodell implantiert werden, um die Untersuchung von Wachstum, Progression und Behandlungsmöglichkeiten für den ursprünglichen Patientenzu ermöglichen 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben das Design eines Zweikammer-Arrays modifiziert, um eine dritte Kammer zur Überwachung der Zellinvasion in Echtzeit in Gegenwart von Stromazellen aufzunehmen. Wir haben deutliche Auswirkungen von kokultivierten Fibroblasten auf invasive und nicht-invasive Krebszellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Array verwendet werden kann, um zwischen Krebszellsubpopulationen zu unterscheiden, die unterschiedlich auf Faktoren reagieren, die von kokultivierten Stromazellen produziert werden. Das Array wurde auch v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, für die Bereitstellung der patientenabgeleiteten Xenotransplantate (HCI-010). Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R01CA205632, R21CA226542 und teilweise durch einen Zuschuss von Agilent Technologies unterstützt.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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