一种从介观尺度到微观尺度的神经元成像组织清除方法
Summary
该协议提供了使用组织清除方法ScaleSF在脑切片中进行神经元成像的详细方法。该方案包括脑组织制备，组织澄清，清除切片的处理以及从介观到微观水平的神经元结构的共聚焦激光扫描显微镜成像。
Abstract
这里提供了一个详细的方案，以可视化脑组织中从介观到微观水平的神经元结构。从神经回路到亚细胞神经元结构的神经元结构在用ScaleSF光学清除的小鼠脑切片中可视化。这种清除方法是ScaleS的改进版本，是一种用于组织切片的亲水性组织清除方法，可实现强大的清除能力以及高水平的荧光信号保存和结构完整性。可定制的三维（3D）打印成像室设计用于可靠地安装已清除的脑组织。注射携带增强绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体的小鼠大脑用4%多聚甲醛固定，并用振动组织切片机切成1-mm厚的切片。通过遵循清除方案清除脑切片，其中包括在三种溶液中的顺序孵育，即ScaleS0溶液，磷酸盐缓冲盐水（-）和ScaleS4溶液，共10.5-14.5小时。将清除的脑切片安装在成像室上，并嵌入溶解在ScaleS4D25（0）溶液中的1.5%琼脂糖凝胶中。切片的3D图像采集是使用共聚焦激光扫描显微镜进行的，该显微镜配备了长工作距离的多浸入物镜。从介观神经元成像开始，我们成功地在光学清除的脑切片中可视化精细的亚细胞神经元结构，如树突状棘和轴突。该协议将有助于理解从电路到亚细胞组分尺度的神经元结构。
Introduction
组织清除方法改进了光学显微镜对生物和临床样品的深度无关成像，允许提取完整组织的结构信息1，2。光学清除技术也可能潜在地加快速度，并降低组织学分析的成本。目前，有三种主要的清除方法可用：亲水，疏水和基于水凝胶的方法1，2。亲水方法在保持荧光信号和组织完整性方面超越了，并且与其他两种方法相比毒性更小3，4。
亲水性清除方法ScaleS以其保持结构和分子完整性以及强大的清除能力（清除 – 保存光谱）而具有独特的地位。在之前的一项研究中，我们通过修改ScaleS6的清除程序，为组织切片（〜1mm厚度）开发了一种快速等距清除方案ScaleSF。这种清除方案需要在三种溶液中连续孵育10.5-14.5小时的脑切片。该方法具有高清除保存光谱的特点，甚至与电子显微镜（EM）分析兼容（补充图1），允许多尺度高分辨率三维（3D）成像和准确的信号重建6。因此，ScaleSF应该有效，特别是在大脑中，神经元细胞精心设计了巨大的繁荣过程，并安排了用于传输和接收信息的专用精细亚细胞结构。从神经元细胞的回路到亚细胞水平提取具有尺度的结构信息对于更好地理解大脑功能非常有用。
在这里，我们提供了一个详细的方案，使用ScaleSF可视化神经元结构，其尺度从介观/电路到微观/亚细胞水平。该方案包括组织制备、组织澄清、清除组织的处理以及已清除组织的共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 成像。我们的实验方案侧重于询问从电路到亚细胞组分量表的神经元结构。有关制备溶液和将腺相关病毒（AAV）载体注射到小鼠大脑中的详细程序，请分别参考Miyawaki等人20167 和Okamoto et al. 20218。
Protocol
Representative Results
Discussion
协议中的关键步骤
协议中有一些关键步骤应该非常谨慎地进行，以获得有意义的结果。样品的均匀固定对于大规模组织内的3D成像至关重要。物镜、样品和浸入液应具有匹配的 RI。它们之间的RI不匹配将导致清除的脑切片内表达EGFP的细胞的高度干扰成像（图3）。物镜对浸入液的校正环调整可最大限度地减少深度引起的球面像差，从而最大限度地提高3D成像中的信号、对…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢横子（顺天堂大学）的AAV载体生产以及Kisara Hoshino（顺天堂大学）的技术援助。本研究得到了JSPS KAKENHI（JP20K07231至K.Y.;JP21H03529 转 T.F.;JP20K07743 转 M.K.;JP21H02592 转 H.H.）和创新领域“共振生物”的科学研究（JP18H04743至H.H.）。本研究还得到了日本医学研究开发厅（AMED）（JP21dm0207112至T.F.和H.H.）、日本科学技术振兴机构（JST）的登月研发（JPMJMS2024至H.H.）、JST的颠覆性科学与技术聚变导向研究（FOREST）（JPMJFR204D至H.H.）、顺天堂大学医学院老年疾病研究所的助学金（X2016至K.Y.;X2001至H.H.），以及私立学校品牌项目。
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
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