Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche
Summary
Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l’imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.
Abstract
Qui viene fornito un protocollo dettagliato per visualizzare le strutture neuronali dai livelli mesoscopici a quelli microscopici nei tessuti cerebrali. Le strutture neuronali che vanno dai circuiti neurali alle strutture neuronali subcellulari sono visualizzate in fette di cervello di topo otticamente cancellate con ScaleSF. Questo metodo di compensazione è una versione modificata di ScaleS ed è un metodo di compensazione del tessuto idrofilo per fette di tessuto che raggiunge una potente capacità di compensazione e un alto livello di conservazione dei segnali di fluorescenza e integrità strutturale. Una camera di imaging tridimensionale (3D) personalizzabile è progettata per il montaggio affidabile di tessuti cerebrali eliminati. I cervelli di topo iniettati con un vettore virale adeno-associato che trasporta un gene proteico fluorescente verde potenziato sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e tagliati in fette di spessore di 1 mm con un’affettatrice di tessuto vibrante. Le fette di cervello sono state eliminate seguendo il protocollo di compensazione, che include incubazioni sequenziali in tre soluzioni, vale a dire, soluzione ScaleS0, soluzione salina tampone fosfato (–) e soluzione ScaleS4, per un totale di 10,5-14,5 ore. Le fette di cervello eliminate sono state montate sulla camera di imaging e incorporate in gel di agarosio all’1,5% disciolto nella soluzione ScaleS4D25(0). L’acquisizione dell’immagine 3D delle fette è stata effettuata utilizzando un microscopio a scansione laser confocale dotato di una lente obiettivo multi-immersione di una lunga distanza di lavoro. Iniziando con l’imaging neuronale mesoscopico, siamo riusciti a visualizzare le strutture neuronali subcellulari fini, come le spine dendritiche e i bouton assonali, nelle fette di cervello otticamente cancellate. Questo protocollo faciliterebbe la comprensione delle strutture neuronali dalle scale dei circuiti ai componenti subcellulari.
Introduction
I metodi di compensazione dei tessuti hanno migliorato l’imaging indipendente dalla profondità di campioni biologici e clinici con microscopia ottica, consentendo l’estrazione di informazioni strutturali su tessuti intatti 1,2. Le tecniche di compensazione ottica potrebbero anche potenzialmente accelerare e ridurre i costi per l’analisi istologica. Attualmente, sono disponibili tre principali approcci di compensazione: metodi idrofili, idrofobici e a base di idrogel 1,2. Gli approcci idrofili superano nel preservare i segnali di fluorescenza e l’integrità dei tessuti e sono meno tossici rispetto agli altri due approcci 3,4.
Un metodo di compensazione idrofila, ScaleS, occupa una posizione distintiva per la sua conservazione dell’integrità strutturale e molecolare e per la potente capacità di compensazione (spettro di compensazione-conservazione)5. In uno studio precedente, abbiamo sviluppato un protocollo di compensazione rapida e isometrica, ScaleSF, per fette di tessuto (~ 1 mm di spessore) modificando la procedura di compensazione di ScaleS6. Questo protocollo di compensazione richiede incubazioni sequenziali di fette di cervello in tre soluzioni per 10,5-14,5 ore. Il metodo è caratterizzato da un elevato spettro di conservazione della compensazione, che è compatibile anche con l’analisi al microscopio elettronico (EM) (Figura supplementare 1), consentendo l’imaging tridimensionale (3D) ad alta risoluzione su più scale con un’accurata ricostruzione del segnale6. Pertanto, ScaleSF dovrebbe essere efficace soprattutto nel cervello, dove le cellule neuronali elaborano processi esuberanti di lunghezza enorme e organizzano strutture subcellulari fini specializzate per trasmettere e ricevere informazioni. Estrarre informazioni strutturali con scale dal circuito ai livelli subcellulari sulle cellule neuronali è molto utile per una migliore comprensione delle funzioni cerebrali.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per visualizzare le strutture neuronali con scale dal mesoscopico / circuito al livello microscopico / subcellulare utilizzando ScaleSF. Il protocollo include la preparazione dei tessuti, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione dei tessuti eliminati e l’imaging al microscopio a scansione laser confocale (CLSM) dei tessuti cancellati. Il nostro protocollo si concentra sull’interrogazione delle strutture neuronali dalle scale dei circuiti ai componenti subcellulari. Per una procedura dettagliata per la preparazione delle soluzioni e l’iniezione stereotassica di vettori di virus adeno-associati (AAV) nel cervello dei topi, fare riferimento rispettivamente a Miyawaki et al. 20167 e Okamoto et al. 20218.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici all’interno del protocollo
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che dovrebbero essere condotti con la massima cautela per ottenere risultati significativi. La fissazione uniforme dei campioni è indispensabile per l’imaging 3D all’interno di tessuti su larga scala. La lente dell’obiettivo, il campione e il fluido di immersione devono avere RI corrispondente. La mancata corrispondenza ri tra loro porterà a un’imaging altamente disturbato delle cellule che esprimono EGFP all’…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Yoko Ishida (Juntendo University) per la produzione di vettori AAV e Kisara Hoshino (Juntendo University) per l’assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 a T.F.; JP20K07743 a M.K.; JP21H02592 a H.H.) e Ricerca Scientifica sull’Area Innovativa “Risonanza Bio” (jp18H04743 a H.H.). Questo studio è stato supportato anche dall’Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED) (JP21dm0207112 a T.F. e H.H.), Moonshot R& D della Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 a H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) da JST (JPMJFR204D a H.H.), Grants-in-Aid dall’Istituto di ricerca per le malattie della vecchiaia presso la Juntendo University School of Medicine (X2016 a K.Y.; X2001 a H.H.), e il Private School Branding Project.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
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