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Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Abstract

A disfunção da barreira sangue-retina (BRB) contribui para a fisiopatologia de várias doenças oculares vasculares, muitas vezes resultando em edema da retina e subsequente perda de visão. A barreira hemato-retiniana interna (iBRB) é composta principalmente de endotélio vascular da retina com baixa permeabilidade em condições fisiológicas. Esta característica de baixa permeabilidade é rigidamente regulada e mantida por baixas taxas de transporte paracelular entre as células endoteliais microvasculares adjacentes da retina, bem como o transporte transcelular (transcitose) através delas. A avaliação da permeabilidade da barreira transcelular da retina pode fornecer insights fundamentais sobre a integridade do iBRB na saúde e na doença. Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose de células endoteliais (CE), como um modelo in vitro para avaliar a permeabilidade do iBRB, utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs). Este ensaio avalia a capacidade dos HRMECs de transportar transferrina e peroxidase de rábano (HRP) em processos de transporte transcelular mediados por receptores e cavéolas, respectivamente. HRMECs totalmente confluentes cultivados em membrana porosa foram incubados com transferrina marcada com fluorescência (transcitose dependente de clatrina) ou HRP (transcitose mediada por cavéolas) para medir os níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior, indicativos de níveis de transcitose em toda a monocamada da CE. A sinalização Wnt, uma via conhecida que regula o iBRB, foi modulada para demonstrar o método de ensaio de transcitose baseado em HRP mediado por cavéolas. O ensaio de transcitose EC descrito aqui pode fornecer uma ferramenta útil para investigar os reguladores moleculares da permeabilidade CE e da integridade do iBRB em patologias vasculares e para o rastreamento de sistemas de liberação de medicamentos.

Introduction

A retina humana é um dos tecidos que mais demandam energia no corpo. O bom funcionamento da retina neural requer um suprimento eficiente de oxigênio e nutrientes, juntamente com um fluxo restrito de outras moléculas potencialmente nocivas para proteger o ambiente da retina, que é mediado pela barreira sangue-retina (BRB)1. Semelhante à barreira hematoencefálica (BBB) no sistema nervoso central, o BRB atua como uma barreira seletiva no olho, regulando o movimento de íons, água, aminoácidos e açúcar dentro e fora da retina. O BRB também mantém a homeostase da retina e seu privilégio imunológico, impedindo a exposição a fatores circulatórios, como células imunes, anticorpos e patógenos nocivos2. A disfunção do BRB contribui para a fisiopatologia de diversas doenças oculares vasculares, como retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão da veia retiniana e uveíte, resultando em edema vasogênico e subsequente perda de visão 3,4,5.

O BRB consiste em duas barreiras separadas para duas redes vasculares oculares distintas, respectivamente: a vasculatura da retina e o coriocapilar fenestrado abaixo da retina. O BRB interno (iBRB) é composto principalmente de células endoteliais microvasculares da retina (RMECs) que revestem a microvasculatura da retina, que nutre as camadas neuronais internas da retina. Por outro lado, o epitélio pigmentar da retina forma o principal componente do BRB externo, que se encontra entre a retina neurossensorial e o coriocapilar2. Para o iBRB, o transporte molecular através das RMECs ocorre por via paracelular e transcelular (Figura 1). O alto grau de seletividade de substâncias em todo o iBRB depende (i) da presença de complexos proteicos juncionais que restringem o transporte paracelular entre células endoteliais (CE) adjacentes e (ii) baixos níveis de expressão de mediadores, transportadores e receptores de cavéolas dentro das células endoteliais que mantêm baixas taxas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Os complexos juncionais que regulam o fluxo paracelular são compostos por junções apertadas (claudinas, occludinas), junções aderentes (caderinas VE) e junções gap (conexinas), permitindo a passagem de água e pequenos compostos solúveis em água. Enquanto pequenas moléculas lipofílicas se difundem passivamente pelo interior das RMECs, o movimento de moléculas lipofílicas e hidrofílicas maiores é regulado por vias transendoteliais impulsionadas por ATP, incluindo transporte vesicular e transportadores de membrana 5,9.

A transcitose vesicular pode ser categorizada em transcitose caveolar mediada por caveolina, transcitose dependente de clatrina (e mediada por receptor) e macropinocitose independente de clatrina (Figura 2). Esses processos de transporte vesicular envolvem vesículas de tamanhos diferentes, com macropinossomos sendo os maiores (variando de 200-500 nm) e cavéolas sendo os menores (com média de 50-100 nm), enquanto as vesículas revestidas de clatrina variam de 70-150 nm10. As cavéolas são invaginações de membrana plasmática ricas em lipídios em forma de frasco com revestimento proteico, composto principalmente de caveolina-1 que se liga ao colesterol da membrana lipídica e a outras proteínas estruturais e sinalizadoras através de seu domínio cavamolíne-andaime11. As caveolinas trabalham em conjunto com a cavina periféricamente ligada para promover a estabilização das cavéolas na membrana plasmática12. As membranas caveolares também podem transportar receptores para outras moléculas, como insulina, albumina e lipoproteínas circulantes, incluindo lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL), para auxiliar seu movimento através das células endoteliais13. Durante o desenvolvimento, a formação de BRB funcional depende da supressão da transcitose CE8. O endotélio retiniano maduro, portanto, apresenta níveis relativamente baixos de receptores de cavéolas, casofalina-1 e albumina em relação a outras células endoteliais em condições fisiológicas, contribuindo para suas propriedades de barreira 4,9.

Como a degradação do iBRB é uma das principais características de muitas condições oculares patológicas, é essencial desenvolver métodos para avaliar a permeabilidade vascular da retina in vivo e in vitro. Esses métodos ajudam a fornecer insights prováveis sobre os mecanismos de integridade comprometida do BRB e a avaliar a eficácia de potenciais alvos terapêuticos. Exames de imagem in vivo atuais ou ensaios quantitativos de vazamento vascular geralmente empregam fluorescentes (fluoresceína de sódio e dextrano), colorimétricos (corante Evans Blue e substrato de peroxidase de rábano [HRP]) ou marcadores radioativos14 para detectar extravasamento da vasculatura para tecidos retinianos circundantes com imagens de microscópio ou em lisado de tecido isolado. Um marcador ideal para quantificar a integridade vascular deve ser inerte e grande o suficiente para permear livremente os vasos comprometidos enquanto confinados em capilares saudáveis e intactos. Métodos que empregam fluoresceína de sódio ou dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) em angiografia de fluoresceína de fundo de olho vivo (FFA) ou montagens planas isoladas da retina são amplamente utilizados para quantificar o extravasamento da retina in vivo ou ex vivo. O FITC-dextran tem a vantagem de estar disponível em diferentes pesos moleculares variando de 4-70 kDa para estudos seletivos de tamanho15,16,17. A albumina FITC (~68 kDa) é um traçador alternativo de proteínas de grande porte de relevância biológica para estudos de extravasamento vascular18. O corante Evans Blue, injetado intracardialmente19, retro-orbitalmente ou através da veia caudal 20, também depende de sua ligação com albumina endógena para formar uma molécula grande que pode ser quantificada principalmente por detecção espectrofotométrica ou, menos comumente, microscopia de fluorescência em montagens planas20,21. Essas metodologias de imagem quantitativa ou leve, no entanto, muitas vezes não distinguem o transporte paracelular do transporte transendotelial. Para a análise específica da transcitose com visualização ultraestrutural de vesículas transcitosadas, moléculas traçadoras, como a HRP, são tipicamente utilizadas para localizar vesículas transcitosadas dentro de células endoteliais que podem ser observadas em microscópio eletrônico 22,23,24 (Figura 3A-C).

O desenvolvimento e o uso de modelos de iBRB in vitro para avaliar a permeabilidade das células endoteliais poderiam fornecer uma avaliação robusta e de alto rendimento para complementar os experimentos in vivo e auxiliar na investigação de reguladores moleculares de vazamento vascular. Ensaios comumente utilizados para avaliar o transporte paracelular e a integridade de junções apertadas incluem resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de condutância iônica (Figura 4)2,25 e ensaio de vazamento vascular in vitro usando marcadores fluorescentes de pequeno peso molecular26. Além disso, ensaios de transcitose à base de transferrina modelando BBB têm sido utilizados para explorar a transcitose dependente de clatrina27. Apesar disso, os ensaios para avaliar o BRB e, mais especificamente, a transcitose caveolar da CE retiniana in vitro são limitados.

Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose CE usando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) como modelo in vitro para determinar a permeabilidade do iBRB e a transcitose CE. Este ensaio baseia-se na capacidade dos HRMECs de transportar transferrina ou HRP através das vias de transcitose mediadas por receptores ou dependentes de cavéolas, respectivamente (Figura 2). Os HRMECs cultivados até a confluência total na câmara apical (ou seja, inserção de filtro) foram incubados com transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) ou HRP para medir a intensidade de fluorescência correspondente aos níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior apenas através da transcitose CE. A confluência da monocamada celular pode ser confirmada pela medição do TEER, indicando a integridade da junção apertada25. Para demonstrar a técnica de TEER e ensaio de transcitose, foram utilizados moduladores moleculares conhecidos de permeabilidade vascular e transcitose CE, incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)28 e aqueles na sinalização Wnt (ligantes Wnt: Wnt3a e Norrin)29.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Boston Children's Hospital para a geração de microscopia de luz e imagens EM (Figura 3). Os protocolos para os estudos in vivo podem ser obtidos de Wang et al.24. Todos os experimentos envolvendo células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) foram aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) do Boston Children's Hospital.

1. Preparação de Reagentes

  1. Solução para revestimento de placa de cultura de tecidos: Preparar solução de gelatina a 0,1% dissolvendo 1 mL de solução de estoque de gelatina (40%-50%) em 500 mL de cultura de tecido estéril grau 1x PBS (pH = 7,4). Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm. Conservar a 0,1% a solução de gelatina a 2-8°C. Pode ser armazenado à referida temperatura por um tempo indefinido em uma condição estéril.
  2. Meio de crescimento: Preparar 500 mL de meio completo de crescimento de células endoteliais (EGM) dissolvendo suplementos de EGM no meio basal de crescimento de células endoteliais (EBM) de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Aliquot o meio de crescimento em tubos de 50 ml e armazene os tubos a 4 °C. O prazo de validade do meio de crescimento é de 12 meses a 4 °C.
  3. Solução de tripsina: Para solução de tripsina-EDTA a 0,25%, alíquota do frasco para injetáveis de reserva em tubos de 50 ml e conservar a 4 °C (até 2 semanas) ou a −20 °C (até 24 meses).

2. Cultivo de HRMECs

  1. Cultura celular inicial
    1. Cubra as placas de Petri de cultura de células (100 mm de diâmetro x 20 mm de altura) com 5 mL de solução de gelatina a 0,1% sob um exaustor de fluxo laminar e mantenha-as intactas no exaustor por 30 min à temperatura ambiente (RT) para revestimento uniforme.
      NOTA: O revestimento gelatinoso de pratos aumenta a fixação celular. Alternativamente, frascos de cultura T75 revestidos de gelatina também podem ser usados.
    2. Antes de semear as células, aspirar a solução de gelatina usando uma bomba de vácuo. A pressão de vácuo do aspirador utilizado foi de até 724 mmHg.
      NOTA: A aspiração deve ser feita imediatamente antes das células de semeadura para evitar a secagem da solução de revestimento.
    3. Descongele um frasco para injetáveis congelado de HRMECs (a partir do armazenamento em azoto líquido) utilizando um banho-maria a 37 °C ou adicionando um meio de crescimento quente ao frasco para injetáveis. Uma vez descongelado, transfira a suspensão celular para 9 mL de meio de crescimento (supondo que o frasco descongelado de HRMECs seja de 1 mL).
      NOTA: Os HRMECs foram obtidos comercialmente (Tabela de Materiais). O meio de crescimento adicionado às células deve ser sempre pré-aquecido a 37 °C antes da utilização.
    4. Gire as células a 200 x g por 5 min no RT e aspirar cuidadosamente o sobrenadante para evitar a remoção do pellet celular.
    5. Ressuscite o pellet celular em 10 mL de meio de crescimento e transfira a suspensão resultante para uma placa de Petri revestida de gelatina. Manter as células na incubadora a 37 °C e a 5% de CO2. Normalmente, os HRMECs são 70%-80% confluentes após 72 h.
      NOTA: O meio de crescimento é alterado a cada dois dias.
  2. Subcultura de HRMECs em inserções de membrana permeável
    1. Preparar inserções de filtro de cultura celular (pastilhas de 6,5 mm com membrana de policarbonato de tamanho de poro de 0,4 μm, colocadas em uma placa de 24 poços) para semeadura de HRMECs revestindo cada pastilha (câmara apical) com 200 μL de solução de gelatina a 0,1% por 30 min sob um exaustor de fluxo laminar. Certifique-se de que a solução cobre toda a superfície inferior da inserção do filtro.
      NOTA: Cada poço tem uma câmara apical e basolateral separada por uma membrana porosa.
    2. Retire a placa de Petri com HRMECs cultivados (etapa 2.1.5.) da incubadora e aspirar o meio de crescimento. Lave suavemente as células 2x com 10 mL de PBS 1x sob um exaustor de fluxo laminar para se livrar de possíveis células flutuantes / mortas.
    3. Dissociar as células com 0,5-1 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% e colocar a placa de Petri na incubadora (37 °C e 5% CO2) por 5 min.
    4. Sacie a atividade da tripsina adicionando 4,5-9 mL de meio de crescimento e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL usando uma pipeta de 10 mL.
    5. Gire as células a 200 x g por 5 min no RT, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de meio de crescimento.
    6. Conte o número de células usando um hemocitômetro manual ou um contador de células automatizado e semeie a uma densidade de 4 x 104 células por inserção de filtro (ou seja, 1,25 x 105 células/cm2). O volume de suspensão celular para cada pastilha é de 250 μL.
    7. Aspirar a solução de revestimento dos poços que contêm inserções permeáveis e transferir 250 μL da suspensão celular por pastilha (câmara apical). Adicione apenas meio (ou seja, sem células) a uma das inserções, que será usada como um "controle em branco" para a medição do TEER. Simultaneamente, adicione também 750 μL de meio por poço, nas câmaras basolaterais.
    8. Mantenha a placa de 24 poços com inserções permeáveis na incubadora (37 °C e 5% de CO 2) por 7-12 dias até que as células cultivadas se tornem totalmente confluentes e o valor TEER desejado de ~20 Ω·cm2 seja alcançado.
    9. Mude o meio de crescimento a cada dois dias. Durante a troca do meio, aspirar cuidadosamente o meio para minimizar a ruptura da monocamada celular e adicionar 250 μL e 750 μL de meio fresco por poço às câmaras apical e basolateral, respectivamente.
      NOTA: O meio de crescimento é alterado para as câmaras apical e basolateral dos poços.

3. Medições TEER (Figura 4)

  1. No dia 14 pós-semeadura de células (etapa 2.2.9.), meça o TEER para HRMECs usando um sistema de resistência elétrica (ER) de volt-ohm epitelial (EVOM) (Tabela de Materiais) da seguinte forma.
  2. Pré-carregue o sistema ER e verifique a funcionalidade do medidor usando o eletrodo de teste STX04. Calibre, se necessário.
  3. Conecte o eletrodo ao medidor e equilibre o eletrodo primeiro mergulhando-o em etanol a 70% por 15-20 min e, em seguida, imergindo-o brevemente no meio de crescimento EGM de cultura celular.
  4. Enquanto isso, mantenha a placa de 24 poços contendo células no exaustor de fluxo laminar em RT por 15-20 min para equilíbrio de temperatura.
    NOTA: As medições de TEER são afetadas pela temperatura, por isso a etapa de equilíbrio é essencial.
  5. Para a medição do TEER, adicione o meio de crescimento fresco às câmaras apical (250 μL) e basolateral (750 μL) dos poços.
  6. Realize a medição TEER imergindo cuidadosamente o eletrodo de modo que a ponta mais curta esteja na inserção e a ponta mais longa toque o fundo do poço. Meça a resistência em todo o controle em branco primeiro. Para cada inserção, meça o TEER em triplicados.
    NOTA: Para enxaguar o eléctrodo entre as medições, utiliza-se um meio de cultura. Certifique-se de que o eletrodo esteja preso em um ângulo de 90° em relação à parte inferior da pastilha para leituras estáveis.
  7. Calcular a resistência elétrica (em Ω·cm 2) através da monocamada usando a fórmula, TEER = resistência líquida (Ω) x área de superfície da inserção do filtro (cm2); aqui, a resistência líquida é a diferença entre a resistência de cada poço (meio de crescimento com células) e o poço em branco (apenas meio de crescimento).
  8. Realize um tratamento adicional das células somente após o valor de TEER atingir ~ 20 Ω · cm2. Se o nível de TEER desejado não for atingido, mantenha a placa na incubadora e meça o TEER no dia seguinte.
    NOTA: A confluência HRMEC também pode ser validada pelo exame morfológico da forma celular (sob microscópio) com morfologia típica de paralelepípedos e/ou pela presença de proteínas de junção celular com coloração imuno-histoquímica separadamente.

4. Ensaio de transcitose

  1. Ensaio de transcitose in vitro mediado por clatrina utilizando transferrina marcada com Cy3 (Figura 5)
    1. Ao atingir a confluência com valores de TEER em torno de 20 Ω·cm 2, o soro priva as células por 24 h a 37 °C e 5% de CO2 usando FBS a 0,5% em EBM (meio reduzido sérico) em ambas as câmaras (câmara apical: 250 μL e câmara basolateral: 750 μL) antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio.
    2. Incubar as células (utilizando o meio com redução sérica na etapa 4.1.1.) na câmara apical com ligante transferrina fluorescente (cianina 3) (Cy3-Tf) (concentração final de 40 μg/ml) durante 60 min a 37 °C.
      NOTA: As placas contendo Cy3-Tf devem ser protegidas da luz para evitar o fotobranqueamento de Cy3-Tf, envolvendo nelas folha de alumínio e realizando o experimento em um exaustor de cultura de células com as luzes apagadas.
    3. Após 1 h, colocar a placa sobre gelo e lavar a monocamada apicamente e basolateralmente 4x (3-5 min por lavagem) com o meio reduzido de soro no RT para remover o Cy3-Tf livre não ligado.
      NOTA: A lavagem é essencial para remover moléculas traçadoras livres e permitir uma leitura precisa da transcitose sem potencial vazamento da via paracelular.
    4. Adicionar meio fresco com soro reduzido (como na etapa 4.1.1.) às pastilhas de filtro cuidadosamente lavadas que contenham células e transferir as pastilhas para poços frescos da placa de 24 poços contendo meio com soro reduzido pré-aquecido.
    5. Incubar as células por mais 90 min na incubadora (37 °C e 5% de CO2) e, em seguida, coletar o meio da câmara basolateral.
    6. Registar a intensidade de fluorescência da solução a partir da câmara basolateral utilizando um detector de fluorescência. Os níveis de intensidade de fluorescência, medidos como unidades fluorescentes relativas (RFU), indicam a quantidade de complexo Cy3-Tf transcitosada através da monocamada HRMEC via transcitose dependente de clatrina.
  2. Ensaio de transcitose in vitro mediado por cavéolas utilizando HRP (Figura 6)
    1. Ao atingir a confluência total com os valores de TEER em torno de 20 Ω cm 2, o soro priva as células por 24 h a 37 °C e 5% de CO2 usando 0,5% de EBM contendo FBS (meio reduzido sérico) antes do tratamento (como na etapa 4.1.1.). O meio EBM com redução sérica foi utilizado durante todo o ensaio.
    2. Trate as células da câmara apical com os tratamentos e controles do veículo desejados.
      NOTA: Aqui, usamos moduladores Wnt como exemplo para demonstrar a regulação da transcitose mediada por cavéolas pela via de sinalização Wnt em HRMECs: Norrin recombinante humano e inibidor de Wnt XAV939. Em um experimento típico, as células foram tratadas por 24 h em incubadora (37 °C e 5% de CO2) com as seguintes concentrações: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) e solução de controle do veículo. Além disso, o meio condicionado Wnt3a (produzido a partir de células L Wnt-3A) também foi usado.
    3. Incubar as células na câmara apical com HRP (5 mg/mL) por 15 min a 37 °C.
    4. Posteriormente, colocar a placa de 24 poços sobre gelo e lavar intensamente as câmaras apical e basolateral 6x com tampão P (pH HEPES 10 mM = 7,4, piruvato de sódio 1 mM, glicose 10 mM, CaCl 2 3 mM, NaCl145 mM) para remover a HRP extracelular livre.
      NOTA: A lavagem é essencial para remover moléculas traçadoras livres e permitir uma leitura precisa da transcitose sem potencial vazamento da via paracelular.
    5. Adicionar meio fresco com soro reduzido (como indicado no ponto 4.1.1.) à câmara apical e transferir as pastilhas para um alvéolo fresco contendo meios pré-aquecidos.
    6. Incubar a monocamada por mais 90 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 antes de recolher o meio da câmara basolateral.
    7. Ao meio coletado, adicionar 100 μL de substrato de peroxidase fluorogênica HRP (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante, e incubar em RT por 10 min antes de interromper a reação com 100 μL de solução Stop.
    8. Detectar os níveis de produto de reação do substrato HRP no meio usando um leitor de placa de fluorescência. Medir a intensidade de fluorescência no comprimento de onda de emissão de 420 nm (com excitação de 325 nm) e como unidades fluorescentes relativas (RFU). Os valores indicam o nível de HRP transcitosado através da camada HRMEC através de transcitose mediada por cavéolas.
      NOTA: O produto fluorescente usado aqui (Tabela de Materiais) não faz fotobranqueamento. A proteção contra a luz contra o fotobranqueamento não é necessária.

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Representative Results

Imagens EM de endotélio vascular da retina mostram transporte vesicular transcitótico e vesículas caveolares em células endoteliais in vivo.
A transcitose EC pode ser visualizada in vivo dentro de cortes transversais da retina com precipitado marrom escuro refletindo vasos sanguíneos contendo HRP sob um microscópio de luz (Figura 3A) e como precipitado denso em elétrons indicativo de vesículas transcitóticas contendo HRP (Figura 3B,C) usando um microscópio eletrônico de transmissão (MET), demonstrando assim transcitose EC através do iBRB. Vesículas grandes potencialmente refletem macropinocitose (ponta de seta branca; Figura 3B), e pequenas vesículas provavelmente representam vesículas caveolares (pontas de seta brancas; Figura 3C). Além disso, a localização de cavéolas nos vasos sanguíneos da retina pode ser vista como cocoloração do anticorpo CAV-1 marcador de cavéolas com isolectina (marcador CE) no vaso sanguíneo sob microscópio de fluorescência (Figura 3D). Vesículas caveolares positivas para CAV-1 foram identificadas sob MET por anticorpos CAV-1 marcados com imunoouro (pontos pretos; Figura 3E) dentro das células endoteliais vasculares da retina. Os protocolos para os estudos in vivo podem ser obtidos de Wang et al.24.

O tratamento com VEGF aumenta a permeabilidade vascular em HRMECs medida pela resistência elétrica transendotelial (TEER)
Antes de realizar os ensaios de transcitose CE, os HRMECs devem ser cultivados até a confluência total, mostrando a morfologia característica do paralelepípedo, que pode ser observada sob um microscópio de luz. A confluência de células cheias pode ser validada pela medição da resistência elétrica transendotelial (TEER) (Figura 4A), com leituras atingindo ~20 Ω·cm2 para HRMECs confluentes30, sugestivos de baixos níveis de transporte paracelular através da monocamada através de junções apertadas ou gap. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi usado como exemplo para demonstrar a medida do TEER. O tratamento de HRMECs com VEGF reduziu significativamente os níveis de TEER, refletindo o aumento da permeabilidade do HRMEC (Figura 4B). Uma redução nos valores de TEER também foi observada nas células controle, potencialmente devido à duração da cultura e múltiplas medidas realizadas em diferentes intervalos de tempo que podem ser prejudiciais às células31.

O transporte de Cy3-transferrina pode ser utilizado para avaliar a transcitose CE mediada por clatrina em HRMECs
Para a transcitose EC mediada por clatrina, os HRMECs confluentes cultivados em membrana porosa foram incubados com transferrina fluorescente (Cy3) para detectar seu transporte através das CEs (Figura 5A). Este ensaio explora o fato de que o transporte de transferrina é um processo de transcitose mediado por receptor. A endocitose de Cy3-transferrina (vermelho) foi observada em monocamada HRMEC co-corada com coloração nuclear, DAPI (azul) (Figura 5B), confirmando sua captação nas células. A intensidade de fluorescência da transferrina marcada com (Cy3) pode ser quantificada a partir de imagens para avaliar o processo de endocitose e/ou medida a partir do meio coletado da câmara basolateral dos poços para quantificar os níveis de transcitose mediada por clatrina27.

A via de sinalização Wnt regula a transcitose CE mediada por cavéolas em HRMECs em um ensaio baseado em HRP
Anteriormente, verificou-se que a sinalização Wnt regula a transcitose mediada por cavéolas dependentes de MFSD2A em ECs vasculares da retina para manter o iBRB24. Os efeitos dos moduladores de Wnt foram avaliados em um ensaio de transcitose in vitro baseado em HRP (Figura 6A). HRMECs totalmente confluentes foram tratados com ativadores da via Wnt: meio condicionado Wnt3a (Wnt3a-CM) ou Norrin recombinante humano, com ou sem inibidor de sinalização Wnt/β-catenina XAV939, e os níveis de HRP transcitosada entre HRMECs foram detectados. O tratamento com Wnt3a-CM ou Norrin revelou níveis significativamente reduzidos de HRP transcitada, indicativos de transcitose caveolar reduzida. Além disso, o tratamento combinado com o inibidor de sinalização Wnt XAV939 demonstrou níveis regulados para cima de HRP transcitosada em HRMECs, obliterando assim os efeitos dos ativadores de Wnt na permeabilidade de HRMEC (Figura 6B,C)24.

Figure 1
Figura 1: Diferentes vias de transporte através do endotélio vascular da retina. Ilustração esquemática mostrando diferentes rotas de fluxo molecular através de células endoteliais microvasculares da retina (RMECs). O transporte através das células endoteliais vasculares da retina dentro da barreira hemato-retiniana interna ocorre através de duas vias principais: vias paracelulares e transcelulares, incluindo a transcitose. Essa figura foi adaptada com permissão de Yemanyi et al.5. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Visão geral das vias de transporte vesicular transcitótico através das células endoteliais e sua respectiva avaliação in vitro . Nas células endoteliais (CE), a translocação transcelular de macromoléculas ocorre através de três tipos principais de vesículas: vesículas caveolares (50-100 nm), vesículas revestidas de clatrina (70-150 nm) ou macropinossomos independentes de clatrina (200-500 nm). As cavéolas são microdomínios esféricos, ricos em lipídios em forma de frasco, na membrana plasmática, compostos por caveolina e cavinas. Os níveis de transcitose através dessas vesículas podem ser determinados por ensaios in vitro à base de fluorescência em cultura CE usando peroxidase de rábano (HRP) combinada com substrato fluorescente, transferrina marcada com fluorescente (Cy3-Tf) ou albumina sérica bovina marcada com tetrametilrodamina (TMR-BSA) para transcitose mediada por cavéolas, transcitose mediada por clatrina e macropinocitose, respectivamente, para avaliar a permeabilidade da barreira hemato-retiniana interna (iBRB). Embora cada via tenha características e mecanismos de transporte distintos, pode ocorrer sobreposição de função e transporte de substâncias, particularmente entre o transporte caveolar e a macropinocitose, sendo ambos independentes da clatrina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Visualização da transcitose CE na retina. (A) A imagem do microscópio de luz mostra um lúmen de vaso sanguíneo cheio de HRP de uma seção retiniana de camundongo do tipo selvagem (WT) de 3 meses de idade, corada com 3,3'-diamino benzidina (DAB) (preto). A HRP foi injetada retroorbitalmente em camundongos WT, seguida de isolamento ocular e incorporação tecidual. Cortes finos foram corados com substrato DAB denso em elétrons para a detecção colorimétrica de HRP como precipitado marrom escuro e fotografados sob microscópio de luz para revelar HRP dentro do lúmen dos vasos sanguíneos da retina. (B,C) As amostras foram então processadas com corte ultrafino em microscópio eletrônico de transmissão (MET) para visualizar vesículas transcitóticas contendo HRP, representando transcitose de CE em todo o iBRB. As imagens TEM mostram uma seção da retina de um camundongo WT de 3 meses de idade com lúmen de vasos sanguíneos cheio de HRP e vesículas contendo HRP dentro de RMECs. (B) Uma vesícula grande ocasional reflete potencialmente o macropinossomo (cabeça de seta) dentro das CEs, com a presença de glóbulos vermelhos (asterisco) no lado luminal. (C) Vesículas pequenas são provavelmente vesículas caveolares (pontas de seta). (D) A cocoloração imuno-histoquímica do anticorpo CAV-1 (verde) e da isolectina B 4 (IB4, vermelho, marcador CE) demonstra a localização do CAV-1 nos vasos sanguíneos da retina na retina de camundongos WT de 3 meses de idade (DAPI, azul). (E) Imagem TEM de CAV-1 marcado com imunoouro (pontos pretos, setas) dentro das CEs da retina; a inserção mostra uma imagem ampliada de uma vesícula caveolar positiva para CAV-1. Abreviaturas: HRP = peroxidase de rábano; GCL = camada de células ganglionares; IPL = camada plexiforme interna; INL = camada nuclear interna; OPL = camada plexiforme externa; ONL = camada nuclear externa; PSE = epitélio pigmentar da retina; E = célula endotelial; e L = lúmen dos vasos sanguíneos. Ampliação: (A, D) 20x. Barras de escala: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm e (C,E) 200 nm. O Painel (E) foi adaptado com permissão de Wang et al.24. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Validação de HRMECs totalmente confluentes e aumento da permeabilidade vascular em HRMECs após tratamento com VEGF. (A) Diagrama esquemático mostrando o posicionamento de eletrodos nas câmaras apical e basolateral dos poços para medição da resistência elétrica transendotelial (TEER) como avaliação da permeabilidade vascular e integridade da monocamada celular. (B) Gráfico mostrando os registros TEER de HRMECs totalmente confluentes com e sem tratamento prévio com fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). O tratamento com VEGF após 18 h (18 H) resulta em TEER reduzido em HRMECs totalmente confluentes31. p≤0,001. O painel (B) foi adaptado com permissão de Tomita et al.31. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Uma ilustração esquemática do ensaio de transcitose CE mediada por clatrina em HRMECs usando transferrina (Tf). (A) HRMECs foram cultivados até a confluência total em pastilhas revestidas de gelatina e o soro passou fome durante a noite a 37 °C antes do ensaio. As células foram incubadas apicamente com transferrina fluorescente conjugada com Cy3 (Cy3-Tf) por 60 min a 37 °C. Após a incubação, as células foram lavadas intensamente com um meio fresco para remover Cy3-Tf extracelular não ligado. As inserções contendo meio fresco foram então transferidas para uma nova placa contendo meio quente na câmara basolateral, e as células foram incubadas a 37 °C por mais 90 min para liberar Cy3-Tf endocitosado. O meio da câmara basolateral pode ser coletado, e a intensidade de fluorescência correspondente à transcitose EC dependente de clatrina (Cy3-Tf) pode ser medida usando um leitor de placas de fluorescência. (B) Cy3-transferrina (vermelho) foi observada em HRMECs corados com DAPI (azul), confirmando endocitose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A sinalização Wnt regula a transcitose HRMEC mediada por cavéolas em um ensaio in vitro baseado em HRP. (A) Ilustração esquemática demonstrando o ensaio baseado em HRP para avaliar a transcitose mediada por cavéolas. Os HRMECs totalmente confluentes cultivados em pastilhas revestidas com gelatina foram submetidos à fome de soro durante a noite em meio fetal bovino (FBS) a 0,5% + EBM a 37 °C antes do tratamento. A monocamada CE na câmara apical foi tratada com o tratamento desejado por 24 h a 37 °C. Posteriormente, as células foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) a 37 °C por 15 min e lavadas intensamente para remoção da HRP extracelular livre. Inserções contendo meio fresco foram então transferidas para uma nova placa contendo meio quente em câmaras basolaterais, e as células foram incubadas por mais 90 min a 37 °C. O meio da câmara basolateral foi coletado e os níveis de HRP foram quantificados por reação com substrato fluorogênico de peroxidase. A fluorescência correspondente à transcitose EC mediada por cavéolas foi medida usando um leitor de placas de fluorescência. (B,C) Neste exemplo, as células foram tratadas com moduladores de via Wnt: meio condicionado Wnt3a (Wnt3a-CM) ou seu meio condicionado por controle (Ctrl-CM), Norrin recombinante humano ou sua solução de controle (Ctrl) e com ou sem inibidor de sinalização Wnt/β-catenina (XAV939) ou seu controle de veículo (veículo). Seus efeitos sobre a transcitose caveolar HRMEC foram avaliados no ensaio baseado em HRP. Após o tratamento, os níveis de HRP transferidos para a câmara basolateral foram medidos, indicando níveis de transcitose CE mediada por cavéolas entre os HRMECs. Os ativadores Wnt reduziram os níveis de transcitose baseada em HRP, que foram revertidos pelo XAV939. * p≤0,05, ** p≤0,01. Os painéis (B) e (C) foram adaptados com permissão de Wang et al.24. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O BRB desempenha um papel essencial na saúde e na doença da retina. Técnicas in vitro que avaliam a permeabilidade vascular têm se mostrado ferramentas cruciais em estudos sobre o desenvolvimento e a função da barreira (BRB/BBB). O procedimento aqui descrito poderia ser utilizado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à transcitose CE ou avaliar moduladores moleculares relacionados que afetam a permeabilidade do BRB. In vitro Os ensaios de transcitose EC têm múltiplas vantagens em relação aos ensaios in vivo ou técnicas utilizadas para avaliar a permeabilidade vascular. Eles são rápidos de executar com alto rendimento e podem ser utilizados para analisar os efeitos de muitas variáveis diferentes ou moléculas isoladas de vias de sinalização específicas com modulação genética e farmacológica. O sistema de cultura CE pura oblitera a variação animal, como é frequentemente observado in vivo e também limita os efeitos de uma possível modificação ou endocitose das moléculas-alvo por outros tipos celulares32. O manuseio de células HRMEC é fácil, exigindo equipamentos básicos de cultura de células disponíveis na maioria dos laboratórios, e a cultura de células é muitas vezes mais econômica em comparação com experimentos animais in vivo. Embora os ensaios de transcitose in vitro não repliquem totalmente as condições fisiológicas in vivo33, podem ser ferramentas valiosas para complementar os estudos in vivo e avançar nosso conhecimento sobre o controle do BRB.

Vários parâmetros técnicos importantes requerem consideração, incluindo o tamanho dos poros da inserção do filtro, o tipo de substrato e a densidade de semeadura celular. Um tamanho de poro maior das inserções de filtro permeáveis poderia resultar em migração indesejável e crescimento de células na parte inferior da pastilha, confundindo a medição resultante e sua interpretação. Embora essa propensão possa variar com os diferentes tipos de células, os diâmetros dos poros ≤1 μm servem bem para a maioria dos tipos de células, incluindo ECs34. A escolha de um substrato adequado é um segundo passo crucial, pois algumas células demonstram maior polaridade e maior diferenciação quando cultivadas em substrato poroso e banhadas em meio de cultura de ambos os lados35,36. Os filtros de policarbonato microporoso tratados são uma alternativa melhor para as CE, pois são mais finos e proporcionam maior acesso dos reagentes à zona basolateral da monocamada com fluorescência de fundo mínima para imunoensaios35. Finalmente, para alcançar uma monocamada totalmente confluente, a densidade de semeadura celular deve ser otimizada com base no tipo específico de célula. Enquanto uma densidade de semeadura muito baixa pode afetar o estado de diferenciação, uma densidade de semeadura muito alta, por outro lado, pode favorecer a rápida ligação de células formando múltiplas camadas celulares em vez de uma monocamada, eventualmente alterando a morfologia celular e resultando em medição imprecisa da transcitose37.

A formação e a integridade da monocamada CE são cruciais para este ensaio e podem ser validadas pela medição dos valores de TEER para garantir a obtenção do TEER desejado. Um controle em branco, ou seja, uma inserção de filtro sem células, deve sempre ser incluído para medir os níveis basais de resistência através da membrana permeável a serem subtraídos daqueles das inserções celulares. Vários fatores como temperatura, número de passagem celular, composição do meio de cultura, duração da cultura e alterações no comprimento da junção podem causar pequenas variações nos valores de TEER 25,38,39. Os valores de TEER também são muito afetados por certos tratamentos, como o VEGF. Descoberto inicialmente como um potente indutor da permeabilidade dos vasos40, o VEGF afeta a permeabilidade vascular regulando o transporte paracelular, ou seja, através da fosforilação das proteínas de junção apertada ZO-1, occludina e a ruptura da proteína de junção apertada claudina-5 41,42, bem como do transporte transcelular 43 . A validação adicional da formação de monocamadas pode ser feita com o exame morfológico e a presença de proteínas de junção características com coloração. Ao longo da cultura, recomenda-se a troca de meios nas câmaras apical e basolateral em intervalos regulares para manter as células na condição ideal de cultura, com a faixa de pH ideal e a disponibilidade de nutrientes.

Os pesquisadores que usam este ensaio devem prestar atenção a uma característica inerente crítica das CEs cerebrais e retinianas: a polaridade apicobasal, que é uma marca celular do BBB44 e, da mesma forma, do BRB. A direção da transcitose é determinada pela distribuição relativa dos receptores-alvo proteicos de interesse e pela maquinaria de transcitose associada nos domínios apical/luminal vs. basolateral/abluminal da membrana CE. As CEs cerebrais e retinianas são capazes de liberar muitos fatores das membranas apical/luminal e basolateral/abluminal44. A transcitose da transferrina dependente de clatrina, curiosamente, parece ocorrer principalmente unidirecionalmente do lado sanguíneo para o cérebro ou a retina, uma vez que os receptores de transferrina estão predominantemente localizados na membrana apical/luminal45. A transcitose caveolar, por outro lado, ocorre bidirecionalmente e pode se originar da membrana apical/luminal ou basolateral/abluminal e atravessar para o outro lado, dependendo da localização da carga vesicular e seus receptores46. MFSD2A, um receptor lipídico transmembrana (para ácido docosahexaenóico de ácidos graxos ômega-3) e supressor de transcitose caveolar, também está localizado nos domínios apical/luminal das CEs23,47. A expressão de MFSD2A é regulada transcricionalmente pela sinalização Wnt para mediar seu impacto no controle do BRB, conforme ilustrado como exemplo neste protocolo24. A técnica aqui descrita, portanto, envolve a detecção de uma molécula traçadora colocada na câmara superior/apical após a captação pela monocamada CE e liberação na câmara inferior/basolateral, imitando a transcitose no apical/luminal/sangue para a direção basolateral/abulial/tecidual. Este protocolo pode ser modificado para detectar transcitose na direção oposta, colocando moléculas traçadoras na câmara inferior e monitorando a captação e liberação na câmara apical para atender à necessidade dos investigadores. Além disso, se necessário, uma etapa adicional para determinar o acúmulo/degradação intracelular da molécula-alvo ligada ao traçador endocitosado produziria uma medição adicional das vesículas transcitóticas remanescentes no citosol32.

O ensaio descrito tem muitas vantagens e serve como uma ferramenta essencial em estudos relacionados ao BRB/BBB, mas existem algumas limitações. É um sistema isolado desprovido de interações de outros tipos celulares do iBRB, como pericitos e células gliais, e, portanto, não poderia imitar exatamente o ambiente fisiológico in vivo. Os valores de TEER podem variar entre as medições devido a uma mudança de temperatura ou posicionamento dos eletrodos25,38. No entanto, equilibrar as células de 37 °C à temperatura ambiente antes das medições, o manuseio cuidadoso dos eletrodos e a inclusão de controles em branco podem ajudar a minimizar a flutuação. Além disso, mesmo com lavagem suficiente, o vazamento da via paracelular, embora em uma quantidade vestigial, não pode ser completamente descartado. A sobreposição do transporte de HRP entre diferentes rotas de transcitose, por exemplo, entre o transporte caveolar e a macropinocitose, ambos independentes da clatrina, também pode ocorrer. Conforme necessário, a distinção pode ser mais investigada usando moduladores e/ou inibidores específicos de cavéolas e micropinocitose.

Em resumo, este trabalho descreve um ensaio de transcitose in vitro que permite quantificar a transcitose mediada por cavéolas ou portadores em todo o BRB/BBB. O ensaio in vitro pode ser de grande ajuda no rastreamento de várias moléculas pró/antiangiogênicas31, moduladores de vias de sinalização24 ou sistemas de liberação de fármacos 27,48 referentes ao controle BRB/BBB. A investigação da polaridade CE e da transcitose direcional também pode se beneficiar desse sistema fácil de usar. Considerando a disponibilidade limitada de modelos in vitro para iBRB e pesquisa ocular, o procedimento aqui descrito também poderia ser modificado como um sistema de cocultura em conjunto com pericitos, astrócitos e culturas organotípicas 3D49, ou usando modelos avançados baseados em células, como sistemas neurovasculares microfisiológicos50, a fim de investigar melhor as interações celulares e imitar melhor as condições fisiológicas in vivo.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse ou interesses financeiros a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) para JC. A ZW foi apoiada por um Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

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Medicina Edição 184 Barreira hemato-retiniana cavéolas células endoteliais transcitose Wnt
Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo <em>In Vitro</em> para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina
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