Summary
Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.
Abstract
La moelle osseuse (BM) est le tissu mou présent dans les os où se produit principalement l’hématopoïèse, le processus par lequel de nouvelles cellules sanguines sont générées. En tant que tel, il contient des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), ainsi que des cellules stromales de soutien qui contribuent au maintien et à la régulation des HSPC. Les troubles hématologiques et autres troubles de la BM perturbent l’hématopoïèse en affectant directement les cellules hématopoïétiques et / ou par l’altération de la niche BM. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier l’hématopoïèse dans la santé et la malignité par l’analyse phénotypique des HSPC BM murins et des populations de niche stromale par cytométrie de flux. Notre méthode détaille les étapes requises pour enrichir les cellules BM en fractions BM endostéales et centrales, ainsi que les stratégies de contrôle appropriées pour identifier les deux principaux types de cellules de niche impliquées dans la régulation HSPC, les cellules endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. L’analyse phénotypique proposée ici peut être combinée avec des mutants murins, des modèles de maladie et des tests fonctionnels pour caractériser le compartiment HSPC et sa niche.
Introduction
La cytométrie de flux est une méthode inestimable pour caractériser et isoler prospectivement les cellules immunitaires et hématopoïétiques. Il est également de plus en plus utilisé pour analyser les populations stromales et épithéliales de différents tissus. La cellule souche hématopoïétique (CSH) possède des propriétés uniques d’auto-renouvellement et de multipotence. Chez les mammifères adultes, les CSH résident principalement dans la moelle osseuse (BM), où elles reçoivent des signaux de quiescence et de survie du microenvironnement environnant ou de la niche1. Les CSH sont formellement définies selon les essais fonctionnels2. Néanmoins, plusieurs articles de référence ont montré l’utilité de la cytométrie en flux pour identifier les CSH. Grâce à l’utilisation de marqueurs de surface cellulaire limités, il est possible de discriminer les populations hématopoïétiques fortement enrichies en CSH3. La cytométrie de flux est donc une méthode centrale dans le domaine des cellules souches. Il a été largement utilisé pour évaluer l’impact des types de cellules de niche putatives et des facteurs de niche sur les CSH. En combinant la cytométrie en flux avec l’imagerie et les tests fonctionnels, il a été démontré que les CSH sont soutenues de manière critique par les cellules souches mésenchymateuses périvasculaires (CSM) et les cellules endothéliales (CE). Les CSM BM sont un groupe hétérogène et ont des contributions différentes en cytokines4, mais il est bien établi que les CSM récepteurs de la leptine (LepR) + sont des cellules de niche clés1. Les EC BM sont également très hétérogènes et peuvent faire partie de sinusoïdes, d’artérioles et de vaisseaux de type H / transitionnels5. Différentes études ont montré la contribution nuancée de ces différentes CE. Par exemple, les EC sinusoïdales endostéales sont spatialement plus proches des CSH6 quiescentes, tandis que les CSH non migratrices avec des niveaux plus faibles d’espèces réactives de l’oxygène sont situées près des CE artériolaires7. L’emplacement endosté par rapport à l’emplacement central des niches est également très important. Les vaisseaux endostéaux de type H sont associés aux cellules stromales périvasculaires qui sont perdues avec le vieillissement, entraînant la perte de CSH8. Dans la leucémie myéloïde aiguë, les EC centrales sont élargies, tandis que les vaisseaux endostés et les CSH endostéales sont perdus9.
La plupart des études dans le domaine se sont concentrées sur l’hématopoïèse elle-même et sur la régulation extrinsèque des CSH par la cellule. Il est toutefois de plus en plus reconnu qu’il est nécessaire de mieux caractériser les niches qui régulent d’autres progéniteurs, à savoir les progéniteurs multipotents (MPP), d’autant plus qu’ils sont les principaux moteurs de l’hématopoïèse à l’état d’équilibre10. Contrairement à une structure hiérarchique fixe, des études récentes ont montré que l’hématopoïèse est un continuum dans lequel les CSH se différencient en MPP biaisés à un stade précoce11. Les MPP ont été nommés d’après différents schémas de classification12, mais un récent document de consensus de la Société internationale d’hématologie expérimentale (ISEH) a proposé que les MPP soient discriminés en tant que MPP précoces et en fonction de leur biais lymphoïde (MPP-Ly), mégacaryocytaire et érythroïde (MPP-Mk/E) et myéloïde (MPP-G/M)13. L’utilisation de la cytométrie de flux sera essentielle pour étudier plus avant l’importance des niches BM dans la régulation de ces populations. Les méthodes actuelles de cytométrie en flux utilisent des stratégies de contrôle variables pour différencier les HSPC et identifier les cellules stromales, à savoir les CE, à l’aide de marqueurs incohérents. L’objectif de la méthode actuelle est de présenter un flux de travail simple et reproductible de coloration BM pour identifier les sous-populations HSPC, les groupes hétérogènes de CE et les CSM LepR+. Nous pensons que cette technique, bien que comparable aux méthodes précédemment rapportées (voir, par exemple, la référence 14), fournit un protocole mis à jour et facile à mettre en œuvre pour l’analyse phénotypique des cellules hématopoïétiques dans les deux zones fonctionnelles de la moelle osseuse, endostéale et centrale BM 8,15, ainsi que des cellules de niche stromale BM.
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Protocol
Les animaux utilisés dans ce protocole ont été hébergés à l’animalerie i3S dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques dans un cycle lumière-obscurité de 12 heures et dans un environnement à température contrôlée. L’accès gratuit à la nourriture standard pour rongeurs et à l’eau était fourni. Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté selon les critères définis par la Fédération des associations européennes de science des animaux de laboratoire pour le soin et la manipulation des animaux de laboratoire (directive européenne 2010/63/UE). La procédure expérimentale pratiquée sur les animaux (euthanasie) a été approuvée par le Comité d’éthique animale i3S (réf. DD_2019_15) et la Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Les détails des matériaux utilisés tout au long de ce protocole se trouvent dans le tableau des matériaux.
1. Préparation de solutions et de cocktails de coloration
- Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : Dissoudre cinq comprimés de PBS dans 1 L d’eau distillée. Conserver à température ambiante (RT).
- Sérum fœtal bovin (FBS) à 2 % PBS : Ajouter 10 mL de FBS à 500 mL de PBS. Conserver à 4 °C.
- Tampon de lyse des globules rouges (1x) : Ajouter 50 mL de tampon de lyse des globules rouges 10x à 450 mL d’eau désionisée. Conserver à 4 °C.
- Solution de collagénase IV et de dispase II : Dissoudre 30 mg de collagénase IV et 60 mg de dispase II dans 30 mL de HBSS pour une solution de collagénase IV à 1 mg/mL et de dispase II à 2 mg/mL. Préparer frais avant utilisation.
- Solution de blocage des récepteurs Fc : Ajouter 10 μL d’anticorps anti-souris CD16/32 purifié à 490 μL de PBS FBS à 2 %. Préparez frais ou la veille. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Solution de coloration de viabilité cellulaire fluorescente : Ajouter 2 μL de colorant de viabilité cellulaire fluorescente à 1 mL de PBS. Préparer frais avant utilisation.
- Cocktail de lignée de biotine : Mélanger 100 μL de chacun des anticorps suivants : biotine anti-souris CD3ε, biotine anti-souris CD4, biotine anti-souris CD8a, biotine anti-souris/humaine CD11b, biotine anti-souris/humaine CD45R/B220, biotine anti-souris Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) et biotine anti-souris TER-119/cellules érythroïdes. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Cocktail de coloration primaire HSC : Ajouter 10 μL de cocktail de lignée biotine, 10 μL de CD150 anti-souris (SLAM) marqué par immunofluorescence, 10 μL de FLK2 anti-souris (CD135) phycoérythrine (PE), 10 μL de Ly-6A/E (Sca-1) anti-souris Perdinine-chlorophylle-protéine (PerCP) et 10 μL d’allophycocyanine (APC)/Cyanine7 anti-souris CD117 (c-kit) à 940 μL de PBS 2% FBS. Préparez frais ou la veille. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation.
- Cocktail de coloration primaire stromale : Ajouter 5 μL d’anticorps biotinylé contre la leptine R de souris, 6,7 μL d’anticorps anti-endomucine de souris PE, 10 μL de Ly-6A/E (Sca-1) anti-souris PerCP, 4 μL de CD31 anti-souris PE/Cyanine7, 10 μL de CD45 anti-souris APC/Cyanine7 et 10 μL de cellules TER-119/érythroïdes anti-souris APC/Cyanine7 à 954 μL de PBS FBS à 2 % FBS. Préparez frais ou la veille. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation.
- Solution de coloration secondaire HSCs/stromal : Ajouter 1 μL de streptavidine APC à 1 mL de PBS FBS à 2 %. Préparez frais ou la veille. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation.
- Cocktail de coloration des CE : Ajouter 10 μL d’anticorps anti-endomucine anti-souris PE, 10 μL de PerCP anti-souris Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de PE/Cyanine7 anti-souris CD31, 10 μL d’Alexa Fluor 647 anti-souris CD54/ICAM-1, 10 μL d’APC/Cyanine7 anti-souris CD45 et 10 μL de cellules anti-souris APC/Cyanine7 TER-119/érythroïdes à 940 μL de PBS 2% FBS. Préparez frais ou la veille. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation.
- Solution de coloration DAPI: Ajouter 1 goutte de réactif DAPI à 500 μL de PBS. Préparer frais avant utilisation.
2. Extraction d’échantillons
- Euthanasier l’animal par luxation cervicale (les détails des animaux utilisés pour produire les données présentées dans cette étude se trouvent dans le tableau supplémentaire 1). Placez l’animal avec le ventre vers le haut sur une boîte de Petri et vaporisez avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision au-dessus de l’abdomen à l’aide de ciseaux et retirez la peau jusqu’aux chevilles.
- Prenez une jambe et, à l’aide de ciseaux, coupez-la à son bas (où se trouve l’articulation entre la jambe et la hanche) pour la séparer de l’animal. Cette étape servira également de méthode secondaire de confirmation de l’euthanasie. Retirez le pied de la jambe en coupant à la cheville. Placez la jambe dans du PBS glacé à 2% FBS. Si nécessaire, répétez l’étape avec l’autre jambe.
- Saisissez l’os de la hanche et, à l’aide de ciseaux, coupez derrière lui pour le séparer de l’animal. Placez l’os de la hanche dans du PBS glacé à 2% FBS. Si nécessaire, répétez l’étape avec l’autre os de la hanche.
- Placez la jambe et l’os de la hanche dans une boîte de Petri et, à l’aide d’un scalpel stérile, nettoyez les os. Séparez le tibia et le fémur en coupant au genou avec le scalpel. Placez les os propres dans du PBS glacé à 2% FBS.
3. Traitement des échantillons pour l’analyse des populations de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse totale
- Placez un fémur ou un tibia dans un mortier avec du PBS 2% FBS glacé et écrasez l’os en le pressant doucement contre la paroi du mortier à l’aide du pilon. Les cellules BM sont libérées dans la solution contenue dans le mortier.
- Pipeter la suspension cellulaire résultante de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 mL pour homogénéiser et transférer dans un tube de 50 ml à travers une crépine cellulaire de 40 μm placée sur le dessus du tube.
- Si les os broyés ne semblent pas blancs à ce stade, ajoutez plus de PBS FBS à 2% au mortier et répétez le broyage, puis pipeter de haut en bas et transférer la solution dans le même tube de 50 ml à travers la même passoire cellulaire de 40 μm.
- Rincer le mortier avec un peu plus de PBS FBS à 2% et transférer la solution dans le même tube de 50 ml à travers la même crépine cellulaire de 40 μm. Centrifuger le tube de 50 mL à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (1x) à TA en remontant et en descendant plusieurs fois. Après une incubation de 2 minutes à TA, ajouter 15 mL de PBS 2% FBS.
- Centrifuger le tube de 50 mL à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Si la pastille de cellule semble toujours rougeâtre, revenez à l’étape 3.5. Sinon, jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 200 μL de PBS et transférez la suspension de la cellule dans un puits d’une plaque de fond en V de 96 puits pour la coloration.
- Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C. Jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de solution de coloration fluorescente. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Plaque de centrifugation à 500 x g pendant 3 min à 4 °C. Jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de PBS 2% FBS pour le laver.
- Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C, jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de solution de blocage des récepteurs Fc. Incuber la plaque pendant 10 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C, jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de cocktail de coloration primaire HSC. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C, éliminer le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de solution de coloration secondaire HSC. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C et jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant.
- Remettez la pastille en suspension dans 250 μL de PBS 2% FBS et transférez la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Gardez sur la glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.
REMARQUE: Si vous souhaitez déterminer le nombre absolu de populations de cellules hématopoïétiques, ajoutez des billes de calibrite aux tubes de polystyrène avant l’analyse dans le cytomètre16.
4. Traitement des échantillons pour l’analyse des populations de cellules stromales dans la moelle osseuse totale
- Placez un fémur ou un tibia dans un mortier avec du PBS 2% FBS glacé et écrasez l’os en le pressant doucement contre la paroi du mortier à l’aide du pilon. Coupez la pointe d’une pointe P1000 à l’aide de ciseaux et utilisez-la pour transférer tout le contenu du mortier dans un tube de 50 ml (ne passez pas à travers une passoire cellulaire).
- Centrifuger le tube de 50 mL à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 mL de collagénase IV et de solution de dispase II. Incuber le tube à 37 °C pendant 40 min.
- Complétez le tube à 25 ml avec du PBS 2% FBS et du vortex à mélanger. Transférer le contenu du tube de 50 mL dans un nouveau tube de 50 mL à l’aide d’une crépine à cellules de 100 μm. Ajouter 15 mL de PBS 2% FBS à l’ancien tube de 50 mL et transférer la solution dans le même nouveau tube de 50 ml à travers la même crépine cellulaire. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (1x) à TA en remontant et en descendant plusieurs fois. Après une incubation de 2 minutes à TA, ajouter 15 mL de PBS 2% FBS.
- Centrifuger le tube de 50 mL à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Si la pastille de cellule semble toujours rougeâtre, revenez à l’étape 4.4. Sinon, jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 200 μL de PBS FBS à 2% et transférez la suspension de la cellule dans un puits d’une plaque de fond en V de 96 puits pour la coloration. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Si vous effectuez une coloration stromale, passez à l’étape 4.7. Si vous effectuez une coloration CE, passez à l’étape 4.12.
- Jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre en suspension la pastille dans 100 μL de cocktail de coloration primaire stromale. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C, éliminer le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de solution de coloration secondaire stromale. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C. Jetez le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant.
- Remettez la pastille en suspension dans 250 μL de PBS 2% FBS et transférez la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Gardez sur la glace à l’abri de la lumière.
- Juste avant d’aller au cytomètre, ajoutez 35 μL de solution de coloration DAPI dans le tube contenant la suspension cellulaire pour l’analyse par cytométrie en flux et incuber le tube à TA pendant 5 min dans l’obscurité. Après cette incubation, garder sur la glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.
- Jeter le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant et remettre en suspension la pastille dans 100 μL de cocktail de coloration ECs. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Jetez le surnageant en retournant la plaque sur du papier absorbant. Remettez la pastille en suspension dans 250 μL de PBS 2% FBS et transférez la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Gardez sur la glace à l’abri de la lumière.
- Juste avant d’aller au cytomètre, ajoutez 35 μL de solution de coloration DAPI dans le tube contenant la suspension cellulaire pour l’analyse par cytométrie en flux et incuber le tube à TA pendant 5 min dans l’obscurité. Après cette incubation, garder sur la glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.
REMARQUE: Si vous souhaitez déterminer le nombre absolu de populations de cellules stromales et endothéliales, ajoutez des billes de calibrite aux tubes de polystyrène avant l’analyse dans le cytomètre16.
5. Traitement des échantillons pour l’analyse des populations de cellules hématopoïétiques dans la BM broyée et rincée
- Placez un fémur sur une boîte de Petri et coupez les extrémités de l’os à l’aide d’un scalpel stérile.
- Rincer la partie centrale de l’os (diaphyse) en faisant passer 100 μL de PBS 2% FBS à l’intérieur de l’os une fois de chaque côté à l’aide d’une seringue à insuline 0,5 mL sans volume mort et en recueillant la solution dans un tube microcentrifuge contenant 1 mL de PBS 2% FBS. Ensuite, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL étiqueté BM rincé contenant 4 mL de PBS 2% FBS. Restez sur la glace.
- Placez les extrémités de l’os dans un mortier avec du PBS 2% FBS glacé et écrasez-le en le pressant doucement contre la paroi du mortier à l’aide du pilon. Pipeter la suspension cellulaire résultante de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 mL pour homogénéiser et transférer dans un tube de 50 mL étiqueté BM écrasé à travers une crépine cellulaire de 40 μm.
- Si l’os écrasé n’a pas l’air blanc à ce stade, ajoutez plus de PBS 2% FBS au mortier et répétez l’écrasement. Ensuite, pipeter de haut en bas et transférer la solution dans le même tube de 50 ml (BM broyé) à travers la même crépine cellulaire de 40 μm.
- Rincer le mortier avec un peu plus de PBS FBS à 2% et transférer la solution dans le même tube de 50 ml (BM broyé) à travers la même crépine cellulaire de 40 μm.
- Centrifuger les tubes de 50 mL correspondant aux échantillons rincés et broyés à 500 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Suivez les étapes 3.5 à 3.13 (section 3) avec les échantillons de BM rincés et broyés.
6. Préparation de contrôles unicolores (CSC) pour l’analyse par cytométrie en flux
- Suivez les étapes 3.1 à 3.6 (section 3) avec un os supplémentaire provenant de l’un des animaux non utilisés pour l’analyse principale, en transférant la suspension cellulaire finale dans un tube microcentrifuge contenant 1 mL de PBS FBS à 2 % au lieu d’un puits d’une plaque de fond en V à 96 puits.
- Transférer 100 μL de la suspension cellulaire dans 8 puits d’une plaque à fond en V de 96 puits, 100 μL dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL contenant 100 μL de PBS 2% FBS étiqueté comme DAPI SCC, et la suspension cellulaire restante dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL contenant 100 μL de PBS 2% FBS étiqueté comme non coloré. Gardez les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière.
- Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C et éliminer les surnageants en retournant la plaque sur du papier absorbant.
- Remettez en suspension une pastille dans 100 μL de solution de colorant fluorescent et les autres dans 100 μL de PBS FBS à 2%.
- Ajouter 0,5 μL des anticorps suivants, à l’exception du cocktail lignée d’anticorps pour lequel ajouter 2 μL et de l’anticorps PECy7 CD31 pour lequel ajouter 0,3 μL, à chacun des puits avec suspension cellulaire dans PBS 2% FBS (un anticorps par puits, les mêmes anticorps utilisés dans les panels d’analyse principaux ou les mêmes anticorps fluorophores avec une intensité de fluorescence et une abondance d’épitopes similaires): cocktail de lignée de biotine, marqué par immunofluorescence 510 anti-souris CD150 (SLAM), PE anti-souris Flk2 (CD135), PerCP anti-souris Ly-6A / E (Sca-1), 647 anti-souris CD54 / ICAM-1 marqués par immunofluorescence, PE / Cyanine7 anti-souris CD48 et APC / Cyanine7 anti-souris CD117 (c-kit). Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS à chaque puits et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C et éliminer les surnageants en retournant la plaque sur du papier absorbant.
- Remettez en suspension toutes les pastilles sauf celle correspondant aux cellules incubées avec le cocktail lignée d’anticorps dans 180 μL de PBS 2% FBS et transférez les suspensions cellulaires dans des tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL à travers des crépines cellulaires de 40 μm. Gardez sur la glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.
- Resuspendre les cellules incubées avec le cocktail lignée d’anticorps dans 100 μL de solution de coloration secondaire HSCs/stromal. Incuber l’assiette pendant 15 min à TA dans l’obscurité.
- Ajouter 100 μL de PBS 2% FBS et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour le laver. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Resuspendre la pastille dans 180 μL de PBS 2% FBS et transférer la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Gardez sur la glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.
- Juste avant d’aller au cytomètre, ajoutez 35 μL de solution de coloration DAPI dans le tube DAPI SCC et incuber le tube à TA pendant 5 min dans l’obscurité. Après cette incubation, garder sur la glace à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.
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Representative Results
Des diagrammes représentatifs de l’analyse par cytométrie en flux des CSH et des MPP chez une jeune souris C57Bl/6 en bonne santé sont présentés à la figure 1. La stratégie de contrôle suit la dernière nomenclature d’harmonisation proposée par l’ISEH13. Lors de l’analyse de l’impact d’une perturbation, telle qu’une infection ou un cancer, il est important d’utiliser une souris témoin comme référence pour les portes normales. Les contrôles de fluorescence moins un (FMO) peuvent être particulièrement utiles pour délimiter les limites des portes, mais il convient de noter que la mise en place aveugle de limites de portes basées sur les FMO peut omettre des cellules cibles ou inclure des cellules non cibles. Par exemple, plus l’intensité de l’ensemble CD48 est faible, plus l’enrichissement pour les CSH quiescents à long terme17 est élevé. De plus, les différentes propriétés de certaines populations dépendent de l’intensité de marqueurs spécifiques. Par exemple, les CSH exprimant des taux plus élevés de CD150 sont plus biaisées myéloïdes18.
Les fréquences et les nombres absolus obtenus dans l’analyse des populations de cellules hématopoïétiques appliquées à un total de quatre animaux sont présentés dans le tableau 1.
La figure 2 montre des diagrammes représentatifs de l’analyse par cytométrie en flux des CE et des CSM. La majorité des cellules hématopoïétiques sont exclues suite à une sélection négative Ter119/CD45. Les CSM LepR+ peuvent alors être facilement identifiées, tandis que les vraies CE nécessitent une sélection ultérieure de cellules Sca-1+. Alors que Sca-1 est souvent utilisé dans les études d’immunofluorescence pour marquer spécifiquement les artérioles, ce n’est pas le cas en cytométrie de flux, car cette technique est très sensible, et les EC expriment toujours un certain degré (même faible) de Sca-1 à la surface de la cellule. En ne sélectionnant pas uniquement les cellules Sca-1+, d’autres cellules non endothéliales seraient incluses dans l’analyse, telles que les cellules myéloïdes exprimant CD31, ce qui pourrait avoir un impact significatif sur la quantification des EC dans le BM. Les EC peuvent être analysées comme une population entière ou basées sur des marqueurs spécifiques qui révèlent partiellement leur hétérogénéité. L’endomucine en association avec CD31 est très utile pour identifier l’endothélium 15 de typeH fonctionnellement distinct (Figure 2). De plus, il a déjà été démontré que l’expression de la CIAM-1 permet la discrimination entre les CE artériolaires (aBMEC) et sinusoïdales (sBMEC) (Figure 3)20.
Les fréquences et les nombres absolus obtenus dans l’analyse des CSM et des populations de cellules endothéliales appliquées à un total de quatre animaux sont présentés dans les tableaux 2 et 3.
Bien que les zones fonctionnelles de BM ne soient pas clairement délimitées dans des régions histologiques évidentes, il est bien établi que les zones endostéales de la muqueuse osseuse et les zones centrales de BM sont enrichies dans certains types et événements cellulaires (p. ex. la libération de plaquettes/proplaquettes par les mégacaryocytes dans les sinusoïdes des zones centrales de BM). Il est donc utile d’enrichir pour les types cellulaires dans les zones centrales et endostéales d’analyser séparément ces deux compartiments. Nous avons appliqué une méthode de rinçage de la diaphyse pour enrichir pour les types de cellules centrales et d’écrasement de la métaphyse pour enrichir pour les types de cellules endostéales (Figure 4A). La quantification des BMEC et des sBMEC dans les tissus BM rincés (central) et écrasés (endosté) (Figure 4B) valide l’applicabilité de cette méthode d’isolation mécanique, car les BMEC sont notoirement plus abondantes dans les régions endostéales et les sinusoïdes sont plus fréquentes dans les zones centrales BM.
Figure 1 : Analyse des populations de cellules hématopoïétiques. Graphiques représentatifs montrant la stratégie de déclenchement pour l’analyse par cytométrie en flux des populations de cellules hématopoïétiques dans la BM totale à l’aide du logiciel fourni. Abréviations : FSC-H = diffusion vers l’avant - hauteur, FSC-A = diffusion vers l’avant - surface, Lin = lignée, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ cellules progénitrices hématopoïétiques, MPPLy = progéniteurs multipotents - lymphoïdes, MPPG/M = progéniteurs multipotents - granulocytes/macrophages, MPPMk/E = progéniteurs multipotents - mégacaryocyte/érythrocyte, MPP = progéniteurs multipotents, CSH = cellules souches hématopoïétiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse des populations de cellules stromales. Graphiques représentatifs montrant la stratégie de déclenchement pour l’analyse par cytométrie en flux des cellules stromales dans la BM totale à l’aide du logiciel fourni. Abréviations : FSC-H = diffusion vers l’avant - hauteur, FSC-A = diffusion vers l’avant - surface, CSM = cellules souches mésenchymateuses, LepR = récepteur de la leptine, EC = cellules endothéliales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse des cellules endothéliales. Graphiques représentatifs montrant la stratégie de déclenchement pour l’analyse par cytométrie en flux des CE dans la BM totale à l’aide du logiciel fourni. Abréviations : FSC-H = diffusion vers l’avant - hauteur, FSC-A = diffusion vers l’avant - surface, EC = cellules endothéliales, aBMEC = cellules endothéliales de la moelle osseuse artérielle, sBMEC = cellules endothéliales sinusoïdales de la moelle osseuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Analyse des populations EC dans les zones centrales et endostéales . (A) Représentation des différentes parties d’un os long murin. (B) Graphiques montrant les différences statistiquement significatives dans les fréquences des cellules endothéliales CD31+ dans les aBMEC (enrichies dans l’échantillon broyé) et les sBMEC (enrichies dans l’échantillon rincé). Chaque point représente une souris (n = 9) et les échantillons sont appariés. Le test statistique utilisé était le test T apparié. indique une valeur P bilatérale < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Population cellulaire | Moyenne de la fréquence des cellules vivantes BM ± SD (n = 4) dans la BM totale | Moyenne du nombre de cellules ± ET (n = 4) par fémur dans la BM totale | Moyenne de la fréquence des cellules vivantes BM ± SD (n = 4) dans la BM endostéale | Moyenne de la fréquence des cellules vivantes BM ± SD (n = 4) dans la BM centrale |
| Lin- | 3,05 ± 0,13 | 337610 ± 59414 | 3,56 ± 0,21 | 3,53 ± 0,19 |
| LKS | 0,096 ± 0,026 | 10206 ± 1794 | 0,102 ± 0,025 | 0,133 ± 0,022 |
| DéputésLy | 0,058 ± 0,011 | 6141 ± 716 | 0,058 ± 0,011 | 0,085 ± 0,007 |
| DéputésG/M | 0,011 ± 0,004 | 1233 ± 326 | 0,013 ± 0,003 | 0,014 ± 0,003 |
| MPPMk/E | 0,0010 ± 0,0002 | 113 ± 21 | 0,0014 ± 0,0004 | 0,0012 ± 0,0005 |
| Députés provinciaux | 0,0092 ± 0,0045 | 940 ± 374 | 0,0105 ± 0,0048 | 0,0118 ± 0,0061 |
| CSS | 0,0054 ± 0,0023 | 572 ± 191 | 0,0055 ± 0,0023 | 0,0059 ± 0,0016 |
Tableau 1 : Données quantitatives pour les populations de cellules hématopoïétiques. Moyenne de la fréquence dans les cellules vivantes BM des différentes populations de cellules hématopoïétiques analysées en nombre total de BM endostéale et centrale et en numération cellulaire par fémur dans la BM totale. Données présentées sous forme d’écart type moyen ± (ET), n = 4.
| Population cellulaire | Moyenne de la fréquence des cellules vivantes BM ± SD (n = 4) | Moyenne du nombre de cellules ± écart-type (n = 4) par tibia |
| Ecs | 0,080 ± 0,011 | 4523 ± 1521 |
| CE de type H | 0,041 ± 0,006 | 2299 ± 752 |
| CE de type L | 0,038 ± 0,005 | 2103 ± 736 |
| Les CSM | 0,180 ± 0,048 | 10270 ± 4282 |
Tableau 2 : Données quantitatives pour les populations de cellules stromales. Moyenne de la fréquence dans les cellules vivantes BM et du nombre de cellules par tibia pour les différentes populations de cellules stromales analysées dans la BM totale. Données présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET), n = 4.
| Population cellulaire | Moyenne de la fréquence des cellules vivantes BM ± SD (n = 4) | Moyenne du nombre de cellules ± écart-type (n = 4) par tibia |
| Ecs | 0,064 ± 0,006 | 2255 ± 150 |
| aBMEC | 0,041 ± 0,010 | 1419 ± 286 |
| sBMEC | 0,023 ± 0,006 | 819 ± 250 |
Tableau 3 : Données quantitatives pour les populations de cellules endothéliales. Fréquence moyenne dans les cellules vivantes BM et numération cellulaire par tibia pour les différentes populations de cellules endothéliales analysées dans la BM totale. Données présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET), n = 4.
Tableau supplémentaire 1 : Détails des animaux utilisés dans l’étude. La souche, le sexe, l’âge et le poids des animaux utilisés pour produire les données présentées à la figure 1, à la figure 2 et à la figure 3 et au tableau 1, au tableau 2 et au tableau 3. Abréviation : g = grammes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Bien que le protocole décrit soit simple et facile à exécuter, une attention particulière doit être portée à des étapes spécifiques. Par exemple, lors de l’obtention d’une BM rincée (étape 5.2), le volume ou le nombre de fois indiqué pour faire passer PBS 2% FBS à l’intérieur de la partie centrale de l’os ne doit pas être dépassé, car cela pourrait entraîner une contamination importante de l’échantillon rincé par des populations de cellules endosteales.
Des modifications peuvent être apportées au protocole pour faciliter son exécution par l’investigateur. Lors de l’extraction d’échantillons (section 2), les pattes et/ou les os peuvent être conservés dans du FBS PBS à 2 % à 4 °C pendant 24 heures avant de procéder au traitement et à l’analyse des échantillons. Cependant, ce temps devrait être minimisé dans la mesure du possible. Pendant l’incubation avec cocktail de coloration primaire des CSH (étape 3.10) et le cocktail de coloration secondaire (étape 3.11), alors qu’une incubation de 15 minutes à TA est indiquée, elle peut être échangée contre une incubation de 30 minutes à 4 °C.
Il en va de même pour l’incubation avec cocktail de coloration primaire stromale (étape 4.7), la solution de coloration secondaire stromale (étape 4.8), le cocktail de coloration EC (étape 4.12) et l’incubation avec des anticorps anti-carcéraux (étape 6.5); alors qu’une incubation de 15 min à RT est indiquée, elle peut être échangée contre une incubation de 30 min à 4 °C.
Un autre protocole d’isolement de la BM par centrifugation des os longs murins a récemment été décrit21. Bien que ce protocole présente l’avantage d’isoler plus rapidement les cellules BM, le protocole décrit ici permet l’analyse des populations cellulaires résidant dans différentes zones des os.
Une limitation particulière de la méthode actuelle est qu’elle est uniquement basée sur l’analyse phénotypique par cytométrie de flux. Cela est particulièrement pertinent dans le cas des CSH, qui nécessiteraient une validation fonctionnelle plus poussée. Cette méthode peut cependant être combinée avec le tri des populations enrichies et l’étude de ces cellules dans des essais de reconstitution à long terme et des essais de colonies in vitro .
En ce qui concerne l’analyse des cellules stromales, en particulier les CSM et les CE, il a déjà été démontré que, malgré l’optimisation du traitement BM pour l’analyse par cytométrie en flux, un nombre important de cellules ne sont pas isolées du tissu et qu’il existe une quantification sous-optimale de ces cellules par rapport à d’autres méthodes telles que l’imagerie à montage entier19. Néanmoins, la cytométrie en flux est extrêmement utile pour effectuer l’analyse quantitative et qualitative des CE BM et des CSM et pour les isoler prospectivement pour des tests fonctionnels et d’expression.
Une autre limitation de la méthode actuelle est l’utilisation d’une technique mécanique pour séparer les fractions endostéale et centrale, qui sont dans une certaine mesure inévitablement contaminées par les cellules de l’autre compartiment. Néanmoins, la quantification des aBMEC et des sBMEC telle qu’expliquée dans la section des résultats représentatifs montre que l’isolement mécanique est une méthode robuste pour enrichir les populations cellulaires dans ces zones.
La méthode décrite permet d’étudier l’hématopoïèse dans différents contextes et niches stromales des HSPC. L’analyse phénotypique présentée ici peut être utile pour étudier les niches HSPC lorsqu’elles sont combinées avec des mutants spécifiques à la souris, à savoir les lignées EC et MSC Cre qui permettent la manipulation sélective de l’expression génique dans ces populations. Par exemple, les lignées Cdh5(PAC)-CreERT222 et LepR-Cre23 peuvent être utilisées pour induire l’expression sélective de certains gènes dans les CE et les CSM, respectivement. La méthode est utile pour étudier leur impact sur le compartiment stromal ainsi que sur les HSPC. Les lignées Cre disponibles pour étudier la niche de BM vasculaire ont récemment été examinées dans Mosteo et al.5. L’étude prospective des CSH-LT sans transplantation a été limitée par l’absence de lignes rapporteures robustes. Il a toutefois été démontré que le Mds1GFP/+Flt3Cre 6 récemment décrit permet un enrichissement élevé des CSH-LT et une bonne discrimination par rapport aux progéniteurs en aval exprimant Flt324. La combinaison de cette lignée de souris et d’autres souches hématopoïétiques, telles que Vav-iCre25, avec la cytométrie de flux permettra l’étude des HSPC et de leur relation avec la niche. Les hémopathies malignes sont fréquemment associées à la perturbation de l’hématopoïèse dès les premiers stades, ce qui se traduit par l’altération des fréquences des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques et des populations stromales9 que nous avons présentées ici pour C57Bl/6 sain. Les études futures devraient explorer l’application de méthodes similaires à celle décrite ici en utilisant de nouveaux équipements basés sur la cytométrie de flux spectral qui permet une caractérisation phénotypique plus étendue grâce à l’analyse de plus de marqueurs (au-dessus de 30 simultanément).
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
LM a été soutenu par une subvention du Lady Tata Memorial Trust. JR a été soutenu par une bourse de doctorat de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Bourse FCT UI/BD/150833/2021). ML a été soutenu par une bourse de doctorat de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD a été soutenu par des subventions de l’American Society of Hematology, de la Pablove Foundation, de la FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) et de la Société portugaise d’hématologie. Nous remercions le soutien de la Dre Catarina Meireles et d’Emilia Cardoso de l’installation TRACY à i3s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
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