Summary
Этот протокол описывает выделение преадипоцитов мыши из подкожно-жировой клетчатки, их дифференцировку в зрелые адипоциты и индукцию резистентности к инсулину. Действие инсулина оценивается по фосфорилированию/активации членов сигнального пути инсулина через вестерн-блоттинг. Этот метод позволяет напрямую определять резистентность/чувствительность к инсулину в первичных адипоцитах.
Abstract
Резистентность к инсулину - это сниженное влияние инсулина на клетки-мишени, обычно возникающее из-за снижения передачи сигналов рецептора инсулина. Инсулинорезистентность способствует развитию диабета 2 типа (СД2) и других заболеваний, связанных с ожирением, которые широко распространены во всем мире. Поэтому понимание механизмов, лежащих в основе резистентности к инсулину, имеет большое значение. Несколько моделей были использованы для изучения резистентности к инсулину как in vivo, так и in vitro; Первичные адипоциты представляют собой привлекательный вариант для изучения механизмов инсулинорезистентности и идентификации молекул, которые противодействуют этому состоянию, и молекулярных мишеней инсулин-сенсибилизирующих препаратов. Здесь мы создали модель резистентности к инсулину с использованием первичных адипоцитов в культуре, обработанной фактором некроза опухоли-α (TNF-α).
Клетки-предшественники адипоцитов (APC), выделенные из подкожной жировой ткани мыши, переваренной коллагеназой, с помощью технологии магнитного разделения клеток, дифференцируются в первичные адипоциты. Резистентность к инсулину затем индуцируется лечением TNF-α, провоспалительным цитокином, который снижает фосфорилирование/активацию тирозина членов сигнального каскада инсулина. Снижение фосфорилирования рецептора инсулина (IR), субстрата рецептора инсулина (IRS-1) и протеинкиназы B (AKT) количественно определяется вестерн-блоттингом. Этот метод является отличным инструментом для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в жировой ткани.
Introduction
Инсулин является анаболическим гормоном, вырабатываемым островковыми β клетками поджелудочной железы, и ключевым регулятором метаболизма глюкозы и липидов. Среди своих многочисленных функций инсулин регулирует поглощение глюкозы, синтез гликогена, глюконеогенез, синтез белка, липогенез и липолиз1. Начальным молекулярным сигналом после взаимодействия инсулина с его рецептором (IR) является активация внутренней активности тирозинпротеинкиназы IR2, что приводит к его аутофосфорилированию3 и последующей активации семейства белков, известных как субстраты рецепторов инсулина (IRS), которое связывается с адапторными белками, что приводит к активации каскада протеинкиназ4 . Инсулин активирует два основных сигнальных пути: фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K)-протеинкиназу B (AKT) и Ras-митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK). Первый представляет собой основную точку ветвления или узел 4,5 для активации многочисленных нижестоящих эффекторов, участвующих в различных физиологических функциях, включая регуляцию топливного гомеостаза, тогда как второй регулирует рост и дифференцировку клеток 4,6. Действие инсулина в конечном итоге зависит от типа клеток и физиологического контекста7.
Одной из основных чувствительных к инсулину метаболических тканей является жировая ткань. Белая жировая ткань является наиболее распространенным типом жира у людей и грызунов, распределенным в подкожном жире (между кожей и мышцами) и висцеральном жире (вокруг органов в брюшной полости). Учитывая их большой объем, адипоциты или жировые клетки являются наиболее распространенным типом клеток в жировой ткани. Эти жировые клетки могут быть коричневыми/бежевыми (термогенными), розовыми (в молочной железе) и белыми 8,9. Белые адипоциты сохраняют основные запасы энергии в организме в виде триглицеридов, инсулинозависимого процесса. Инсулин способствует транспорту глюкозы и липогенезу, в то время как он ингибирует липолиз или расщепление липидов 7,10. Он также облегчает дифференцировку преадипоцитов в адипоциты — зрелые жирозапасающие клетки11.
Резистентность к инсулину возникает, когда нормальный уровень инсулина вызывает ослабленную биологическую реакцию, что приводит к компенсаторной гиперинсулинемии12. Инсулинорезистентность — это состояние, связанное с избыточным весом иожирением5, которое в сочетании приводит к диабету 2 типа (СД2) и другим метаболическим заболеваниям13. Гиперинсулинемия компенсирует резистентность к инсулину в периферических тканях для поддержания нормального уровня глюкозы в крови14. Однако возможная потеря или истощение β-клеток вместе с обострением резистентности к инсулину приводит к повышению уровня глюкозы в крови, соответствующегоСД2 5. Таким образом, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия могут способствовать развитию метаболических заболеваний, связанных с ожирением15. Кроме того, ожирение может вызывать хроническое местное воспаление низкой степени, способствующее резистентности к инсулину в жировой ткани15,16,17. Кроме того, изменения в жировой ткани, вызванные ожирением, такие как фиброз, воспаление и снижение ангиогенеза и адипогенеза, приводят к снижению уровня адипонектина в сыворотке крови (сенсибилизатора инсулина) и повышенной секреции таких факторов, как ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1), свободные жирные кислоты и экзосомы в кровоток, усугубляя резистентность к инсулину17.
Многие аспекты, лежащие в основе резистентности к инсулину, остаются неизвестными. Были разработаны модели in vitro и in vivo для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в основных тканях-мишенях, включая жировую ткань. Преимущество моделей in vitro заключается в том, что исследователи лучше контролируют условия окружающей среды и могут оценить резистентность к инсулину в определенных типах клеток. В частности, клетки-предшественники адипоцитов (APC) имеют индивидуальный фенотип донорской ткани, который может отражать физиологию лучше, чем клеточные линии адипоцитов. Основным фактором, индуцирующим резистентность к инсулину in vitro, является фактор некроза опухоли-α (TNF-α). TNF-α представляет собой провоспалительный цитокин, секретируемый адипоцитами и макрофагами в жировой ткани18. Несмотря на то, что он необходим для правильного ремоделирования и расширения жировой ткани19, длительное воздействие ФНО-α вызывает резистентность к инсулину в жировой ткани in vivo и в адипоцитах in vitro20. Хроническое лечение TNF-α нескольких типов клеток приводит к увеличению фосфорилирования серина как IR, так и IRS-1, тем самым способствуя снижению фосфорилирования тирозина21. Повышенное фосфорилирование IRS-1 на остатках серина ингибирует активность IR-тирозинкиназы и может быть одним из ключевых механизмов, с помощью которых лечение хроническим TNF-α ухудшает действие инсулина22,23. TNF-α активирует пути с участием ингибитора серин/треонинкиназы ядерного фактора ĸB киназы β (IKKβ) и концевой киназы c-Jun N (JNK)24. JNK индуцирует сложную провоспалительную транскрипционную программу, но также непосредственно фосфорилирует IRS-16.
Понимание патогенеза резистентности к инсулину становится все более важным для разработки будущих методов лечения СД2. APC оказались отличной моделью для изучения биологии жировых клеток, включая чувствительность и резистентность к инсулину, а также для выявления внутренних свойств адипоцитов независимо от системной среды. APC могут быть легко получены из различных жировых депо и при соответствующих условиях дифференцированы в зрелые адипоциты. С помощью этого метода можно оценить прямое влияние на резистентность/чувствительность к инсулину в адипоцитах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на грызунах были одобрены Комитетом по биоэтике Института нейробиологии УНАМ, протокол No 075.
1. Выделение клеток-предшественников адипоцитов мыши
- Усыпить 8-10-недельных самцов мышей C57BL/6 (например, путем вдыхания CO2 и последующего вывиха шейки матки) (четыре животных на изоляцию). Продезинфицируйте мышей, протирая их 70% этанолом, и получите жировую ткань сразу после жертвоприношения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После эвтаназии грызунов немедленно изолируйте жировую ткань и выполните все действия в стерильном ламинарном колпаке. Мыши содержатся в течение 12 часов светлых/темных циклов со свободным доступом к пище и воде. - Рассекают паховую подкожную жировую клетчатку у каждой мыши. Удалите только жировую ткань, избегая удаления мышц, кожи или любой другой ткани, и соберите ее в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 15 мл раствора коллагеназы типа 1 (1,5 мг / мл) на льду. Растворите коллагеназу 1-го типа в модифицированной среде Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) Dulbecco и отфильтруйте через шприцевые фильтры 0,2 мкм.
- Стерильными хирургическими ножницами разрежьте жировую ткань на мелкие кусочки и переварите образцы путем инкубации с раствором коллагеназы типа 1 при 37 ° C в орбитальном шейкере (150 об/мин) в течение 30 мин (поместите пробирку, содержащую жир и коллагеназу, в горизонтальное положение для большей поверхности встряхивания). Проверяйте пищеварение каждые 10 минут, чтобы убедиться, что оно работает (видна деградация тканей) и предотвратить чрезмерное переваривание (см. Дополнительный рисунок S1).
- Фильтруйте с помощью шприца с сеткой 200 мкм (предварительно автоклавированного) для удаления ткани, не переваренной коллагеназой. Пропустите фильтр через край трубки, чтобы слить как можно больше ячеек в раствор. Добавьте 15 мл холодного ДМЭМ-1% БСА, чтобы остановить пищеварение, и центрифугу при 400 × г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Аспирировать верхний слой, содержащий зрелые адипоциты и большую часть жидкого слоя; Не прикасайтесь к гранулам и не беспокойте их. Добавьте 20 мл солевого буфера с холодным фосфатом (PBS)-2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и ресуспендируйте гранулы. Центрифуга при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость, аспирируя сначала верхний слой, чтобы устранить оставшиеся адипоциты и жир. Ресуспендировать гранулу в 1 мл лизирующего буфера хлорида аммония калия (ACK) (для лизиса эритроцитов) и инкубировать на льду в течение 5 мин. Добавьте 10 мл PBS-2% FBS, перемешайте и центрифугируйте при 400 × г в течение 5 мин при 4 ° C.
- Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 200 мкл раствора анти-Fc (очищенный крысиный антимышиный CD16/CD32, разведенный в PBS-2% FBS [1:150]) для уменьшения опосредованного Fc-рецептором связывания интересующими антителами. Инкубировать на льду 5 мин. Перенесите суспензию ячейки в пробирку объемом 5 мл, которая помещается в предварительно охлажденные стойки магнитного сепаратора и центрифуги при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалить надосадочную жидкость, добавить 200 мкл смеси моноклонального антитела CD31 (PECAM-1) (390)-биотина (1:100) и моноклонального антитела CD45 (30-F11)-биотина (1:100), хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 15 мин (приготовить разведения антител в растворе анти-Fc; см. Таблицу 1). Добавьте 400 мкл PBS-2% FBS и центрифугу при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: CD31 и CD45 являются маркерами эндотелиальных клеток и гемопоэтических клеток соответственно. - Аспирировать надосадочную жидкость и инкубировать в 100 мкл микрогранул антибиотина (1:5) в течение 15 мин на льду (готовят разведения антител в растворе анти-Fc, см. Таблицу 1). Добавьте 400 мкл PBS-2% FBS и центрифугу при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 350 мкл PBS-2% FBS. Удалите клеточные агрегаты или крупные частицы из одноячеистых суспензий с помощью фильтра предварительного разделения (70 мкм). Сначала активируйте фильтр 100 мкл PBS-2% FBS, пропустите суспензию ячейки через фильтр (соберите в чистую пробирку) и, наконец, промойте фильтр 100 мкл PBS-2% FBS.
- Выполняйте магнитную сепарацию ячеек, используя стратегию отрицательной сепарации с магнитным сепаратором ячеек.
- Поместите образец в положение A холодильной стойки (убедитесь, что стойка предварительно охлаждена) и две пустые пробирки в положение B и C для извлечения немеченых и меченых ячеек соответственно.
- Перед включением оборудования загрузите моющий буфер и проточный буфер в соответствующие бутылки. Запрограммируйте оборудование на выполнение магнитной сепарации ячеек по протоколу DEPLETE .
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для истощения в стандартном режиме для удаления клеток с нормальной экспрессией антигена (в данном случае клеток, меченных анти-CD31 и анти-CD45), если восстановление является наивысшим приоритетом. - В разделе разделения выберите количество образцов для разделения и выберите протокол DEPLETE. Нажмите «Выполнить» и начните разделение. В конце программы восстанавливают немеченые клетки и центрифугу при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл питательной среды (таблица 1).
- Засейте APC в одну лунку 12-луночной пластины, предварительно покрытой 2,5% матриксом базальной мембраны (получается примерно 50 000-75 000 клеток). Добавьте 400 мкл 2,5% матрицы базальной мембраны, чтобы покрыть всю поверхность каждой лунки. Сразу после удаления излишков раствора и оставления лишь небольшого слоя дайте пластине высохнуть (без крышки) внутри вытяжки ламинарного потока не менее 1 ч. Инкубировать при 37 °C в атмосфере 5% CO2 . Меняйте среду каждые 48 ч, пока клетки не достигнут 80% слияния.
- При слиянии 80% полностью удалите среду и промойте 350 мкл PBS-2% FBS. Собирают клетки с 350 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 2 мин при 37 ° C. Добавьте 2 мл питательной среды и соберите клетки в новую коническую пробирку объемом 50 мл, затем центрифугу при 400 × г в течение 5 мин.
- Прохождение APC на 12-луночные планшеты (10 000-20 000 ячеек на лунку), предварительно покрытые 2,5% матриксом базальной мембраны. Инкубировать при 37 °C с содержаниемСО2 5%. Меняйте среду каждые 48 ч, пока клетки не достигнут 80% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: БТР можно пройти один раз. Впоследствии они теряют способность к размножению и дифференциации. Смотрите рабочий процесс для процесса изоляции APC на дополнительном рисунке S2.
2. Дифференцировка адипоцитов и индукция инсулинорезистентности
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте температуру клеток при 37 ° C в 5% CO2 и выполняйте шаги, связанные со сменой среды и обработкой TNF-α и инсулином внутри стерильного капюшона.
- При слиянии 80% начните процесс дифференциации; аспирировать любую питательную среду и заменить ее 500 мкл дифференцировочной среды (табл. 1), содержащей 3,3 нМ костного морфогенетического белка (BMP4) в каждой лунке.
- Через 48 ч замените среду дифференциирующей средой (500 мкл на лунку) и коктейлем дифференциации (табл. 1).
- Удалите среду через 72 ч и добавьте 100 нМ инсулина в 500 мкл свежей дифференцировочной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки начинают иметь круглый вид с мелкими липидными каплями внутри. - Через 48 ч аспирируйте любую дифференцирующую среду и замените ее 500 мкл простой среды-2% FBS (таблица 1). Индуцировать резистентность к инсулину с помощью 4 нг/мл ФНО-α. Включают контрольные скважины без обработки ФНО-α.
- После 24 ч инкубации добавляют 4 нг/мл ФНО-α в простой средне-0% ФБС (табл. 1). Обслуживание контрольных скважин без обработки ФНО-α.
- Активируйте сигнальный путь инсулина через 24 часа, добавив инсулин 100 нМ, и инкубируйте в течение 15 мин при 37 ° C в атмосфере 5% CO2 . Удалите среду и промойте 500 мкл PBS. Включают контрольные лунки без лечения инсулином.
3. Оценка сигнального пути инсулина методом вестерн-блоттинга
- Экстракция и количественное определение белка
- Промойте каждую лунку клеток 500 мкл PBS и держите на льду для лизиса клеток в 50 мкл буфера RIPA (таблица 1), содержащего 1% коктейль ингибитора протеазы, добавленный непосредственно перед выделением образца. Соскребите наконечником всю поверхность лунки и переложите лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл (держите на льду).
- Инкубировать в течение 1 ч при 4 °C во вращающемся шейкере, перемешивать вихревым способом и центрифугировать при 8 000 × г в течение 15 мин при 4 °C и извлекать надосадочную жидкость (держать на льду).
- Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда (не разбавляйте образец для количественного определения).
- Возьмите необходимый объем, соответствующий 40-60 мкг, и денатурируйте с помощью 6-кратного буфера Laemmli (таблица 1) путем инкубации при 97 ° C в течение 15 мин, встряхивая при 550 об/мин. Заморозьте до использования.
- SDS-электрофорез в полиакриламидном геле
- Проведите электрофорез в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE) с 7,5% полиакриламидным гелем толщиной 1,5 мм. Вставьте гель в бак и заполните проточным буфером (таблица 1).
- Добавьте 3 мкл окрашенного стандарта белка в первую лунку геля и загрузите каждый образец в последующие лунки.
- Запустите гель при 80 В в течение примерно 15 минут, чтобы убедиться, что образец попадает в гелевую матрицу полиакриламидного концентратора. После этого увеличьте напряжение до 90 В в течение 2,5 ч или до тех пор, пока на нижнем краю геля не появится маркер молекулярной массы 37 кДа.
- Переносят белки из геля на нитроцеллюлозную мембрану в полусухой камере на 35 мин при 25 В. Предварительно погрузите гель, мембрану и фильтры в буфер переноса (таблица 1) на несколько минут.
- Вестерн-блоттинг
- После переноса промыть мембрану трис-буферным физиологическим раствором (TBS), содержащим 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (табл. 1) в течение 3 мин при встряхивании при 30 об/мин.
- Блокировать мембрану блокирующим раствором (таблица 1) при 4 °C в течение 1 ч при постоянном вращении.
- Разрежьте мембрану на три части в соответствии с маркером молекулярной массы, чтобы инкубировать в течение ночи с различными первичными антителами (разбавленными в блокирующем растворе) при 4 ° C в постоянном вращении: антитело Phospho-IRS1 (Tyr608) (1: 1,000), ожидаемая полоса при 180 кДа; Антитело к рецептору фосфоинсулина β (Tyr1150/1151) (1:1,000), ожидаемая полоса при 95 кДа; Антитело к фосфо-Akt (Ser473) (1:1,000), ожидаемая полоса при 60 кДа.
- Промойте мембраны 5 раз в течение 5 минут каждая с TBS-T 0,1%.
- Инкубируют мембраны с соответствующим вторичным антителом, связанным с пероксидазой (разведенным в блокирующем растворе) в течение 2 ч при комнатной температуре в постоянном вращении: пероксидаза аффиниЧистый ослиный антикролик IgG (H+L) (1:5,000).
- Промойте мембраны 5 раз в течение 5 минут каждая с TBS-T 0,1%.
- Обнаружение белков с помощью системы хемилюминесцентного обнаружения. Подготовьте основание в соответствии с инструкциями производителя.
- Поместите кляксу в полиэтиленовый пакет и добавьте 200 мкл хемилюминесцентной подложки, чтобы полностью покрыть мембрану. Слейте лишний субстрат и удалите пузырьки воздуха.
- Экспонируйте каждое пятно в течение 30-60 с в высокопроизводительной системе визуализации, совместимой с хемилюминесценцией.
- Зачистите мембраны (этапы 10-13 участка вестерн-блоттинга), чтобы разорвать взаимодействия антитело-антиген и, таким образом, позволить нитроцеллюлозным мембранам быть повторно блотированными. Восстановите мембраны и промойте 3 раза по 5 минут каждый TBS-T 1% при 50 об/мин.
- Инкубировать в течение 7 мин с 10 мл 0,2 М NaOH при 50 об/мин.
- Промыть 3 раза по 5 мин каждую водопроводной водой со скоростью 50 об/мин.
- Стирайте в течение 10 минут с TBS-T 1% при 50 об/мин.
- Повторите шаги 2-9 участка вестерн-блоттинга для инкубации мембраны с анти-бета-тубулином (55 кДа) в качестве контроля загрузки с использованием разведения 1:1,000.
- Выполните денситометрический анализ25 для каждого белка с помощью программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
За последние несколько лет возросшая распространенность ожирения и СД2 вызвала интенсивный поиск механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в жировой ткани. С помощью протокола, описанного здесь, APC могут быть дифференцированы на зрелые адипоциты для оценки резистентности и чувствительности к инсулину. Как только APC достигают слияния, требуется 10 дней, чтобы завершить их дифференцировку в зрелые адипоциты и их опосредованную TNF-α индукцию резистентности к инсулину (рис. 1).
APC демонстрируют фибробластоподобную морфологию, характеризующуюся их плоской и удлиненной формой и адгезией к пластине, завершенной через 48 ч после посева (рис. 2A). APC требуется 2-5 дней, чтобы достичь 80% слияния (в зависимости от количества засеянных клеток), время, когда процесс дифференцировки начинается с воздействия дифференцирующего коктейля (рис. 2A). Зрелые адипоциты начинают появляться в последующие 6-8 дней. Дифференцированные адипоциты характеризуются круглой морфологией и внутриклеточным скоплением липидных капель. До 80% клеток дифференцируются в конце процесса дифференцировки (рис. 2B).
Инсулинорезистентность индуцируется в первичных адипоцитах лечением ФНО-α (4 нг/мл) в течение 48 ч; эта концентрация TNF-α не изменяет жизнеспособность клеток (дополнительный рисунок S3). Впоследствии сигнальный путь инсулина активируется добавлением инсулина 100 нМ в течение 15 мин, а фосфорилирование основных сигнальных молекул (IR, IRS-1 и AKT) измеряется вестерн-блоттингом. Инсулин стимулирует фосфорилирование этих трех молекул (рис. 3) по сравнению с контрольными, необработанными дифференцированными адипоцитами. TNF-α снижает инсулин-индуцированное фосфорилирование IR (30%), IRS-1 (20%) и AKT (45%) (рис. 3). Инсулинорезистентные клетки демонстрируют меньшую активацию сигнального пути инсулина по сравнению с инсулин-чувствительными клетками. Кроме того, лечение TNF-α снижает экспрессию мРНК известных маркеров чувствительности к инсулину: Insr, Irs2, Glut4 и Adipoq (дополнительный рисунок S4). Эти данные подтверждают, что TNF-α снижает действие инсулина в первичных адипоцитах и тем самым индуцирует резистентность к инсулину.
Рисунок 1: Схематическая временная шкала, представляющая процесс дифференцировки клеток-предшественников адипоцитов и индукцию резистентности к инсулину. APC выделяют из подкожной жировой клетчатки с помощью лечения коллагеназой и технологии магнитного разделения клеток. Затем они проходят 7-дневный процесс дифференцировки для получения первичных адипоцитов. Затем инсулинорезистентность индуцируют TNF-α в течение 48 ч, первые 24 ч в среде, содержащей 2% FBS, и следующие 24 ч в среде, не содержащей сыворотки, для предотвращения активации сигнального пути инсулина. Сигнальный каскад активируется инсулином, и белок извлекается для анализа вестерн-блоттинга через 10 дней после начала процесса дифференцировки для оценки фосфорилирования/активации IR, IRS-1 и AKT. Сокращения: APC = клетки-предшественники адипоцитов; BMP4 = костный морфогенетический белок; IBMX = 3-изобутил-1-метилксантин; TNF-α = фактор некроза опухоли-α; FBS = эмбриональная бычья сыворотка; IR = рецептор инсулина; IRS = субстрат рецептора инсулина; AKT = протеинкиназа B; Tx = лечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфология клеток-предшественников адипоцитов и зрелых адипоцитов . (A) Подкожные APC при слиянии 80% до индуцирования дифференцировки в 12-луночных культуральных планшетах. (B) Подкожные первичные адипоциты после 7 дней индуцирования дифференцировки в 12-луночных культуральных планшетах. Снимки были сделаны с 10-кратным увеличением. Масштабные линейки = 100 мкм. Аббревиатура: APC = клетки-предшественники адипоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Инсулинорезистентность, индуцированная TNF-α в подкожных первичных адипоцитах, демонстрируетая снижением инсулининдуцированного фосфорилирования IR, IRS-1 и AKT. Подкожные адипоциты обрабатывали TNF-α (4 нг/мл) в течение 48 ч и голодали в сыворотке крови в течение последних 24 ч. После стимуляции инсулином (100 нМ) в течение 15 мин 40 мкг общего белка загружали на 7,5% гели и подвергали SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и блокировали в 4% обезжиренном молоке в TBS-T 0,1%. Мембрану зондировали антифосфорилированным IR (pIR), антифосфорилированным IRS-1 (pIRS-1) и антифосфорилированным AKT (pAKT), а также вторичным антителом HRP против кролика. Сигнал визуализировался с помощью хемилюминесцентного детектирования, а анти β тубулин использовался в качестве контроля нагрузки. (A) репрезентативные блоты и (B) количественная оценка из трех независимых экспериментов. Данные являются средними ± SEM; *, p < 0,05 по сравнению с контролем. Сокращения: TNF-α = фактор некроза опухоли-α; IR = рецептор инсулина; IRS = субстрат рецептора инсулина; pX = фосфорилированная форма X; b-Tub = бета-тубулин; HRP = пероксидаза хрена; Ctrl = управление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение Anti-Fc | очищенный крысиный антимышиный CD16 / CD32, разведенный в PBS-2% FBS [1:150] | |||
| ТБС-Т 0,1% | 0,01 М трис-HCl (рН 8), 0,15 М NaCl, 0,1% твин 20 | |||
| Решение для блокировки | 4% обезжиренное сухое молоко, разведенное в ТБС-Т 0,1% | |||
| Питательная среда | 60% DMEM с низким содержанием глюкозы, 40% MCDB 201 средний, 1x пенициллин-стрептомицин, 1 нМ дексаметазон, 0,1 мМ L-аскорбиновая кислота 2-фосфат, 1x инсулин, трансферрин, натрий, селенит (ITS) жидкая среда добавка, 1x линолевая кислота-альбумин из BSA, 10% FBS, 10 нг / мл эпидермальный фактор роста (EGF), 10 нг / мл фактор ингибирования лейкемии (LIF), 10 нг / мл тромбоцитарный фактор роста BB (PDGF-BB), 5 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 50 мкг/мл нормоцина | |||
| Дифференциационная среда | 60% DMEM с низким содержанием глюкозы, 40% среда MCDB 201, 1x пенициллин-стрептомицин, 1 нМ дексаметазон, 0,1 мМ L-аскорбиновая кислота 2-фосфат, 1x добавка жидкой среды ITS, 1x линолевая кислота-альбумин из BSA и 2% FBS | |||
| Коктейль «Дифференциация» | 0,5 мкМ 3-изобутил-1-метилксантин [IBMX], 1 мкМ дексаметазон, 10 мкМ росиглитазона и 100 нМ инсулина | |||
| Простой средний-2% FBS | 60% DMEM с низким содержанием глюкозы, 40% MCDB 201 средний, 1x пенициллин-стрептомицин и 2% FBS | |||
| Простой средний – 0% FBS | 60% DMEM с низким содержанием глюкозы, 40% MCDB 201 средний, 1x пенициллин-стрептомицин | |||
| Буфер RIPA | 50 мМ Tris-HCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, 1% октилфеноксиполи(этиленокси)этанол, 1 мМ Na3VO 4, 48,8 мМ NaF, 8,2 мМ Na4 P2O7 и 0,26 М сахарозы | |||
| 6x буфер Laemmli | 1,2 г SDS, 6 мг бромфенолового синего, 4,7 мл глицерина, 1,2 мл трис-основания 0,5 М рН 6,8, 845 мкл 2-меркаптоэтанола и 2,1 мл H2O | |||
| Запущенный буфер | 25 мМ трис-основания, 192 мМ глицина, 1% SDS | |||
| Буфер передачи | 25 мМ трис-основания, 192 мМ глицина, 20% метанола | |||
Таблица 1: Решения, используемые в этом протоколе.
Дополнительный рисунок S1: Подкожная жировая клетчатка, переваренная коллагеназой. После удаления жировой ткани ее разрезают ножницами на мелкие кусочки, чтобы запустить процесс пищеварения (А), затем инкубируют в течение 30 минут с коллагеназой типа 1 при 37 ° C, 150 об/мин (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Схема процесса выделения клеток-предшественников адипоцитов. Препарируют паховую подкожную жировую клетчатку и переваривают образцы с помощью коллагеназы. Удалите зрелые адипоциты центрифугированием и промойте гранулы, чтобы удалить лишний жир. Лизируйте эритроциты и блокируйте, чтобы уменьшить неспецифическое связывание. Пометьте эндотелиальные клетки и макрофаги антителами, связанными с магнитными частицами. Выполните магнитную сепарацию ячеек, используя стратегию отрицательной сепарации с магнитным сепаратором ячеек. Затравить APC (немеченые клетки) в пластинах, покрытых матриксом базальной мембраны. Меняйте среду каждые 48 ч, пока клетки не достигнут 80% слияния. Сокращения: APC = клетки-предшественники адипоцитов; BSA = бычий сывороточный альбумин; FBS = эмбриональная бычья сыворотка. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Лечение TNF-α для индукции резистентности к инсулину не изменяет жизнеспособность адипоцитов. Жизнеспособность зрелых адипоцитов измеряли методом МТТ после обработки 4 нг/мл ФНО-α в течение 48 ч. Данные являются средними ± SEM. Сокращения: TNF-α = фактор некроза опухоли-α; Ctrl = управление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Лечение ФНО-α в адипоцитах снижает экспрессию маркеров чувствительности к инсулину. Экспрессию мРНК Insr, Irs, Glut4 и Adipoq измеряли методом ПЦР в реальном времени после лечения 4 нг/мл TNF-α в течение 48 часов. Данные являются средними ± SEM; *, p < 0,05 по сравнению с контролем. Сокращения: TNF-α = фактор некроза опухоли-α; Ctrl = управление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе представлен метод изучения инсулинорезистентности, использующий первичные адипоциты в культуре, обработанной ФНО-α. Преимущество этой модели заключается в том, что первичные адипоциты можно культивировать в определенных условиях в течение длительных периодов времени с жестким контролем клеточных факторов окружающей среды26. Продолжительность анализа составляет 15-20 дней, хотя между экспериментами могут возникать различия в процентном соотношении дифференцированных адипоцитов. Первичные адипоциты имеют преимущества перед клеточными линиями, поскольку они не были постоянно расширены в культуре и более точно отражают разнообразие ткани, из которой они получены27. Кроме того, первичные адипоциты позволяют изучать доноров в различных физиопатологических контекстах, таких как худые и страдающие ожирением, мужчины и женщины, молодые и старые, а также клетки из разных жировых депо. Еще одно преимущество этого метода заключается в том, что клеточные линии от CRE и нокаутных мышей могут быть получены после выделения APC.
Одна из возможных проблем во время выделения и дифференцировки APC заключается в том, что эти клетки могут потерять способность дифференцироваться, что, вероятно, произойдет при превышении 80% слияния в начале процесса дифференцировки. Среду также следует менять очень аккуратно, особенно после накопления липидов, так как дифференцированные адипоциты легко отделяются от чашки для культивирования. Кроме того, каждая партия коллагеназы должна быть проверена на эффективность пищеварения, выход клеток и цитотоксичность26. Были разработаны методы идентификации и выделения APC из стромоваскулярной фракции белой жировой ткани с использованием отрицательных маркеров, таких как CD31 и CD45, а также положительных маркеров популяции стволовых клеток, таких как CD34 и Sca128,29. В этом протоколе мы выполняем только отрицательное разделение, исключая эндотелиальные клетки и макрофаги из стромоваскулярной фракции, тем самым избегая потери преадипоцитов при положительном разделении.
Хотя первичные культуры позволяют изучать изменчивость и сложность доноров27,30, постановка экспериментальной модели накладывает ограничения. Например, адипоциты, выделенные от старых животных, будут иметь меньшую дифференцировочную способность и более высокий уровень липотоксичности по сравнению с адипоцитами молодых животных31,32. Протокол также может быть адаптирован для использования различных методов разделения клеток. Если автоматический магнитный сепаратор ячеек недоступен, ручное разделение ячеек может быть достигнуто с помощью колонок или сортировки FACS. Описанный здесь метод изоляции APC с использованием сепаратора магнитных ячеек представляет собой адаптированную и упрощенную версию протокола сортировки FACS, описанного Macotela et al.28.
Несколько воспалительных цитокинов были использованы для индукции резистентности к инсулину в жировых клетках, включая TNF-α, IL-1β и IL-6 18,33,34,35,36. Культивируемые адипоциты 3T3-L1, подвергшиеся воздействию TNF-α, становятся инсулинорезистентными в течение нескольких дней, что оценивается по сниженной способности инсулина стимулировать поглощение глюкозы37. Эти результаты показывают, что TNF-α снижает инсулин-индуцированное фосфорилирование IR, IRS-1 и AKT21,23, измеренное с помощью вестерн-блоттинга обнаружения общего белка, выделенного из первичных адипоцитов. Однако протеазы и фосфатазы, высвобождаемые во время лизиса клеток, могут влиять на обнаружение вестерн-блоттинга. Активное состояние белков следует сохранять путем добавления ингибиторов протеазы и фосфатазы в буфер лизиса и после количественного определения белка путем смешивания образца с буфером Laemmli. В заключение, этот метод является полезным инструментом для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в адипоцитах, дифференцированных с мышиными APC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Даниэля Мондрагона, Антонио Прадо, Фернандо Лопеса-Барреру, Мартина Гарсию-Сервина, Алехандру Кастилью и Марию Антониету Карбахо за их техническую помощь, а также Джессику Гонсалес Норрис за критическое редактирование рукописи. Этот протокол был поддержан Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B.
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
- Petersen, M. C., Shulm, G. I.
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
- Cinti, S.
- Kahn, B. B., Flier, J. S.
- Klemm, D. J., et al.
- Wilcox, G.
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
