Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

Abstract

מח העצם (BM) הוא הרקמה הרכה המצויה בתוך העצמות שבהן מתרחשת בעיקר המטופויזה, התהליך שבו נוצרים תאי דם חדשים. ככזה, הוא מכיל תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), כמו גם תאי סטרומה תומכים התורמים לתחזוקה ולוויסות של HSPCs. הפרעות BM המטולוגיות ואחרות משבשות את ההמטופוייזה על ידי השפעה ישירה על תאים המטופויטיים ו / או באמצעות שינוי של נישת BM. כאן, אנו מתארים שיטה לחקר hematopoiesis בבריאות וממאירות באמצעות ניתוח פנוטיפי של מורין BM HSPCs ואוכלוסיות נישה סטרומה על ידי ציטומטריית זרימה. השיטה שלנו מפרטת את השלבים הנדרשים להעשרת תאי BM בשברים אנדוסטליים ובשברי BM מרכזיים, כמו גם את אסטרטגיות הגאטינג המתאימות לזיהוי שני סוגי תאי הנישה העיקריים המעורבים בוויסות HSPC, תאי אנדותל ותאי גזע מזנכימליים. הניתוח הפנוטיפי המוצע כאן עשוי להיות משולב עם מוטציות עכבר, מודלים של מחלות ומבדקים פונקציונליים כדי לאפיין את תא HSPC ואת הנישה שלו.

Introduction

ציטומטריית זרימה היא שיטה רבת ערך לאפיון ובידוד פרוספקטיבי של תאים חיסוניים והמטופויאטיים. הוא גם משמש יותר ויותר לניתוח אוכלוסיות סטרומה ואפיתל של רקמות שונות. לתא הגזע ההמטופויאטי (HSC) תכונות ייחודיות של התחדשות עצמית ורב-עוצמה. ביונקים בוגרים, HSCs מתגוררים בעיקר במח העצם (BM), שם הם מקבלים אותות שקט והישרדות מהמיקרו-סביבה שמסביב או מנישה1. HSCs מוגדרים באופן רשמי על פי בדיקות פונקציונליות2. אף על פי כן, מספר מאמרים פורצי דרך הראו את התועלת של ציטומטריית זרימה לזיהוי HSCs. באמצעות שימוש בסמנים מוגבלים בפני השטח של התא, ניתן להבחין בין אוכלוסיות המטופויטיות המועשרות מאוד ב-HSCs3. ציטומטריית זרימה היא, אם כן, שיטה מרכזית בשדה תאי הגזע. נעשה בו שימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאי נישה משוערים וגורמי נישה על HSC. על ידי שילוב של ציטומטריית זרימה עם הדמיה ובדיקות פונקציונליות, הוכח כי HSCs נתמכים באופן קריטי על ידי תאי גזע מזנכימליים פריווסקולריים (MSCs) ותאי אנדותל (ECs). BM MSCs הם קבוצה הטרוגנית ויש להם תרומות ציטוקינים שונות4, אבל זה מבוסס היטב כי קולטן לפטין (LepR)+ MSCs הם תאי נישה מרכזיים1. BM ECs הם גם הטרוגניים מאוד ויכולים להיות חלק מסינוסואידים, עורקים וכלי דם מסוג H / מעבר5. מחקרים שונים הראו את התרומה הניואנסית של ECs שונים אלה. לדוגמה, ECs סינוסואידים אנדוסטליים קרובים יותר מרחבית ל- HSCs6 שקטים, בעוד HSCs לא נודדים עם רמות נמוכות יותר של מיני חמצן תגובתי ממוקמים ליד ECsעורקיים 7. גם המיקום האנדוסטאלי לעומת המרכזי של הנישות חשוב מאוד. כלי דם מסוג H אנדוסטלים קשורים לתאי סטרומה פריווסקולריים שאבדו עם ההזדקנות, מה שמוביל לאובדן HSCs8. בלוקמיה מיאלואידית חריפה, ECs מרכזיים מורחבים, בעוד כלי אנדוסטל ו- HSCs אנדוסטליים הולכים לאיבוד9.

רוב המחקרים בתחום התמקדו בהמטופויזה עצמה ובוויסות החיצוני של התא של HSCs. עם זאת, יותר ויותר הוכר כי יש צורך לאפיין טוב יותר את הנישות המווסתות אבות אחרים, כלומר אבות רב-פוטנטיים (MPPs), במיוחד בהתחשב בכך שהם הנהגים העיקריים של hematopoiesis במצב יציב10. בניגוד למבנה היררכי קבוע, מחקרים אחרונים הראו כי המטופויזיס הוא רצף שבו HSCs מתמיינים ל-MPPs מוטים בשלב מוקדם11. MPPs נקראו על שם תוכניות סיווג שונות12, אך נייר קונצנזוס שנערך לאחרונה על ידי האגודה הבינלאומית להמטולוגיה ניסויית (ISEH) הציע MPPs להיות מופלים כמו MPPs מוקדם ועל פי הלימפה שלהם (MPP-Ly), megakaryocytic ו erythroid (MPP-Mk/E), ומיאלואיד (MPP-G/M)הטיה 13. השימוש בציטומטריית זרימה יהיה קריטי בהמשך המחקר על חשיבותן של נישות BM בוויסות אוכלוסיות אלה. שיטות ציטומטריית זרימה נוכחית משתמשות באסטרטגיות gating משתנות כדי להתמיין HSPCs ולזהות תאי סטרומה, כלומר ECs, באמצעות סמנים לא עקביים. מטרת השיטה הנוכחית היא להציג תהליך עבודה פשוט וניתן לשחזור של צביעת BM כדי לזהות תת-אוכלוסיות HSPC, קבוצות הטרוגניות של ECs ו- LepR+ MSCs. אנו מאמינים כי טכניקה זו, למרות שניתן להשוות אותה לשיטות שדווחו בעבר (ראה, למשל, הפניה 14), מספקת פרוטוקול מעודכן וקל ליישום לניתוח פנוטיפי של תאים המטופויטיים בשני אזורי מח המוח הפונקציונליים, אנדוסטל ו- BM 8,15 מרכזי, כמו גם תאי נישה סטרומה BM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה שוכנו במתקן בעלי החיים i3S בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים במחזור אור-חושך של 12 שעות ובסביבה מבוקרת טמפרטורה. גישה חופשית לצ'או מכרסמים סטנדרטי ומים סופקה. כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני על פי הקריטריונים שהותוו על ידי הפדרציה האירופית של אגודות מדעי חיות מעבדה לטיפול וטיפול בחיות מעבדה (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU). ההליך הניסיוני שבוצע על בעלי החיים (המתת חסד) אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים i3S (ref. DD_2019_15) ועל ידי Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. פרטים על החומרים בהם נעשה שימוש בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת תמיסות והכתמת קוקטיילים

  1. מלח חוצץ פוספט (PBS): יש להמיס חמש טבליות PBS בליטר אחד של מים מזוקקים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
  2. PBS 2% סרום בקר עוברי (FBS): הוסף 10 מ"ל של FBS ל 500 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  3. חיץ ליזה של תאי דם אדומים (RBC) (1x): הוסף 50 מ"ל של 10x RBC lysis buffer ל- 450 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  4. תמיסת Collagenase IV ו-dispase II: יש להמיס 30 מ"ג של collagenase IV ו-60 מ"ג של dispase II ב-30 מ"ל HBSS לקבלת תמיסת 1 מ"ג/מ"ל collagenase IV ו-2 מ"ג/מ"ל dispase II. יש להכין טרי לפני השימוש.
  5. פתרון חסימת קולטני Fc: הוסף 10 μL של נוגדן CD16/32 מטוהר נגד עכבר ל 490 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  6. תמיסת צביעת צביעה של כדאיות תאים פלואורסצנטיים: הוסף 2 μL של צבע כדאיות תאים פלואורסצנטיים ל- 1 מ"ל של PBS. יש להכין טרי לפני השימוש.
  7. קוקטייל שושלת ביוטין: יש לערבב 100 μL של כל אחד מהנוגדנים הבאים: ביוטין נגד עכבר CD3ε, ביוטין נגד עכבר CD4, ביוטין נגד עכבר CD8a, ביוטין נגד עכבר / CD11b אנושי, ביוטין נגד עכבר / CD45R / B220, ביוטין נגד עכבר Ly-6G/Ly-6C (Gr-1), וביוטין נגד עכבר TER-119/תאים אריתרואידים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  8. קוקטייל הצביעה העיקרי של HSCs: הוסף 10 μL של קוקטייל שושלת ביוטין, 10 μL של immunofluorescently מתויג 510 CD150 נגד עכבר (SLAM), 10 μL של phycoerythrin (PE) נגד עכבר Flk2 (CD135), 10 μL של חלבון peridinin-chlorophyll (PerCP) נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL של PE / ציאנין7 נגד עכבר CD48, ו 10 μL של allophycocyanin (APC) / Cyanine7 נגד עכבר CD117 (c-kit) ל 940 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  9. קוקטייל צביעה ראשוני סטרומה: הוסף 5 μL של לפטין עכבר R נוגדן biotinylated, 6.7 μL של נוגדן PE נגד עכבר אנדומוצין, 10 μL של PerCP נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL של PE / ציאנין7 נגד עכבר CD31, 10 μL של APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45, ו 10 μL של APC/ציאנין7 נגד עכבר TER-119 / תאים אריתרואידים 954 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  10. HSCs/תמיסת צביעה שניונית סטרומה: הוסף 1 μL של סטרפטאבידין APC ל 1 מ"ל של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  11. קוקטייל מכתים ECs: הוסף 10 μL של נוגדן PE נגד עכבר אנדומוצין, 10 μL של PerCP נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL של PE / ציאנין7 נגד עכבר CD31, 10 μL של Alexa Fluor 647 נגד עכבר CD54 / ICAM-1, 10 μL של APC / ציאנין 7 נגד עכבר CD45, ו 10 μL של APC/ציאנין7 נגד עכבר TER-119 / תאים אריתרואידים ל 940 μL של PBS 2% FBS. הכינו טרי או ביום הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור עד לשימוש.
  12. פתרון צביעת DAPI: הוסף טיפה אחת של מגיב DAPI ל- 500 μL של PBS. יש להכין טרי לפני השימוש.

2. מיצוי דגימה

  1. המתת חסד של בעל החיים על ידי פריקת צוואר הרחם (פרטים על בעלי החיים ששימשו להפקת הנתונים שהוצגו במחקר זה ניתן למצוא בטבלה משלימה 1). הניחו את בעל החיים עם הבטן על צלחת פטרי ורססו באתנול 70%. לעשות חתך מעל הבטן באמצעות מספריים ולמשוך את העור משם כל הדרך עד הקרסוליים.
  2. תפסו רגל אחת, ובעזרת מספריים חתכו אותה בתחתיתה (היכן שהמפרק בין הרגל לירך נמצא) כדי להפריד בינה לבין החיה. צעד זה ישמש גם כשיטת אישור משנית להמתת חסד. הסר את כף הרגל מהרגל על ידי חיתוך בקרסול. מניחים את הרגל ב-PBS קר כקרח 2% FBS. במידת הצורך, חזור על הצעד עם הרגל השנייה.
  3. תפוס את עצם הירך, ובעזרת מספריים לחתוך מאחוריה כדי להפריד אותו מן החיה. הניחו את עצם הירך ב-PBS קר כקרח 2% FBS. במידת הצורך, חזור על השלב עם עצם הירך השנייה.
  4. הניחו את עצמות הרגליים והירך בצלוחית פטרי ובעזרת אזמל סטרילי נקו את העצמות. להפריד את השוקה ואת עצם הירך על ידי חיתוך הברך עם אזמל. הניחו את העצמות הנקיות ב-PBS קר כקרח 2% FBS.

3. עיבוד דגימה לניתוח אוכלוסיות תאים המטופויטיים בסך מח עצם

  1. מניחים עצם הירך או השוקה במכתש עם PBS 2% FBS קר כקרח ומועכים את העצם על ידי הצמדתה בעדינות לדופן המליטה באמצעות המזיק. תאי BM משוחררים לתמיסה הכלולה במכתש.
  2. פיפטה מתלה התא שנוצר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ"ל כדי הומוגניזציה והעברה לתוך צינור 50 מ"ל דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר הממוקם על גבי הצינור.
  3. אם העצמות המרוסקות אינן נראות לבנות בשלב זה, הוסף עוד PBS 2% FBS לטיט וריסוק חוזר, ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה והעבר את התמיסה לאותו צינור 50 מ"ל דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
  4. שטפו את המכתש עם עוד קצת PBS 2% FBS והעבירו את התמיסה לאותו צינור 50 מ"ל דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס RBC (1x) ב-RT על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר דגירה של 2 דקות ב- RT, הוסף 15 מ"ל של PBS 2% FBS.
  6. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אם גלולת התא עדיין נראית אדמדמה, חזור לשלב 3.5. אם לא, השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS, והעבירו את מתלה התא לבאר של צלחת V תחתונה בעלת 96 בארות להכתמה.
  7. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ולהשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת צבע פלואורסצנטית. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  8. צלחת צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ולהשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS 2% FBS לשטיפה.
  9. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של קולטני Fc חוסם פתרון. לדגור על הצלחת במשך 10 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  10. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגו את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, ואת resuspend את הגלולה ב 100 μL של קוקטייל צביעה ראשוני HSC. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  11. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, והלייה מחדש את הגלולה ב 100 μL של HSCs תמיסת צביעה משנית. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  12. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 500 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C והשליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  13. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
    הערה: אם אתם מעוניינים לקבוע את המספרים המוחלטים של אוכלוסיות תאים המטופויטיים, הוסיפו חרוזי כיל לצינורות הפוליסטירן לפני ניתוח הציטומטר16.

4. עיבוד דגימות לניתוח אוכלוסיות תאי סטרומה בסך מח עצם

  1. מניחים עצם הירך או השוקה במכתש עם PBS 2% FBS קר כקרח ומועכים את העצם על ידי הצמדתה בעדינות לדופן המליטה באמצעות המזיק. חותכים את קצה קצה P1000 באמצעות מספריים ומשתמשים בו כדי להעביר את כל התוכן של המליטה לתוך צינור 50 מ"ל (לא לעבור דרך מסננת התא).
  2. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את הגלולה ב 3 מ"ל של collagenase IV ו dispase II פתרון. יש לדגור על הצינור בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
  3. מלא את הצינור ל 25 מ"ל עם PBS 2% FBS ומערבולת לערבוב. העבר את התוכן של צינור 50 מ"ל לצינור חדש של 50 מ"ל דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר. הוסף 15 מ"ל של PBS 2% FBS לצינור הישן של 50 מ"ל והעבר את התמיסה לאותו צינור חדש של 50 מ"ל דרך אותה מסננת תאים. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס RBC (1x) ב-RT על ידי פיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר דגירה של 2 דקות ב- RT, הוסף 15 מ"ל של PBS 2% FBS.
  5. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אם גלולת התא עדיין נראית אדמדמה, חזור לשלב 4.4. אם לא, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS 2% FBS, והעבירו את מתלה התא לבאר של צלחת V תחתונה של 96 בארות לצורך צביעה. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  6. אם אתם מבצעים צביעת סטרומה, המשיכו לשלב 4.7. אם אתה מבצע צביעת EC, המשך לשלב 4.12.
  7. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ותלו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל צביעה ראשוני סטרומה. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  8. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג, ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של תמיסת צביעה משנית סטרומה. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  9. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  10. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור.
  11. רגע לפני שאתם ניגשים לציטומטר, הוסיפו 35 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI לצינור המכיל את תרחיף התא לניתוח ציטומטריית זרימה ודגרו על הצינור ב-RT למשך 5 דקות בחושך. לאחר הדגירה הזו, יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
  12. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג ותלו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל EC מכתים. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  13. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  14. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג. השהה מחדש את הגלולה ב 250 μL של PBS 2% FBS והעבר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור.
  15. רגע לפני שאתם ניגשים לציטומטר, הוסיפו 35 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI לצינור המכיל את תרחיף התא לניתוח ציטומטריית זרימה ודגרו על הצינור ב-RT למשך 5 דקות בחושך. לאחר הדגירה הזו, יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
    הערה: אם אתם מעוניינים לקבוע את המספרים המוחלטים של אוכלוסיות תאי סטרומה ואנדותל, הוסיפו חרוזי כיול לצינורות הפוליסטירן לפני הניתוח בציטומטר16.

5. עיבוד דגימה לניתוח אוכלוסיות תאים המטופויטיים ב- BM כתוש וסמוק

  1. מניחים עצם הירך על צלחת פטרי וחותכים את קצות העצם באמצעות אזמל סטרילי.
  2. שטפו את החלק המרכזי של העצם (דיאפיזיס) על ידי העברת 100 μL של PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של העצם פעם אחת מכל צד באמצעות מזרק אינסולין 0.5 מ"ל ללא נפח מת ואיסוף התמיסה בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של PBS 2% FBS. לאחר מכן, להעביר את מתלה התא לתוך צינור 50 מ"ל המסומן כמו BM סמוק המכיל 4 מ"ל של PBS 2% FBS. שמור על קרח.
  3. מניחים את קצות העצם במכתש עם PBS 2% FBS קר כקרח ומועכים על ידי הצמדתו בעדינות לקיר הטיט באמצעות המזיק. פיפטה את תרחיף התא שנוצר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ"ל כדי הומוגניזציה והעברה לתוך צינור 50 מ"ל המסומן כמו BM כתוש דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
  4. אם העצם המרוסקת אינה נראית לבנה בשלב זה, הוסף עוד PBS 2% FBS לטיט וחזור על הריסוק. לאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה ולהעביר את התמיסה לתוך אותו צינור 50 מ"ל (BM כתוש) דרך אותה מסננת תאים 40 מיקרומטר.
  5. שטפו את הטיט עם עוד קצת PBS 2% FBS והעבירו את התמיסה לאותו צינור 50 מ"ל (BM כתוש) דרך אותה מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
  6. צנטריפוגה צינורות 50 מ"ל המתאים דגימות סמוק כתוש ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  7. בצע את שלבים 3.5 עד 3.13 (סעיף 3) עם דגימות BM סמוקות ומרוסקות.

6. הכנת בקרות צבע יחיד (SCC) לניתוח ציטומטריית זרימה

  1. בצע את שלבים 3.1 עד 3.6 (סעיף 3) עם עצם נוספת מאחת החיות שלא שימשו לניתוח העיקרי, העברת תרחיף התא הסופי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של PBS 2% FBS במקום באר של צלחת V תחתונה 96 באר.
  2. העבר 100 μL של תרחיף התא ל 8 בארות של צלחת V-תחתית 96 בארות, 100 μL לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית המכיל 100 μL של PBS 2% FBS המסומן כ- DAPI SCC, ואת תרחיף התא הנותר לתוך צינור פוליסטירן עגול תחתון 5 מ"ל המכיל 100 μL של PBS 2% FBS המסומן כלא מוכתם. שמור על הצינורות על קרח מוגנים מפני אור.
  3. צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 500 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C והשליכו את הסופרנאטנטים על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  4. יש להשהות גלולה אחת ב-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת צבע פלואורסצנטי ואת הנותרות ב-100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.
  5. הוסף 0.5 μL של הנוגדנים הבאים, מלבד קוקטייל השושלת של נוגדנים שעבורם מוסיפים 2 μL ונוגדן PECy7 CD31 שעבורו מוסיפים 0.3 μL, לכל אחת מהבארות עם תרחיף תאים ב- PBS 2% FBS (נוגדן אחד לכל באר, אותם נוגדנים המשמשים בלוחות הניתוח העיקריים או אותם נוגדנים פלואורופורים עם עוצמת פלואורסצנטיות דומה ושפע אפיטופים): קוקטייל שושלת ביוטין, מתויג באופן אימונופלואורסצנטי 510 CD150 נגד עכבר (SLAM), PE נגד עכבר Flk2 (CD135), PerCP נגד עכבר Ly-6A / E (Sca-1), immunofluorescently מתויג 647 נגד עכבר CD54 / ICAM-1, PE / ציאנין7 נגד עכבר CD48, ו APC / ציאנין7 נגד עכבר CD117 (c-kit). דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  6. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגו את הצלחת במהירות של 500 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C והשליכו את הסופרנאטנטים על ידי הפיכת הצלחת על נייר סופג.
  7. השהה מחדש את כל הכדוריות מלבד זו המתאימה לתאים המודגרות עם קוקטייל השושלת של נוגדנים ב 180 מיקרוליטר של PBS 2% FBS והעבר את מתלי התא לתוך צינורות 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננות תאים 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
  8. להשהות מחדש את התאים המודגרים עם קוקטייל השושלת של נוגדנים ב 100 μL של HSCs/תמיסת צביעה שניונית סטרומה. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות ב- RT בחושך.
  9. הוסף 100 μL של PBS 2% FBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשטוף. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  10. השהה מחדש את הגלולה ב 180 μL של PBS 2% FBS ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.
  11. רגע לפני שאתם ניגשים לציטומטר, הוסיפו 35 μL של תמיסת צביעה DAPI לצינור DAPI SCC ודגרו על הצינור ב-RT למשך 5 דקות בחושך. לאחר הדגירה הזו, יש לשמור על קרח מוגן מפני אור עד לניתוח ציטומטריית זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלקות מייצגות של ניתוח ציטומטריית זרימה של HSCs ו-MPPs בעכבר C57Bl/6 בוגר צעיר ובריא מוצגות באיור 1. אסטרטגיית הגאטינג עוקבת אחר המינוח ההרמוני האחרון שהוצע על ידי ISEH13. כאשר מנתחים את ההשפעה של הפרעה, כגון זיהום או סרטן, חשוב להשתמש בעכבר בקרה כהפניה לשערים רגילים. פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) יכולים להיות שימושיים במיוחד לתיחום גבולות השערים, אך יש לציין כי הגדרה עיוורת של גבולות שערים המבוססים על FMOs עלולה להשמיט תאי מטרה או לכלול תאים שאינם תאי יעד. לדוגמה, ככל שהעוצמה של ערכת CD48 נמוכה יותר, כך ההעשרה גבוהה יותר עבור HSCsלטווח ארוך 17. יתר על כן, מאפיינים שונים של אוכלוסיות מסוימות מסתמכים על עוצמת סמנים ספציפיים. לדוגמה, HSCs המבטאים רמות CD150 גבוהות יותר הם מוטים מיאלואידיםיותר 18.

התדרים והמספרים המוחלטים שהתקבלו בניתוח אוכלוסיות תאים המטופויטיים שהוחלו על ארבעה בעלי חיים בסך הכל מוצגים בטבלה 1.

איור 2 מציג חלקות מייצגות של ניתוח ציטומטריית זרימה של ECs ו-MSC. רוב התאים ההמטופויטיים אינם נכללים בעקבות ברירה שלילית Ter119/CD45. לאחר מכן ניתן לזהות בקלות תאי MSCs מסוג LepR+, בעוד שתאי EC אמיתיים דורשים בחירה עוקבת של תאי Sca-1+ . בעוד Sca-1 משמש לעתים קרובות במחקרים immunofluorescence כדי לסמן באופן ספציפי עורקים, זה לא המקרה בציטומטריית זרימה, כמו טכניקה זו רגישה מאוד, ECs תמיד לבטא רמה מסוימת (גם אם נמוכה) של Sca-1 על פני התא. על ידי אי בחירת תאי Sca-1+ בלבד, תאים אחרים שאינם אנדותל ייכללו בניתוח, כגון תאים מיאלואידים המבטאים CD31, אשר עשויים להשפיע באופן משמעותי על כימות ECs ב- BM. ECs ניתן לנתח כאוכלוסייה שלמה או מבוסס על סמנים ספציפיים החושפים חלקית את ההטרוגניות שלהם. אנדומוצין בשילוב עם CD31 שימושי מאוד לזיהוי אנדותל H15 מובחן מבחינה תפקודית (איור 2). יתר על כן, הוכח בעבר כי ביטוי ICAM-1 מאפשר הבחנה בין ECs עורקיים (aBMECs) וסינוסואידים ECs (sBMECs) (איור 3)20.

התדרים והמספרים המוחלטים שהתקבלו בניתוח MSCs ואוכלוסיות תאי אנדותל שהוחלו על ארבעה בעלי חיים בסך הכל מוצגים בטבלה 2 ובטבלה 3.

למרות שאזורים פונקציונליים של BM אינם מוגדרים בבירור באזורים היסטולוגיים ברורים, זה מבוסס היטב כי אזורים אנדוסטליים של רירית העצם ואזורי BM מרכזיים מועשרים בסוגי תאים ואירועים מסוימים (למשל, שחרור טסיות דם / פרו-טסיות ממגה-קריוציטים בסינוסואידים של אזורי BM מרכזיים). לכן, כדאי להעשיר עבור סוגי תאים באזורים מרכזיים ואנדוסטליים כדי לנתח בנפרד את שני התאים הללו. יישמנו שיטה של שטיפת הדיאפיזה כדי להעשיר עבור סוגי תאים מרכזיים, וריסוק המטפיזה כדי להעשיר עבור סוגי תאים אנדוסטליים (איור 4A). הכימות של aBMECs ו-sBMECs ברקמת BM סמוקה (מרכזית) ומרוסקת (endosteal) (איור 4B) מאמת את הישימות של שיטת בידוד מכנית זו, מאחר ש-aBMECs ידועים לשמצה בשכיחות גבוהה יותר באזורים אנדוסטלים, וסינוסואידים שכיחים יותר באזורי BM מרכזיים.

Figure 1
איור 1: ניתוח אוכלוסיות תאים המטופויטיים. חלקות מייצגות המציגות את אסטרטגיית הגאטינג לניתוח ציטומטריית זרימה של אוכלוסיות תאים המטופויטיים בסך הכל BM באמצעות התוכנה שסופקה. קיצורים: FSC-H = פיזור קדימה - גובה, FSC-A = פיזור קדמי - שטח, לין = שושלת, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ תאי אב המטופויטיים, MPPsLy = אבות רב-פוטנטיים - לימפואיד, MPPsG/M = אבות רב-פוטנטיים - גרנולוציטים/מקרופאגים, MPPsMk/E = אבות רב-פוטנטיים - מגה-קריוציטים/אריתרוציטים, MPPs = אבות רב-פוטנטיים, HSCs = תאי גזע המטופויטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח אוכלוסיות תאי סטרומה. חלקות מייצגות המציגות את אסטרטגיית gating לניתוח ציטומטריית זרימה של תאי סטרומה בסך הכל BM באמצעות התוכנה שסופקה. קיצורים: FSC-H = פיזור קדמי - גובה, FSC-A = פיזור קדמי - שטח, MSCs = תאי גזע מזנכימליים, LepR = קולטן לפטין, ECs = תאי אנדותל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אנליזה של תאי אנדותל. חלקות מייצגות המציגות את אסטרטגיית gating לניתוח ציטומטריית זרימה של ECs בסך הכל BM באמצעות התוכנה שסופקה. קיצורים: FSC-H = פיזור קדימה - גובה, FSC-A = פיזור קדמי - שטח, ECs = תאי אנדותל, aBMECs = תאי אנדותל של מח עצם עורקי, sBMECs = תאי אנדותל של מח עצם סינוסואידלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח אוכלוסיות EC באזורים מרכזיים ואנדוסטלים . (A) ייצוג של החלקים השונים של עצם ארוכה מורינה. (B) חלקות המראות את ההבדלים המשמעותיים סטטיסטית בתדרים של תאי אנדותל CD31+ ב-aBMEC (מועשר בדגימה המרוסקת) וב-sBMEC (מועשר בדגימה הסמוקה). כל נקודה מייצגת עכבר (n = 9), והדגימות משויכות. המבחן הסטטיסטי בו נעשה שימוש היה מבחן T זוגי. מציין ערך P דו-זנבי < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אוכלוסיית תאים ממוצע של freq. של תאים חיים BM ± SD (n = 4) בסך הכל BM ממוצע ספירת התאים ± SD (n=4) לכל עצם הירך בסך הכל BM ממוצע של freq. של תאים חיים BM ± SD (n = 4) ב BM endosteal ממוצע של freq. של תאים חיים BM ± SD (n = 4) במרכז BM
לין- 3.05 ± 0.13 337610 ± 59414 3.56 ± 0.21 3.53 ± 0.19
LKS 0.096 ± 0.026 10206 ± 1794 0.102 ± 0.025 0.133 ± 0.022
MPPsLy 0.058 ± 0.011 6141 ± 716 0.058 ± 0.011 0.085 ± 0.007
MPPsG/M 0.011 ± 0.004 1233 ± 326 0.013 ± 0.003 0.014 ± 0.003
MPPsMk/E 0.0010 ± 0.0002 113 ± 21 0.0014 ± 0.0004 0.0012 ± 0.0005
MPPs 0.0092 ± 0.0045 940 ± 374 0.0105 ± 0.0048 0.0118 ± 0.0061
HSCs 0.0054 ± 0.0023 572 ± 191 0.0055 ± 0.0023 0.0059 ± 0.0016

טבלה 1: נתונים כמותיים עבור אוכלוסיות תאים המטופויטיים. ממוצע התדירות בתאי BM חיים של אוכלוסיות תאים המטופויטיים שונות שנותחו בסך הכל, אנדוסטל ו- BM מרכזי וספירת תאים לכל עצם הירך בסך הכל BM. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 4.

אוכלוסיית תאים ממוצע של freq. של תאים חיים BM ± SD (n = 4) ממוצע ספירת התאים ± SD (n = 4) לכל טיביה
ECs 0.080 ± 0.011 4523 ± 1521
ECs מסוג H 0.041 ± 0.006 2299 ± 752
ECs מסוג L 0.038 ± 0.005 2103 ± 736
MSCs 0.180 ± 0.048 10270 ± 4282

טבלה 2: נתונים כמותיים עבור אוכלוסיות תאי סטרומה. ממוצע התדירות בתאי BM חיים וספירת תאים לטיביה עבור אוכלוסיות תאי סטרומה שונות שנותחו בסך BM. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 4.

אוכלוסיית תאים ממוצע של freq. של תאים חיים BM ± SD (n = 4) ממוצע ספירת התאים ± SD (n = 4) לכל טיביה
ECs 0.064 ± 0.006 2255 ± 150
aBMECs 0.041 ± 0.010 1419 ± 286
sBMECs 0.023 ± 0.006 819 ± 250

טבלה 3: נתונים כמותיים עבור אוכלוסיות תאי אנדותל. ממוצע השכיחות בתאי BM חיים וספירת תאים לטיביה עבור אוכלוסיות תאי אנדותל שונות שנותחו בסך BM. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 4.

טבלה משלימה 1: פירוט בעלי החיים ששימשו במחקר. זן, מין, גיל ומשקל של החיות ששימשו להפקת הנתונים המוצגים באיור 1, איור 2, איור 3 וטבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3. קיצור: g = גרם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד שהפרוטוקול המתואר הוא פשוט וקל לביצוע, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים ספציפיים. לדוגמה, בעת קבלת BM סמוק (שלב 5.2), אין לחרוג מהנפח או מספר הפעמים המצוינות כדי להעביר PBS 2% FBS דרך החלק הפנימי של החלק המרכזי של העצם, מכיוון שהדבר עלול לגרום לזיהום משמעותי של הדגימה הסמוקה על ידי אוכלוסיות תאים אנדוסטליים.

שינויים בפרוטוקול יכולים להיעשות כדי להקל על ביצועו על ידי החוקר. במיצוי דגימה (סעיף 2), רגליים ו / או עצמות ניתן לאחסן PBS 2% FBS ב 4 ° C עד 24 שעות לפני המשך עיבוד הדגימה וניתוח. עם זאת, זמן זה צריך להיות ממוזער במידת האפשר. במהלך הדגירה עם קוקטייל צביעה ראשוני של HSC (שלב 3.10) וקוקטייל צביעה משני (שלב 3.11), בעוד דגירה של 15 דקות ב- RT מצוין, ניתן להחליף זאת בדגירה של 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

כנ"ל לגבי דגירה עם קוקטייל צביעה ראשוני סטרומה (שלב 4.7), תמיסת צביעה משנית סטרומה (שלב 4.8), קוקטייל צביעת ECs (שלב 4.12) ודגירה עם נוגדנים ל- SCC (שלב 6.5); בעוד דגירה של 15 דקות ב- RT מצוין, ניתן להחליף זאת בדגירה של 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

פרוטוקול נוסף לבידוד BM על ידי צנטריפוגה של עצמות ארוכות של מורין תואר לאחרונה21. בעוד פרוטוקול זה מציג את היתרון של בידוד מהיר יותר של תאי BM, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ניתוח של אוכלוסיות תאים השוכנות באזורים שונים של העצמות.

מגבלה מסוימת של השיטה הנוכחית היא שהיא מבוססת אך ורק על אנליזה פנוטיפית על ידי ציטומטריית זרימה. זה רלוונטי במיוחד במקרה של HSCs, אשר ידרוש אימות פונקציונלי נוסף. עם זאת, ניתן לשלב שיטה זו עם מיון אוכלוסיות מועשרות ומחקר של תאים אלה במבחני בנייה מחדש ארוכי טווח ובמבחני מושבות חוץ גופיות .

באשר לאנליזה של תאי סטרומה, בפרט MSCs ו-ECs, הוכח בעבר כי למרות האופטימיזציה של עיבוד BM לניתוח ציטומטריית זרימה, מספר משמעותי של תאים אינם מבודדים מהרקמה ויש כימות תת-אופטימלי של תאים אלה בהשוואה לשיטות אחרות כגון הדמיה בהרכבה שלמה19. עם זאת, ציטומטריית זרימה שימושית ביותר לביצוע ניתוח כמותי ואיכותי של BM ECs ו- MSCs ולבודד אותם באופן פרוספקטיבי למבחני תפקוד וביטוי.

מגבלה נוספת של השיטה הנוכחית היא השימוש בטכניקה מכנית להפרדת השברים האנדוסטליים והמרכזיים, שבמידה מסוימת מזוהמים באופן בלתי נמנע על ידי תאים מהתא השני. עם זאת, הכימות של aBMECs ו- sBMECs כפי שהוסבר בסעיף התוצאות המייצגות מראה כי הבידוד המכני הוא שיטה חזקה להעשרת אוכלוסיות תאים באזורים אלה.

השיטה המתוארת מאפשרת ללמוד hematopoiesis בהגדרות שונות ונישות סטרומה של HSPCs. הניתוח הפנוטיפי המוצג כאן עשוי להיות שימושי לחקר נישות HSPC בשילוב עם מוטציות עכבר ספציפיות, כלומר קווי EC ו- MSC Cre המאפשרים מניפולציה סלקטיבית של ביטוי גנים באוכלוסיות אלה. לדוגמה, ניתן להשתמש בקווי Cdh5(PAC)-CreERT222 ו- LepR-Cre23 כדי לגרום לביטוי של גנים מסוימים באופן סלקטיבי ב- ECs ו- MSCs, בהתאמה. השיטה שימושית כדי לחקור את השפעתם על תא סטרומה, כמו גם על HSPCs. קווי Cre זמינים לחקר נישת BM וסקולרית נסקרו לאחרונה ב Mosteo et al.5. המחקר הפרוספקטיבי של LT-HSCs ללא השתלה הוגבל על ידי היעדר קווי דיווח חזקים. Mds1GFP/+Flt3Cre 6 שתואר לאחרונה הוכח, עם זאת, כמשיג העשרה גבוהה של LT-HSCs ואפליה טובה מאבות במורד הזרם המבטאים Flt324. השילוב של קו עכבר זה וזנים המטופויטיים אחרים, כגון Vav-iCre25, עם ציטומטריית זרימה יאפשר לחקור HSPCs ואת הקשר שלהם עם הנישה. ממאירויות המטולוגיות קשורות לעיתים קרובות להפרעה של המטופויזיס מהשלבים המוקדמים ביותר, אשר באה לידי ביטוי בשינוי התדרים של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים ושל אוכלוסיות סטרומה9 שהצגנו כאן עבור C57Bl/6 בריא. מחקרים עתידיים צריכים לבחון יישום של שיטות דומות לזו המתוארת כאן באמצעות ציוד חדש המבוסס על ציטומטריית זרימה ספקטרלית המאפשרת אפיון פנוטיפי נרחב יותר באמצעות ניתוח של יותר סמנים (מעל 30 בו זמנית).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

LM נתמך על ידי מענק מקרן הזיכרון ליידי טאטא. JR נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; ממשק משתמש של מלגת FCT/BD/150833/2021). ML נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של FCT (מלגת FCT 2021.04773.BD). DD נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) והאגודה הפורטוגזית להמטולוגיה. אנו מודים לתמיכה של ד"ר קטרינה מיירלס ואמיליה קרדוסו ממתקן TRACY ב-i3s.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Tags

פסילה גיליון 187
ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter