メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法
Summary
プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。
Abstract
ここでは、脳組織のメゾスコピックレベルからミクロレベルまでのニューロン構造を視覚化するための詳細なプロトコルが提供されています。神経回路から細胞内ニューロン構造に至るまでのニューロン構造は、ScaleSFで光学的にクリアされたマウス脳スライスにおいて視覚化される。この透明化方法は、ScaleSの修正版であり、強力な透明化能力ならびに蛍光シグナルの高レベルの保存および構造的完全性を達成する組織スライスのための親水性組織透明化方法である。カスタマイズ可能な3次元(3D)プリントイメージングチャンバは、クリアされた脳組織を確実に取り付けるように設計されています。増強された緑色蛍光タンパク質遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターを注入したマウス脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、振動組織スライサーで1mm厚のスライスに切断した。脳スライスは、3つの溶液、すなわちScaleS0溶液、リン酸緩衝液生理食塩水(-)、およびScaleS4溶液中で合計10.5〜14.5時間逐次インキュベーションを含むクリアリングプロトコルに従ってクリアされた。クリアした脳スライスをイメージングチャンバーにマウントし、ScaleS4D25(0)溶液に溶解した1.5%アガロースゲルに埋め込んだ。スライスの3D画像取得を、長い作動距離の多液浸対物レンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行った。メゾスコピックニューロンイメージングから始まり、樹状突起スパインや軸索ブートンなどの微細な細胞内ニューロン構造を光学的にクリアした脳スライスに可視化することに成功しました。このプロトコルは、回路から細胞内成分スケールまでのニューロン構造の理解を容易にするであろう。
Introduction
組織透明化法は、光学顕微鏡による生物学的および臨床的サンプルの深さに依存しないイメージングを改善し、無傷の組織上の構造情報の抽出を可能にした1,2。光学的クリアリング技術は、潜在的にスピードアップし、組織学的分析のコストを削減する可能性があります。現在、3つの主要なクリアリングアプローチが利用可能である:親水性、疎水性、およびヒドロゲルベースの方法1,2。親水性アプローチは、蛍光シグナルおよび組織の完全性を維持する上で凌駕し、他の2つのアプローチと比較して毒性が低い3、4。
親水性透明化法であるScaleSは、構造的および分子的完全性の保持と強力な透明化能力(透明化保存スペクトル)により、独特の地位を占めています5。以前の研究では、Sca l eS6の透明化手順を変更することによって、組織スライス(〜1mm厚)に対する迅速で等尺性透明化プロトコルScaleSFを開発しました。このクリアリングプロトコルは、10.5〜14.5時間の間、3つの溶液中で脳スライスのシーケンシャルインキュベーションを必要とする。電子顕微鏡(EM)分析(補足図1)にも対応可能な高透明保存スペクトルを特長とし、正確な信号再構成によるマルチスケールの高分解能3次元(3D)イメージングが可能6.したがって、ScaleSFは、特に神経細胞が途方もない長さの熱狂的なプロセスを精巧にし、情報を送受信するための特殊な微細な細胞下構造を配置する脳において有効であるはずである。神経細胞の回路レベルから細胞内レベルまでのスケールで構造情報を抽出することは、脳機能の理解を深めるために非常に有用です。
ここでは、ScaleSFを用いて、中視/回路から微視/細胞内レベルまでのスケールでニューロン構造を視覚化するための詳細なプロトコルを提供します。プロトコールには、組織調製、組織清澄化、透明化組織の取り扱い、および清澄組織における共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)イメージングが含まれる。私たちのプロトコルは、回路から細胞内成分スケールまでのニューロン構造を調べることに焦点を当てています。マウス脳へのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの溶液の調製および定位注射のための詳細な手順については、それぞれMiyawaki et al. 20167 およびOkamoto et al. 20218を参照されたい。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップ
プロトコルには、意味のある結果を得るために細心の注意を払って実行する必要があるいくつかの重要なステップがあります。サンプルの均一な固定は、大規模組織内の3Dイメージングに不可欠です。対物レンズ、サンプル、および液浸液は、RI と一致する必要があります。それらの間のRIミスマッチは、クリアされた脳スライス内のEGFP発現細?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、AAVベクター作製に石田洋子(順天堂大学)と技術支援を寄せた星野喜晃氏(順天堂大学)に感謝の意を表した。本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金(JP20K07231 to K.Y.;JP21H03529 から T.F. まで;JP20K07743 から M.K.;JP21H02592 から H.H.)革新的領域「共鳴バイオ」に関する科学的研究(JP18H04743からH.H.へ)。本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)(JP21dm0207112 to T.F.およびH.H.)、科学技術振興機構(JST)のMoonshot R&D(JPMJMS2024 to H.H.)、JSTのFusion Oriented Research for Disruptive Science and Technology(FOREST)(JPMJFR204D to H.H.)、順天堂大学医学部老年期疾病研究所の助成金(X2016 to K.Y.;X2001 to H.H.)、および私立学校ブランディングプロジェクト。
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
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