중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법
Summary
이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.
Abstract
중강경에서 뇌 조직의 현미경 수준에 이르기까지 신경 구조를 시각화하기 위해 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 신경 회로에서 세포 하부 신경 구조에 이르기까지 뉴런 구조는 ScaleSF로 광학적으로 클리어 된 마우스 뇌 조각에서 시각화됩니다. 이 클리어링 방법은 ScaleS의 변형 된 버전이며 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 형광 신호의 높은 수준의 보존 및 구조적 무결성을 달성하는 조직 슬라이스에 대한 친수성 조직 제거 방법입니다. 사용자 정의 가능한 3차원(3D) 인쇄 이미징 챔버는 클리어된 뇌 조직의 안정적인 장착을 위해 설계되었습니다. 강화된 녹색 형광 단백질 유전자를 운반하는 아데노 관련 바이러스 벡터를 주입한 마우스 뇌를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 진동 조직 슬라이서로 1-mm 두께의 조각으로 절단하였다. 뇌 조각은 세 가지 용액, 즉 Sca l eS0 용액, 인산염 완충 식염수 (-) 및 ScaleS4 용액에서 순차적 인 배양을 포함하는 클리어링 프로토콜에 따라 총10.5-14.5 h의 클리어링 프로토콜에 따라 제거되었습니다. 클리어된 뇌 조각을 이미징 챔버에 장착하고 ScaleS4D25(0) 용액에 용해된 1.5% 아가로스 겔에 매립하였다. 슬라이스의 3D 이미지 획득은 긴 작동 거리의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 중강경 신경 영상으로 시작하여, 우리는 수지상 척추 및 축삭돌과 같은 미세한 세포 하부 신경 구조를 광학적으로 지워진 뇌 조각에서 시각화하는 데 성공했습니다. 이 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조의 이해를 용이하게합니다.
Introduction
조직 제거 방법은 광 현미경으로 생물학적 및 임상 샘플의 깊이 독립적 인 이미징을 개선하여 손상되지 않은 조직 1,2에 대한 구조 정보를 추출 할 수 있습니다. 광학 클리어링 기술은 잠재적으로 속도를 높이고 조직학적 분석 비용을 절감할 수 있습니다. 현재 세 가지 주요 클리어링 접근법이 있습니다 : 친수성, 소수성 및 하이드로 겔 기반 방법 1,2. 친수성 접근법은 형광 신호 및 조직 완전성을 보존하는 데 있어 능가하며, 다른 두 접근법(3,4)에 비해 독성이 적다.
친수성 클리어링 방법인 ScaleS는 구조적 및 분자 무결성의 보존과 강력한 클리어링 능력(클리어링-보존 스펙트럼)5으로 독특한 위치를 차지하고 있습니다. 이전 연구에서, 우리는 Sca l eS6의 클리어링 절차를 수정하여 조직 슬라이스 (~ 1-mm 두께)에 대한 신속하고 등각 클리어링 프로토콜 인 ScaleSF를 개발했습니다. 이 클리어링 프로토콜은 10.5-14.5 시간 동안 세 가지 솔루션으로 뇌 조각을 순차적으로 배양해야합니다. 이 방법은 전자 현미경 (EM) 분석 (보충 그림 1)과도 호환되는 높은 클리어링 보존 스펙트럼을 특징으로하므로 정확한 신호 재구성6을 갖춘 멀티 스케일 고해상도 3D (3D) 이미징이 가능합니다. 따라서 ScaleSF는 특히 신경 세포가 엄청난 길이의 풍부한 과정을 정교하게하고 정보를 전달하고 수신하기위한 전문화 된 미세한 세포 하부 구조를 배열하는 뇌에서 효과적이어야합니다. 신경 세포의 회로에서 세포 하위 수준까지 비늘로 구조 정보를 추출하는 것은 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 매우 유용합니다.
여기에서는 ScaleSF를 사용하여 중시경 / 회로에서 현미경 / 세포 수준까지의 스케일로 신경 구조를 시각화하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 조직 준비, 조직 정화, 클리어 된 조직의 취급 및 클리어 된 조직의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 이미징이 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조를 심문하는 데 중점을 둡니다. 용액의 제조를 위한 상세한 절차와 마우스 뇌에 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 입체택시 주사를 위한 상세한 절차는 각각 Miyawaki et al. 20167 및 Okamoto et al. 20218을 참조한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내의 중요한 단계
프로토콜에는 의미 있는 결과를 얻기 위해 최대한의 주의를 기울여 수행해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플의 균일 한 고정은 대규모 조직 내에서 3D 이미징을 위해 필수적입니다. 대물 렌즈, 샘플 및 침지 유체는 일치하는 RI를 가져야합니다. 이들 사이의 RI-불일치는 제거된 뇌 절편 내에서 EGFP 발현 세포의 고도로 교란된 영상화로 이어질 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 AAV 벡터 제작을 위한 이시다 요코(준텐도 대학)와 기술 지원을 위해 호시노 키사라(준텐도 대학)에게 감사를 표한다. 본 연구는 JSPS KAKENHI (JP20K07231 내지 K.Y.; JP21H03529 내지 T.F.; JP20K07743 내지 M.K.; JP21H02592 내지 H.H.) 혁신 영역 “공명 바이오”에 대한 과학 연구 (JP18H04743 ~ H.H.). 이 연구는 또한 일본 의학 연구 개발청 (AMED) (JP21dm0207112 ~ T.F. 및 H.H.), 일본 과학 기술국 (JST)의 Moonshot R & D (JPMJMS2024 ~ H.H.), JST (JPMJFR204D에서 H.H.까지)의 파괴적인 과학 기술을위한 융합 지향 연구 (FOREST), 중텐도 대학 의과 대학 의과 대학 노년기 질환 연구소 (X2016 ~ K.Y.; X2001 to H.H.), 그리고 사립 학교 브랜딩 프로젝트.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
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