Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas
Summary
El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.
Abstract
Aquí se proporciona un protocolo detallado para visualizar las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos en los tejidos cerebrales. Las estructuras neuronales que van desde los circuitos neuronales hasta las estructuras neuronales subcelulares se visualizan en rodajas cerebrales de ratón limpiadas ópticamente con ScaleSF. Este método de limpieza es una versión modificada de ScaleS y es un método de limpieza de tejido hidrófilo para rodajas de tejido que logra una potente capacidad de limpieza, así como un alto nivel de preservación de las señales de fluorescencia y la integridad estructural. Una cámara de imágenes tridimensional (3D) personalizable está diseñada para un montaje confiable de tejidos cerebrales despejados. Los cerebros de ratón inyectados con un vector de virus adenoasociado que transportaba un gen de proteína fluorescente verde mejorado se fijaron con paraformaldehído al 4% y se cortaron en rodajas de 1 mm de espesor con una cortadora de tejido vibrante. Las rebanadas cerebrales se eliminaron siguiendo el protocolo de limpieza, que incluye incubaciones secuenciales en tres soluciones, a saber, solución ScaleS0, solución salina tampón de fosfato (–) y solución ScaleS4, para un total de 10.5-14.5 h. Las rodajas cerebrales despejadas se montaron en la cámara de imágenes y se incrustaron en gel de agarosa al 1,5% disuelto en la solución ScaleS4D25 (0). La adquisición de imágenes 3D de las rodajas se llevó a cabo utilizando un microscopio de barrido láser confocal equipado con una lente de objetivo de inmersión múltiple de una larga distancia de trabajo. Comenzando con imágenes neuronales mesoscópicas, logramos visualizar estructuras neuronales subcelulares finas, como espinas dendríticas y boutons axonales, en las rebanadas cerebrales ópticamente despejadas. Este protocolo facilitaría la comprensión de las estructuras neuronales desde el circuito hasta las escalas de componentes subcelulares.
Introduction
Los métodos de limpieza de tejidos han mejorado la obtención de imágenes independientes de la profundidad de muestras biológicas y clínicas con microscopía de luz, lo que permite extraer información estructural sobre tejidos intactos 1,2. Las técnicas de limpieza óptica también podrían acelerar y reducir el costo del análisis histológico. Actualmente, hay tres enfoques principales de limpieza disponibles: métodos hidrófilos, hidrófobos y basados en hidrogel 1,2. Los enfoques hidrófilos superan en la preservación de las señales de fluorescencia y la integridad de los tejidos y son menos tóxicos en comparación con los otros dos enfoques 3,4.
Un método de limpieza hidrofílica, ScaleS, ocupa una posición distintiva con su preservación de la integridad estructural y molecular, así como una potente capacidad de limpieza (espectro de limpieza-preservación)5. En un estudio anterior, desarrollamos un protocolo de limpieza rápido e isométrico, ScaleSF, para rodajas de tejido (~ 1 mm de espesor) modificando el procedimiento de limpieza de ScaleS6. Este protocolo de limpieza requiere incubaciones secuenciales de cortes cerebrales en tres soluciones durante 10.5-14.5 h. El método se presenta con un alto espectro de limpieza y preservación, que es compatible incluso con el análisis de microscopía electrónica (EM) (Figura suplementaria 1), lo que permite obtener imágenes tridimensionales (3D) de alta resolución a múltiples escalas con reconstrucción precisa de la señal6. Por lo tanto, ScaleSF debe ser eficaz especialmente en el cerebro, donde las células neuronales elaboran procesos exuberantes de tremenda longitud, y organizan estructuras subcelulares finas especializadas para transmitir y recibir información. La extracción de información estructural con escalas desde el circuito hasta los niveles subcelulares en las células neuronales es bastante útil para una mejor comprensión de las funciones cerebrales.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para visualizar estructuras neuronales con escalas desde el nivel mesoscópico / circuito hasta el nivel microscópico / subcelular utilizando ScaleSF. El protocolo incluye la preparación de tejidos, la clarificación de tejidos, el manejo de tejidos despejados y la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) de tejidos despejados. Nuestro protocolo se centra en interrogar estructuras neuronales desde el circuito hasta las escalas de componentes subcelulares. Para obtener un procedimiento detallado para la preparación de las soluciones y la inyección estereotáxica de vectores de virus adenoasociados (AAV) en cerebros de ratón, consulte Miyawaki et al. 20167 y Okamoto et al. 20218, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo
Hay algunos pasos críticos en el protocolo que deben llevarse a cabo con la máxima precaución para obtener resultados significativos. La fijación uniforme de muestras es imprescindible para la obtención de imágenes 3D dentro de tejidos a gran escala. La lente del objetivo, la muestra y el fluido de inmersión deben tener ri correspondiente. El desajuste de RI entre ellos conducirá a imágenes altamente perturbadas de las células que expresan EGFP dentro de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Yoko Ishida (Universidad de Juntendo) por la producción de vectores AAV y a Kisara Hoshino (Universidad de Juntendo) por la asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI (JP20K07231 a K.Y.; JP21H03529 a T.F.; JP20K07743 a M.K.; JP21H02592 a S.S.) e Investigación Científica en el Área Innovadora “Resonancia Bio” (JP18H04743 a H.H.). Este estudio también fue apoyado por la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED) (JP21dm0207112 a T.F. y H.H.), Moonshot R&D de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST) (JPMJMS2024 a H.H.), Investigación Orientada a la Fusión para Ciencia y Tecnología disruptiva (FOREST) de JST (JPMJFR204D a H.H.), Becas en Ayuda del Instituto de Investigación para Enfermedades de la Vejez en la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (X2016 a K.Y.; X2001 a H.H.), y el Private School Branding Project.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
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