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Bioengineering

Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

Introduciamo quattro metodi per valutare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate utilizzando tecniche in vitro . Questi metodi possono essere adattati per studiare le interazioni di diverse nanoparticelle e superfici nanostrutturate con una vasta gamma di specie microbiche.

Abstract

Le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate, come argento, ossido di zinco, biossido di titanio e ossido di magnesio, sono state esplorate in precedenza in contesti clinici e ambientali e in prodotti alimentari di consumo. Tuttavia, la mancanza di coerenza nei metodi sperimentali e nei materiali utilizzati è culminata in risultati contrastanti, anche tra studi sugli stessi tipi di nanostrutture e specie batteriche. Per i ricercatori che desiderano impiegare nanostrutture come additivo o rivestimento nella progettazione di un prodotto, questi dati contrastanti limitano il loro utilizzo in contesti clinici.

Per affrontare questo dilemma, in questo articolo, presentiamo quattro diversi metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate e discutiamo la loro applicabilità in diversi scenari. L'adattamento di metodi coerenti dovrebbe portare a dati riproducibili che possono essere confrontati tra gli studi e implementati per diversi tipi di nanostrutture e specie microbiche. Introduciamo due metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e due metodi per le attività antimicrobiche delle superfici nanostrutturate.

Per le nanoparticelle, il metodo della cocoltura diretta può essere utilizzato per determinare le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime di nanoparticelle e il metodo di coltura a esposizione diretta può essere utilizzato per valutare in tempo reale l'attività batteriostatica rispetto all'attività battericida derivante dall'esposizione alle nanoparticelle. Per le superfici nanostrutturate, il metodo della coltura diretta viene utilizzato per determinare la vitalità dei batteri indirettamente e direttamente a contatto con superfici nanostrutturate e il metodo di esposizione a contatto focalizzato viene utilizzato per esaminare l'attività antimicrobica su un'area specifica di una superficie nanostrutturata. Discutiamo le principali variabili sperimentali da considerare per la progettazione di studi in vitro quando si determinano le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate. Tutti questi metodi sono relativamente a basso costo, impiegano tecniche relativamente facili da padroneggiare e ripetibili per coerenza e sono applicabili a una vasta gamma di tipi di nanostrutture e specie microbiche.

Introduction

Solo negli Stati Uniti, 1,7 milioni di individui sviluppano un'infezione acquisita in ospedale (HAI) ogni anno, con una su 17 di queste infezioni con conseguente morte1. Inoltre, si stima che i costi di trattamento per le IAA vadano da $ 28 miliardi a $ 45 miliardi all'anno 1,2. Queste ICA sono predominate da Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA)3,4 e Pseudomonas aeruginosa4, che sono comunemente isolati dalle infezioni croniche della ferita e di solito richiedono un trattamento esteso e tempo per produrre un esito favorevole al paziente.

Negli ultimi decenni, sono state sviluppate più classi di antibiotici per trattare le infezioni legate a questi e ad altri batteri patogeni. Ad esempio, analoghi della rifamicina sono stati usati per trattare MRSA, altre infezioni gram-positive e gram-negative e infezioni da Mycobacterium spp.5. Nel 1990, per trattare efficacemente un numero crescente di infezioni da M. tuberculosis, ulteriori farmaci sono stati combinati con analoghi della rifamicina per aumentare la loro efficacia. Tuttavia, circa il 5% dei casi di M. tuberculosis rimane resistente allarifampicina 5,6 e vi è una crescente preoccupazione per quanto riguarda i batteri multi-farmaco resistenti7. Attualmente, l'uso di antibiotici da solo potrebbe non essere sufficiente nel trattamento delle IAA e ciò ha provocato una continua ricerca di terapie antimicrobiche alternative1.

I metalli pesanti, come l'argento (Ag)8,9,10 e l'oro (Au)11, e la ceramica, come il biossido di titanio (TiO 2)12 e l'ossido di zinco (ZnO)13, in forma di nanoparticelle (NP) (AgNP, AuNP, TiO 2 NPe ZnONP, rispettivamente) sono stati esaminati per le loro attività antimicrobiche e sono stati identificati come potenziali alternative antibiotiche. Inoltre, materiali bioriassorbibili, come leghe di magnesio (leghe di Mg)14,15,16, nanoparticelle di ossido di magnesio 17,18,19,20,21 e nanoparticelle di idrossido di magnesio [nMgO e nMg(OH)2, rispettivamente]22,23,24, sono stati esaminati anche. Tuttavia, i precedenti studi antimicrobici sulle nanoparticelle hanno utilizzato materiali e metodi di ricerca incoerenti, ottenendo dati difficili o impossibili da confrontare e talvolta contraddittori in natura18,19. Ad esempio, la concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione battericida minima (MBC) di nanoparticelle d'argento variavano significativamente in diversi studi. Ipe et al.25 hanno valutato le attività antibatteriche degli AgNP con una dimensione media delle particelle di ~ 26 nm per determinare le MIC contro batteri gram-positivi e gram-negativi. Le MIC identificate per P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA erano rispettivamente 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL. Al contrario, Parvekar et al.26 hanno valutato AgNP con una dimensione media delle particelle di 5 nm. In questo caso, l'AgNP MIC e un MBC di 0,625 mg/ml sono risultati efficaci contro S. aureus. Inoltre, Loo et al.27 hanno valutato AgNP con una dimensione di 4,06 nm. Quando E. coli è stato esposto a queste nanoparticelle, il MIC e l'MBC sono stati riportati a 7,8 μg / ml. Infine, Ali et al.28 hanno studiato le proprietà antibatteriche degli AgNP sferici con una dimensione media di 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA sono stati esposti a queste nanoparticelle, il MIC è stato identificato a 27 μg / mL, 36 μg / mL, 27 μg / mL e 36 μg / mL, rispettivamente, e l'MBC è stato identificato a 36 μg / mL, 42 μg / mL e 30 μg / mL, rispettivamente.

Sebbene l'attività antibatterica delle nanoparticelle sia stata ampiamente studiata e riportata negli ultimi decenni, non esiste uno standard per i materiali e i metodi di ricerca utilizzati per consentire confronti diretti tra gli studi. Per questo motivo, presentiamo due metodi, il metodo di co-coltura diretta (metodo A) e il metodo di esposizione diretta (metodo B), per caratterizzare e confrontare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle mantenendo i materiali e i metodi coerenti.

Oltre alle nanoparticelle, sono state esaminate anche superfici nanostrutturate per attività antibatteriche. Questi includono materiali a base di carbonio, come nanofogli di grafene, nanotubi di carbonio e grafite29, nonché leghe pure di Mg e Mg. Ognuno di questi materiali ha mostrato almeno un meccanismo antibatterico, tra cui danni fisici imposti alle membrane cellulari da materiali a base di carbonio e danni ai processi metabolici o al DNA attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) quando il Mg si degrada. Inoltre, quando lo zinco (Zn) e il calcio (Ca) sono combinati nella formazione di leghe di Mg, viene migliorata la raffinatezza della granulometria della matrice di Mg, il che porta ad una riduzione dell'adesione batterica alle superfici del substrato rispetto ai campioni di solo Mg14. Per dimostrare l'attività antibatterica, presentiamo il metodo della coltura diretta (metodo C), che determina l'adesione batterica su e intorno a materiali nanostrutturati nel tempo attraverso la quantificazione di unità formanti colonie batteriche (CFU) con contatto superficiale diretto e indiretto.

La geometria delle nanostrutture sulle superfici, comprese le dimensioni, la forma e l'orientamento, potrebbe influenzare le attività battericide dei materiali. Ad esempio, Lin et al.16 hanno fabbricato diversi strati nanostrutturati di MgO sulle superfici dei substrati di Mg attraverso l'anodizzazione e la deposizione elettroforetica (EPD). Dopo un periodo di esposizione alla superficie nanostrutturata in vitro, la crescita di S. aureus è risultata sostanzialmente ridotta rispetto al Mg non trattato. Ciò ha indicato una maggiore potenza della superficie nanostrutturata contro l'adesione batterica rispetto alla superficie metallica Mg non trattata. Per rivelare i diversi meccanismi delle proprietà antibatteriche di varie superfici nanostrutturate, in questo articolo viene discusso un metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D) che determina le interazioni cellula-superficie all'interno dell'area di interesse.

L'obiettivo di questo articolo è presentare quattro metodi in vitro applicabili a diverse nanoparticelle, superfici nanostrutturate e specie microbiche. Discutiamo le considerazioni chiave per ciascun metodo per produrre dati coerenti e riproducibili per la comparabilità. In particolare, il metodo di cocoltura diretta17 e il metodo dell'esposizione diretta sono utilizzati per esaminare le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle. Attraverso il metodo della co-coltura diretta, le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime (MIC e MBC90-99,99, rispettivamente) possono essere determinate per le singole specie e la concentrazione più potente (MPC) può essere determinata per più specie. Attraverso il metodo dell'esposizione diretta, gli effetti batteriostatici o battericidi delle nanoparticelle a concentrazioni minime inibitorie possono essere caratterizzati da letture della densità ottica in tempo reale nel tempo. Il metodo della coltura diretta14 è adatto per esaminare i batteri direttamente e indirettamente a contatto con superfici nanostrutturate. Infine, viene presentato il metodo dell'esposizione a contatto focalizzato16 per esaminare l'attività antibatterica di un'area specifica su una superficie nanostrutturata attraverso l'applicazione diretta di batteri e la caratterizzazione della crescita batterica all'interfaccia cellula-nanostruttura. Questo metodo è modificato dallo standard industriale giapponese JIS Z 2801:200016 e ha lo scopo di concentrarsi sulle interazioni microbo-superficie ed escludere gli effetti della degradazione del campione di massa in coltura microbica sulle attività antimicrobiche.

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Protocol

Per presentare i metodi di co-coltura diretta e di esposizione diretta, utilizziamo nanoparticelle di ossido di magnesio (nMgO) come materiale modello per dimostrare le interazioni batteriche. Per presentare la coltura diretta e i metodi di esposizione a contatto focalizzato, utilizziamo una lega Mg con superfici nanostrutturate come esempi.

1. Sterilizzazione dei nanomateriali

NOTA: Tutti i nanomateriali devono essere sterilizzati o disinfettati prima della coltura microbica. I metodi che possono essere utilizzati includono calore, pressione, radiazioni e disinfettanti, ma la tolleranza dei materiali per ciascun metodo deve essere identificata prima degli esperimenti in vitro .

  1. Nanoparticelle
    NOTA: I campioni possono essere conservati in un solvente organico come l'etanolo o confezionati in un piatto o in una scatola seguita da sterilizzazione o disinfezione in modo appropriato. Le nanoparticelle sono state sterilizzate utilizzando il seguente metodo per la dimostrazione del metodo di co-coltura diretta17 e del metodo di esposizione diretta.
    1. Sterilizzare le nanoparticelle di MgO in un forno a convezione a 200 °C30 per 60 minuti prima di ogni esperimento in vitro .
      NOTA: Questo metodo è stato scelto perché il vapore acqueo e la luce UV possono influenzare le strutture delle nanoparticelle di MgO (nMgO)17.
  2. Materiali sfusi
    NOTA: I materiali nanostrutturati sono stati sterilizzati con il seguente metodo per la dimostrazione del metodo di coltura diretta.
    1. Per il metodo di coltura diretta14, disinfettare i campioni ZC21, Mg e T64 preparati utilizzando radiazioni ultraviolette (UV) per 4 ore prima di iniziare gli studi in vitro .
    2. Per il metodo di esposizione a contatto focalizzato16, disinfettare tutti i campioni utilizzando radiazioni UV per 2 ore prima di iniziare gli studi in vitro .
  3. In alternativa, utilizzare l'ossido di etilene (EtO) per la sterilizzazione di materiali sensibili al calore.

2. Metodo della cocoltura diretta (metodo A)

NOTA: Nel metodo A, i batteri in una coltura di semina in fase lag vengono miscelati direttamente con nanoparticelle di determinate concentrazioni. Per l'esame delle attività antimicrobiche delle nanoparticelle, seguiamo un protocollo descritto da Nguyen et al.17.

  1. Caratterizzazione di nanoparticelle e nanostrutture
    NOTA: La composizione e la forma della nanostruttura sono confermate utilizzando la diffrazione della polvere a raggi X.
    1. Misurazione delle nanoparticelle
      1. Pesare le nanoparticelle a 9 volte la massa desiderata per mL per contenere 3 mL di campioni in triplice copia. Ad esempio, pesare 0,2 mg/mL nMgO a 1,8 mg/ml.
        NOTA: Ciò garantisce la distribuzione coerente delle nanoparticelle nelle colture batteriche e nei brodi.
      2. Misurare tutte le nanoparticelle in una provetta da microcentrifuga da 5,0 mL che è stata pre-pesata e tarata utilizzando una bilancia analitica.
  2. Preparazione e crescita di colture batteriche
    1. Per ogni esperimento in vitro , recuperare le scorte di cellule batteriche dallo stoccaggio a -80 °C. Aggiungere 10 μL di ogni stock di cellule batteriche in 5 ml di un terreno di crescita appropriato.
    2. Introdurre il mezzo inoculato in un incubatore-agitatore a 37 °C e 250 giri/min per circa 16 ore durante la notte.
      1. Se vengono coltivate specie di Staphylococcus , sottocoltura ponendo 400 μL di ogni coltura notturna in 20 ml di terreno di crescita fresco (100 μL/5 mL di terreno) e incubare agitando a 37 °C e 250 giri/min per ulteriori 4-6 ore.
  3. Lavaggio e conteggio delle cellule batteriche per determinare la densità di semina
    NOTA: La densità di semina desiderata di 7,8 × 106 CFU/mL è stata identificata come il numero di cellule superiore a quello necessario per confermare un'infezione del tratto urinario.
    1. Raccogliere i batteri coltivati aliquotando 1 mL della coltura batterica durante la notte in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Creare un numero sufficiente di aliquote da colture batteriche notturne e centrifugarle per 10 minuti a 1.956 × g per raggiungere le densità di semina desiderate.
    2. Dopo la centrifugazione, pipettare per rimuovere il surnatante dalle cellule pellettate e posizionare il surnatante in un recipiente di raccolta. Risospendere i pellet cellulari in 0,5 ml di terreno di coltura fresco. Combinare due sospensioni da 0,5 mL per creare 1 mL di sospensione per ridurre a sei il numero di aliquote da 1 mL di cellule risospese. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti a 1.956 × g.
    3. Completare un secondo ciclo di lavaggio utilizzando terreno di coltura fresco, come nella fase 2.3.2, per ridurre a tre il numero di 1 mL di aliquote di cellule lavate risospese.
    4. Completare il terzo ciclo, come al punto 2.3.2, tranne risospendere i pellet cellulari in 0,33 mL di tampone Tris (idrossimetil) tampone amminometano (tampone Tris, pH 8,5). Combinare le tre sospensioni, ciascuna di 0,33 mL di volume, in una microcentrifuga da 1,5 ml. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti a 1.956 × g.
      NOTA: Tris buffer non contiene ioni Mg 2+ o Ca2+ 31. Questo è importante per l'uso della spettrometria di emissione plasma-ottica accoppiata induttivamente (ICP-OES) per misurare gli ioni Mg 2+ e Ca2+ nei brodi post-coltura. Al contrario, i fosfati presenti nella soluzione salina tamponata fosfato (PBS)32, ad esempio, sequestrano entrambi gli ioni Mg 2+ o Ca2+ 33,34,35 e causano confusione nell'interpretazione dei dati ICP-OES.
    5. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone Tris fresco, noto come sospensione cellulare, una coltura di semina batterica in fase lag.
    6. Determinare la concentrazione della sospensione cellulare (cellule/ml) utilizzando un emocitometro.
  4. Creazione della coltura batterica di semina
    NOTA: Il campione ha un volume totale di 3 mL ed è completato in triplice copia (9 mL totali).
    1. Determinare il volume totale di coltura di semina dei batteri necessaria. Per creare la coltura di semina, utilizzare C 1V1 = C 2 V2per calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per creare una coltura di semina di 7,8 × 106 cellule / ml. Aggiungere il volume calcolato della sospensione cellulare (V1) al volume richiesto di terreno di coltura (V2).
    2. Determinare l'effettiva densità di semina dei batteri in CFU / ml. Creare una diluizione seriale di dieci volte a 10-4. Stendere la diluizione 10-4 sull'agar di crescita appropriato e incubare per una notte. Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie e calcolare il CFU/ml.
  5. Formazione di batteri e colture di nanoparticelle
    1. In lastre di polistirene trattate con 12 pozzetti, non trattate con tessuto, aliquote 2 ml della coltura di semina batterica in ciascun pozzetto per il numero di pozzetti necessari.
    2. Per ogni provetta da microcentrifuga da 5 mL contenente nMgO prepesato, aggiungere 3 mL di coltura di semina batterica. Vortice brevemente per mescolare l'nMgO con i batteri. Aliquot 1 mL della miscela in tre pozzetti separati per creare i campioni triplicati di ciascun peso premisurato di nMgO. Pipet la miscela batteri/nMgO 2-3 volte prima di ogni aliquota da 1 mL per mantenere nMgO in sospensione.
      NOTA: I campioni di controllo saranno costituiti da 3 ml di sole cellule, 3 ml di soli terreni e 3 ml contenenti le concentrazioni più basse e più alte di nanoparticelle utilizzate. Questi sono preparati come al punto 2.5.2. Tutti i campioni di controllo sono completati in triplice copia.
    3. Incubare tutte le piastre a 12 pozzetti a 37 °C e 120 giri/min per 24 ore.
  6. Determinazione della crescita delle cellule batteriche dopo esposizione a nMgO
    1. Dopo l'incubazione notturna delle colture batteriche, raccogliere ogni campione di 3 ml mediante pipettaggio in un singolo tubo conico da 15 ml.
    2. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti per creare diluizioni seriali 1:10. Determinare il numero di colonne necessarie per diluire in serie tutti i campioni contenenti batteri. Aggiungere 180 μL di buffer Tris a ciascun pozzetto nella riga B alla riga G per il numero appropriato di colonne.
    3. Vortice brevemente ogni tubo conico da 15 mL contenente campioni batterici e aggiungere 50 μL a un singolo pozzetto nella fila A.
    4. Per ogni pozzetto nella riga A, trasferire 20 μL nella riga B (ad esempio, da A1 a B1) e mescolare brevemente mediante pipettaggio per ottenere un volume di 200 μL. Utilizzando una punta di pipetta sterile, trasferire 20 μL dal pozzetto nella fila B al pozzetto nella fila C. Continuare questo schema fino a quando il pozzetto nella fila G contiene 200 μL, completando una diluizione seriale da 10−1 nella riga B a 10−6 nella riga G.
    5. Pipet 100 μL di ciascun pozzetto su una piastra di agar di crescita appropriata e distribuito attraverso la piastra per disperdere la coltura cellulare. Posizionare le piastre in un incubatore-agitatore per una notte a 37 °C. Incubare le piastre a 37 °C per 24 h.
    6. Esamina le piastre e conta quelle che hanno circa 25-300 colonie. Se possibile, scegliere piastre con lo stesso valore di diluizione. Utilizzare il numero di colonie per piastra per calcolare la CFU/mL.
  7. Valutazione del pH post-incubazione
    NOTA: seguire le istruzioni del produttore per ciascun modello di pHmetro.
    1. Pre-calibrare un pHmetro utilizzando soluzioni standardizzanti di pH 4, pH 7 e pH 10. Leggere ogni campione batterico posizionando la sonda di pH nel tubo conico da 15 ml.
  8. Preparazione dei campioni per ICP-OES
    NOTA: ICP-OES viene utilizzato per determinare la concentrazione di ioni Mg 2+ e Ca2+. Questi cationi sono considerati importanti, poiché ciascuno partecipa al metabolismo cellulare.
    1. Centrifugare ogni tubo conico da 15 mL preparato al punto 2.6.1 per 5 minuti a 5.724 × g per pellettare i detriti cellulari e le nanoparticelle.
    2. Utilizzando un tubo conico da 15 ml, diluire 30 μL del surnatante in 2,97 mL di acqua filtrata da 18,2 Ω per creare una diluizione 1:100.
      NOTA: Il fattore di diluizione può essere regolato in base alle concentrazioni ioniche previste e al limite di rivelazione dello spettrometro.
    3. Leggere gli esempi utilizzando ICP-OES.

3. Metodo dell'esposizione diretta (metodo B)

NOTA: Se il tasso di crescita dei batteri scelti è sconosciuto, è necessario completare una standardizzazione della curva di crescita prima di implementare questo metodo.

  1. Determinare le attività batteriostatiche e battericide in tempo reale dopo l'esposizione alle nanoparticelle di interesse.
    1. Preparare le concentrazioni desiderate di nanoparticelle utilizzando i metodi descritti nei punti 2.1-2.1.2.2. Preparare due serie di ogni peso di nanoparticelle da utilizzare: una da aggiungere a 3 ml di aliquote di coltura batterica nella fase di crescita logaritmica e l'altra da aggiungere a 3 ml di aliquote di terreno di crescita senza batteri come gruppi di controllo.
    2. Determinare gli antibiotici batteriostatici e battericidi appropriati per le specie batteriche da testare.
      NOTA: È richiesta la conoscenza della concentrazione minima inibitoria per ciascun antibiotico.
  2. Calcolare il volume totale di coltura batterica necessaria per triplicare i campioni da 3 ml per tutti i campioni di nanoparticelle, antibiotici e di controllo.
    NOTA: è richiesto un volume uguale di terreno di crescita sterile. Se è previsto l'uso della spettrofotometria, ciò richiede adeguamenti al volume totale necessario per la sistemazione del volume da 0,5 mL a 1,0 mL necessario per le cuvette.
  3. Giorno 1: Per ogni esperimento in vitro, creare scorte overnight seguendo i passaggi 2.2.1-2.2.2.
  4. Giorno 2: Verificare che le impostazioni del lettore di piastre possano ospitare una piastra a 96 pozzetti con una densità ottica di 600 nm. Misurare i campioni in aliquote da 200 μL utilizzando una piastra a 96 pozzetti.
    1. Determinare una coltura batterica iniziale OD600 a 0,01, la densità utilizzata per iniziare il periodo di incubazione iniziale prima dell'aggiunta di nanoparticelle e antibiotici.
    2. Raccogliere la coltura batterica durante la notte dall'incubatore-shaker.
      1. Per ogni materiale (ad esempio, nanoparticelle pre-misurate o antibiotici) da testare, creare una coltura batterica separata a un OD600 di 0,01. Utilizzare un contenitore abbastanza grande da contenere il volume di coltura cellulare necessario (ad esempio, un pallone Erlenmeyer sterilizzato o tubi conici da 50 ml).
      2. Diluire i campioni batterici durante la notte con terreno di coltura posizionando tre aliquote da 200 μL del terreno di crescita in tre pozzetti e tre aliquote da 200 μL della coltura batterica in ulteriori pozzetti (ad esempio, da A1 a A6).
      3. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre e scansionarla.
        NOTA: le letture vengono mediate per ogni pozzetto scansionato per produrre un valore medio.
      4. Per calcolare la densità dei batteri in sospensione, calcolare la media del valore medio per ciascun pozzetto contenente un campione triplicato.
      5. Per determinare la densità ottica dei batteri, sottrarre la media del campione di brodo dalla media batterica.
      6. Se è necessario continuare a regolare la sospensione batterica, continuare ad aggiungere brodo o coltura batterica durante la notte, se necessario, e ripetere la scansione nel lettore di piastre se necessario fino a raggiungere un OD600 di circa 0,01.
      7. Incubare a 37 °C agitando a 150 giri/min fino a raggiungere la crescita logaritmica.
  5. Rimuovere le colture batteriche dallo shaker dell'incubatore.
    1. Aliquote 3 mL della coltura batterica OD600 0,01 in provette coniche marcate da 15 mL per campioni di prova e di controllo in triplice copia.
    2. Aliquot 200 μL della coltura batterica in tre pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e misurare i campioni utilizzando il lettore di piastre.
    3. Calcolare le letture come descritto in precedenza al punto 3.4.2.2 e al punto 3.4.2.6 - la "lettura -0,5 h".
  6. Creazione e misurazione di miscele batteriche/nanoparticelle
    1. Aliquot 3 mL di terreno di crescita sterile in numero uguale alle colture batteriche in provette coniche marcate da 15 mL per campioni di controllo (in triplice copia).
    2. Per preparare sospensioni di batteri/nanoparticelle e sospensioni di mezzi sterili/nanoparticelle, rimuovere 1 mL di coltura batterica o terreno da ogni triplice set di tubi conici da 15 ml.
      1. Introdurre le aliquote da 1 mL in una provetta da centrifuga da 5 mL contenente nanoparticelle pre-misurate e mescolare brevemente il vortice.
      2. Dalla provetta da centrifuga da 5 mL, restituire 1 mL di aliquote delle sospensioni batteriche/nanoparticelle o medie/nanoparticelle al tubo conico da 15 mL per distribuire le nanoparticelle in modo omogeneo.
        NOTA: Pipet la miscela batteri/nanoparticelle 2x-3x prima che ogni aliquota da 1 mL venga pipettata per mantenere le nanoparticelle in sospensione.
  7. Creazione e misurazione di miscele batteriche/antibiotiche
    1. Per creare le colture batteriche/antibiotiche, aliquote 3 mL della coltura batterica incubata nei tubi conici da 15 mL marcati corrispondentemente.
    2. Dopo aver preparato tutti i campioni, versare 200 μL di ciascun campione nei singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
    3. Inserire le piastre nel lettore di piastre e avviare la scansione della lettura "0 h".
    4. Introdurre i tubi conici da 15 mL contenenti i campioni in un incubatore-agitatore a 37 °C e 150 giri/min. Registrare tutti i dati come descritto in precedenza nei punti 3.4.2.2 e 3.4.2.6.
  8. Circa 15 minuti dopo aver completato la lettura di 0 ore, ripetere i passaggi descritti nei passaggi 3.7.2-3.7.3-la lettura "0,5 h".
    1. Dopo le 0 ore stabilite, ripetere i passaggi descritti al punto 3.7.2-passo 3.7.3 ogni 90 minuti per sei cicli; completo in 9 h.
    2. Al termine del sesto ciclo, porre i campioni nell'incubatore-agitatore per ulteriori 15 ore a 37 °C e 150 giri/min. Ripetere i passaggi descritti nei passaggi 3.7.2-3.7.3 per ottenere la lettura delle 24 ore. Registrare tutti i dati come descritto in precedenza nei punti 3.4.2.2 e 3.4.2.6.

4. Metodo della coltura diretta (metodo C)

NOTA: Nel metodo C, i batteri in una coltura di semina in fase di ritardo sono posizionati direttamente sulle superfici nanostrutturate di interesse. Per l'esame delle attività antimicrobiche della nanostruttura, seguiamo un protocollo descritto da Zhang et al.14. Per dimostrare questo metodo di coltura diretta, sono stati utilizzati come campioni ZC21 (lega Mg-Zn-Ca) e perni Mg.

  1. Preparazione e crescita delle colture batteriche
    1. Per ogni esperimento in vitro, creare scorte overnight seguendo le fasi da 2.2.1 a 2.2.2.
  2. Lavaggio e conteggio dei batteri per determinare la densità di semina
    NOTA: La densità di semina desiderata di 7,5 × 105 CFU/mL è stata identificata come la concentrazione cellulare riportata che causa infezioni ortopediche14.
    1. Recuperare la coltura batterica durante la notte dall'incubatore-shaker.
    2. Lavare e raccogliere i batteri, seguendo i passaggi 2.3.2-2.3.2.3, ma sostituire il mezzo fresco con un fluido corporeo simulato rivisto (rSBF) per ogni fase di lavaggio.
      NOTA: rSBF è una soluzione tampone che imita la concentrazione ionica del plasma sanguigno umano. Tuttavia, rSBF contiene solo composti inorganici ed è privo di composti bioorganici come le proteine. Per risolvere questo problema, il siero bovino fetale (FBS) viene combinato con rSBF per simulare la composizione del sangue umano per imitare meglio la formazione naturale di apatite nei tessuti calcificati in condizioni sperimentali36.
    3. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di rSBF integrato con il 10% di FBS, la sospensione cellulare.
    4. Determinare la concentrazione della sospensione cellulare (cellule/ml) utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 7,5 × 105 cellule/ml in rSBF integrato con FBS al 10%. Creare una cultura di semina seguendo il passaggio 2.4.1.
    5. Determinare la densità effettiva di semina seguendo il punto 2.4.2.
  3. Distribuire la sospensione cellulare batterica sui campioni nei pozzetti di coltura.
    1. Posizionare sia i campioni che i campioni di controllo nei singoli pozzetti di una lastra di polistirene trattata con 48 pozzetti non tessuto.
    2. Aliquot 0,75 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto contenente i campioni e i controlli. Collocare la/e piastre-piastre-pozzetto in un incubatore-agitatore per 24 ore a 37 °C agitando a 120 giri/min.
  4. Caratterizzazione della concentrazione batterica
    1. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere i campioni e metterli in provette di raccolta separate ed etichettate.
    2. Raccogliere due campioni da ciascun gruppo e metterli singolarmente in provette da microcentrifuga da 5,0 ml etichettate. Aggiungere 2 mL di rSBF a ciascun tubo.
    3. Posizionare i campioni raccolti al punto 4.4.2 in un bagno di sonicazione e sonicare per 10 minuti. Dopo ogni periodo di 5 minuti, vortice ogni campione per 5 s.
    4. Raccogliere l'rSBF contenente le cellule batteriche appena staccate e posizionare la sospensione in una provetta di microcentrifuga fresca etichettata.
  5. Diluizioni seriali e placcatura dei batteri
    1. Diluire e placcare in serie la sospensione batterica seguendo i punti 2.6.2-2.6.6.
  6. Valutare il pH post-incubazione dei terreni di coltura seguendo il passaggio 2.7.
  7. Preparare il terreno di coltura per ICP-OES seguendo i metodi descritti al punto 2.8.

5. Metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D)

NOTA: Nel metodo D, i batteri su una carta da filtro nitrocellulosa vengono messi a diretto contatto con un'area di interesse sulle superfici nanostrutturate. Questo metodo riduce al minimo l'interferenza della degradazione del campione di massa nelle colture batteriche con le attività batteriche. Per esaminare le attività antimicrobiche delle nanosuperfici, seguiamo un protocollo descritto da Lin et al.16.

  1. Seguire le procedure descritte nei passaggi 2.2.1-2.2.2.1 per creare una coltura di semina batterica. Confermare l'effettiva densità di semina dopo il punto 2.4.2.
  2. Preparare i campioni in una dimensione di 1 × 1 cm2 in una forma quadrata. Preparare tutti i tipi di campione in triplice copia. Se necessario, posizionare i campioni su un supporto tridimensionale (3D) di 15 mm di diametro per 10 mm di altezza. Collocare il campione e il supporto in un pozzetto di una piastra di polistirene trattata con colture non tissutali.
  3. Preparare carte nitrocellulosiche sterilizzate tagliando ciascuna ad un diametro di 1 cm. Porre le carte nitrocellulosiche preparate su una piastra di agar contenente il mezzo appropriato.
  4. Pipet 50 μL della coltura batterica diluita sulla carta da filtro.
  5. Pipet 50 μL di un mezzo appropriato al centro di ciascuna superficie del campione.
  6. Usando una pinzetta sterilizzata, raccogliere la carta nitrocellulosa dalla superficie dell'agar. Capovolgere con cautela la carta nitrocellulosa e posizionarla sulla superficie del campione in modo che i batteri siano in contatto con i 50 μL di terreno e la superficie nanostrutturata di interesse.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone Tris a ciascun pozzetto contenente un campione per mantenere l'umidità. Incubare la piastra del pozzetto di polistirolo contenente tutti i campioni a 37 °C per 24 h.
  8. Raccogliere la carta nitrocellulosa da ciascuna superficie del campione. Introdurre ciascuno in 5 ml di tampone Tris. Vortice le carte da filtro raccolte e campioni di materiale nanosuperficiale per 5 s.
  9. Sonicare ogni campione per 10 minuti. Vortice per 5 s dopo 5 minuti e di nuovo dopo 10 minuti.
  10. Raccogliere le sospensioni tampone Tris da tutti i campioni e posizionare ogni volume in singole provette di raccolta fresca.
  11. Diluire e placcare in serie i campioni seguendo i punti 2.6.2-2.6.6.

6. Caratterizzazione post-coltura di batteri e nanomateriali

  1. Esame dell'adesione e morfologia batterica mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)
    1. Dopo l'incubazione durante la notte, aggiungere il 10% di glutaraldeide in ciascun pozzetto della piastra di polistirene trattata con 48 pozzetti non trattati con tessuto fino a quando i campioni non sono completamente coperti. Incubare i campioni per 1 ora per fissare le cellule batteriche.
    2. Aspirare la glutaraldeide in una bottiglia di scarto e sciacquare tutti i campioni 3 volte con la soluzione tampone Tris per rimuovere i batteri non aderenti.
    3. Disidratare i campioni utilizzando etanolo al 30%, 75% e 100% per 30 minuti ogni16.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare un essiccatore a punti critici per asciugare i campioni. Non è ideale asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente per 24 ore.
    4. Utilizzare nastri adesivi conduttivi, come nastri di rame o carbonio, per fissare i campioni su un tronco SEM. Rivestire le superfici del campione tramite rivestimento sputter per fornire conduttività prima dell'imaging (ad esempio, rivestire piastre Mg con batteri aderenti sotto platino/palladio (Pt/Pd) per 45 s a 20 mA16).
      NOTA: i materiali di rivestimento, il tempo di lavorazione e la corrente operativa possono variare a seconda del tipo di campione.
    5. Scattare immagini dei batteri sui campioni utilizzando SEM con una distanza di lavoro appropriata e una tensione di accelerazione e agli ingrandimenti desiderati. Ad esempio, utilizzare un SEM con un rilevatore di elettroni secondario per acquisire immagini a una distanza di lavoro di 5 mm e una tensione di accelerazione di 10 kV16.
  2. Esaminare la morfologia superficiale di campioni di nanomateriali post-coltura utilizzando SEM.
    1. Per i nanomateriali, lavare i campioni utilizzando il tampone Tris 3x per rimuovere i batteri liberi che non sono attaccati al campione. Per le nanoparticelle, disperdere le particelle in un solvente che non influisce sulle proprietà del campione attraverso l'ultrasonicazione per ottenere una migliore dispersione quando necessario.
    2. Asciugare i campioni dopo la procedura di lavaggio.
    3. Utilizzare nastri biadesivi in carbonio o rame per far aderire i campioni sul tronco SEM.
    4. Creare uno strato superficiale conduttivo di Pt/Pd utilizzando un rivestimento sputter, come descritto al punto 6.1.4, prima dell'imaging. Prendere le immagini di esempio come descritto al punto 6.1.5.
    5. Analizzare la composizione elementare superficiale utilizzando EDS con una tensione di accelerazione appropriata e agli ingrandimenti desiderati (ad esempio, a 10 kV dopo aver eseguito l'analisi SEM16).
  3. Imaging a fluorescenza dell'adesione batterica
    1. Preparare i campioni da visualizzare utilizzando la microscopia a fluorescenza lavandoli prima con tampone Tris 3x. Asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente.
    2. Colorare ogni campione con colorante di fluorescenza tioflavina T da 10 μM seguendo il protocollo stabilito37.
    3. Eseguire l'imaging a fluorescenza dell'adesione batterica utilizzando un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale del dispositivo ad accoppiamento di carica che moltiplica gli elettroni.

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Representative Results

L'identificazione dell'attività antibatterica delle nanoparticelle di ossido di magnesio e delle superfici nanostrutturate è stata presentata utilizzando quattro metodi in vitro applicabili a diversi tipi di materiali e specie microbiche.

Il metodo A e il metodo B esaminano le attività batteriche quando esposte a nanoparticelle in una fase di ritardo (metodo A) e in una fase logaritmica (metodo B) per una durata pari o superiore a 24 ore. Il metodo A fornisce risultati per quanto riguarda MIC e MBC, mentre il metodo B determina gli effetti inibitori rispetto a quelli battericidi delle nanoparticelle. Il metodo C esamina le attività batteriche con contatto diretto e indiretto con superfici nanostrutturate e il metodo D esamina le attività batteriche su un'area selezionata di un'interfaccia cellula-nanostruttura per una durata di 24 ore o più.

I metodi utilizzati sono descritti nella Figura 1 e nella Figura 2 e i relativi risultati sono presentati nelle Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, Figure 7 e Figure 8. I risultati sperimentali rappresentativi che quantificano l'attività antimicrobica di nMgO contro batteri e lieviti gram-negativi e gram-positivi possono essere visualizzati nella Figura 3. Le attività antibatteriche di nMgO e nMg(OH)2 contro MRSA possono essere visualizzate nella Figura 4. Le attività antibatteriche delle superfici nanostrutturate contro MRSA possono essere visualizzate in Figura 5 e Figura 6. Infine, l'attività antibatterica delle leghe di magnesio contro E. coli può essere vista nella Figura 8B.

Utilizzando il metodo A, è possibile determinare le MIC e le MBC per i batteri esposti alle nanoparticelle utilizzando metodi e materiali coerenti. Questa coerenza consente di effettuare confronti tra le specie utilizzando gli MBC identificati per determinare la concentrazione più potente di nanoparticelle testate. Inoltre, questo metodo può essere applicato ad altre classificazioni di microrganismi per confronti di MIC e concentrazioni minime letali (MLC17). Qui, le nanoparticelle sterilizzate sono state pre-misurate in una quantità che consente di triplicare ogni concentrazione richiesta. Queste nanoparticelle sono state sospese in una coltura di semina monobatterica in fase lag-phase con una densità di 6 × 10 6-8 × 106 cellule / ml. Il metodo descritto per sospendere le nanoparticelle pre-misurate con coltura di semina o brodo ha creato con successo campioni triplicati relativamente omologhi nella distribuzione delle nanoparticelle, che possono ridurre la deviazione in CFU / mL all'interno di campioni triplice. Il flusso di lavoro sperimentale per questo metodo è illustrato nella Figura 1A. Una dimostrazione degli effetti antimicrobici di nMgO su batteri gram-negativi e gram-positivi e Candida spp. utilizzando il metodo A è possibile vedere nella Figura 3. Qui, per queste specie è stata identificata una MIC di 1,0 mg/mL nMgO per Escherichia coli gram-negativo e Pseudomonas aeruginosa, nonché un MBC 99,99 di 1,0 mg/mL e 1,6 mg/mL nMgO, rispettivamente (Figura 3A). S. epidermidis, S. aureus e MRSA gram-positivi hanno dimostrato MIC di 0,5 mg / ml, 0,7 mg / ml e 1,0 mg / mL nMgO, rispettivamente. I valori di MBC 99,99 di 1,6 mg/mL e 1,2 mg/mL nMgO sono stati identificati rispettivamente per S. epidermidis e S. aureus, mentre MRSA non è stato ridotto oltre MBC90 (Figura 3B). In Candida spp., C. albicans e C. albicans FR, sono state identificate rispettivamente MICs di 1,2 mg/mL e 1,0 mg/mL nMgO. Al contrario, nMgO ha dimostrato valori di MIC di 1,0 e 0,7 mg / ml per C. glabrata e C. glabrata ER, rispettivamente. Inoltre, ogni specie di Candida ha raggiunto un MBC 90 di 0,7-1,2 mg/mL nMgO, ma solo C.glabrata ER è stato ridotto a MBC 99,99 a1,2 mg/mL nMgO (Figura 3C). Inoltre, nella maggior parte delle specie testate, è stata determinata l'identificazione della concentrazione più potente (MPC) di nMgO. L'MPC indica la concentrazione di nanoparticelle più efficace nelle comunità polimicrobiche17.

Il metodo B espone i batteri nella fase di crescita logaritmica a nanoparticelle di determinate concentrazioni per determinare se le nanoparticelle sono batteriostatiche (inibitorie) o battericide utilizzando gli MBC identificati nel metodo A. Questo metodo utilizza misurazioni di spettrofotometria (OD600) su periodi di tempo discreti per identificare alterazioni nella crescita batterica in risposta all'esposizione alle nanoparticelle. Inoltre, i batteri esposti agli antibiotici batteriostatici o battericidi vengono coltivati contemporaneamente con i batteri esposti alle nanoparticelle in pozzetti separati per fornire un riferimento nell'identificazione di queste attività di nanoparticelle. Le concentrazioni di nMgO e nMg(OH)2 utilizzate sono state derivate da uno studio precedente utilizzando batteri della fase di crescita logaritmica esposti a nMgO e nMg(OH)2. Le concentrazioni di nMgO e nMg(OH)2 sono state identificate utilizzando mM equivalenti compresi tra 5 mM e 50 mM. I risultati hanno mostrato che nMgO era battericida per MRSA a 30 mM (1,2 mg / mL nMgO), mentre nMg (OH) 2 era batteriostatico a 50 mM (2,9 mg / mL nMg (OH) 2). Le concentrazioni di antibiotici utilizzati sono state identificate dalla letteratura e confermate nei nostri esperimenti. Il flusso di lavoro sperimentale per questo metodo è illustrato nella Figura 1B. I risultati rappresentativi per il metodo B possono essere visti nella figura 4. Qui, l'MRSA non esposto alle nanoparticelle è cresciuto esponenzialmente fino a un OD600 di 0,85. Quando esposto a 1,2 mg/mL di nMgO e 6,25 μg/mL di trimetoprim, la crescita batterica è stata ridotta a un OD 600 di 0,18 (80,2% e 81,6%, rispettivamente) e 2,9 mg/mL nMg(OH)2 ha ridotto la crescita batterica a un OD600 di 0,25 (70,3%). L'esposizione a 1,0 μl/mL di vancomicina ha comportato una riduzione del 99,99% della crescita di MRSA, suggerendo che le concentrazioni di nMgO e nMg(OH)2 utilizzate qui erano di attività batteriostatica.

Il metodo C esamina l'attività antibatterica delle superfici nanostrutturate. Una coltura batterica in fase di crescita ritardata è stata seminata direttamente su una superficie nanostrutturata per misurare i CFU con o senza contatto diretto con la superficie. Utilizzando questo metodo, è stato possibile determinare gli effetti superficiali sull'adesione batterica e sulla vitalità in condizioni di contatto diretto. I batteri a diretto contatto con le superfici nanostrutturate e a contatto indiretto (in sospensione di coltura) sono stati raccolti e quantificati in CFU/mL per determinare la crescita batterica in ogni condizione. Questi dati ottenuti possono essere utili nelle applicazioni a valle di materiali nanostrutturati su superfici per uso clinico, dove si desidera una riduzione della colonizzazione batterica su strutture superficiali. Il flusso di lavoro sperimentale per questo metodo è illustrato nella Figura 2A. I risultati rappresentativi per il metodo C possono essere visti nella figura 5. Qui, non c'era inibizione della crescita batterica con contatto indiretto. Tuttavia, l'adesione batterica è stata ridotta per tutti i substrati, in modo più significativo con la lega ZC21, seguita rispettivamente da T64 (titanio), magnesio, solo vetro e lega ZSr41. Questi risultati indicano che ZC21 ha avuto la più forte attività antibatterica contro l'adesione e la crescita di MRSA per tutti i campioni testati14.

Il metodo D esamina l'attività antibatterica in un'area selezionata di interesse all'interfaccia cellula-nanostruttura attraverso il posizionamento diretto di batteri nella carta da filtro su una superficie nanostrutturata. Utilizzando questo metodo, èpossibile identificare una correlazione tra attività antibatterica e proprietà superficiali, come la chimica superficiale, la rugosità e l'area della superficie nanostrutturata. Il flusso di lavoro sperimentale per questo metodo è illustrato nella Figura 2B. I risultati rappresentativi per il metodo D possono essere visti nella figura 6. Qui, non è stato identificato S. aureus vitale sui campioni 1.9A, 1.9 AA ed EPD o sulle loro carte da filtro accoppiate. Tuttavia, l'esposizione ai campioni EPD dopo la ricottura (A-EPD) ha ridotto la crescita batterica a poche cellule sulla superficie nanostrutturata e sulla carta da filtro accoppiata. Anche il campione contenente magnesio (Mg) non ha avuto crescita batterica, ma i batteri vitali sono stati isolati dalla carta da filtro accoppiata. Una riduzione della crescita di S. aureus non è stata osservata con i campioni di titanio e vetro o le loro carte da filtro accoppiate16.

Oltre all'uso dei metodi sopra descritti per determinare le attività antimicrobiche, la microscopia SEM e fluorescenza può essere utilizzata per caratterizzare i cambiamenti morfologici che si verificano nei microrganismi dopo l'esposizione a nanoparticelle e materiali nanostrutturati. Le immagini rappresentative SEM che mostrano l'Escherichia coli gram-negativo post-esposizione sono presentate nella Figura 7A, e quelle che mostrano il S. aureus gram-positivo post-esposizione sono presentate nella Figura 7B. Utilizzando la tecnica di imaging SEM con un ingrandimento 5.000x, è stato possibile identificare cambiamenti fenotipici in E. coli esposti a concentrazioni di 0,5 mg / mL nMgO o superiori17. La microscopia a fluorescenza può anche essere utilizzata per caratterizzare i cambiamenti morfologici nei microrganismi, ma con costi potenzialmente inferiori e una maggiore accessibilità rispetto al SEM. La figura 8 mostra immagini rappresentative di fluorescenza di E. coli esposto al materiale nanostrutturato MgY_O per 1 giorno, 2 giorni e 3 giorni, nonché E. coli di riferimento. Inizialmente è stata utilizzata solo una specie batterica, E. coli. In futuro, prenderemo in considerazione l'esposizione di ulteriori specie batteriche agli stessi materiali di interesse per produrre una comprensione più completa delle risposte batteriche all'esposizione MgY_O. In questi risultati, le singole cellule e colonie di E. coli potrebbero essere visualizzate e visualizzate utilizzando la colorazione T della tioflavina e un microscopio a fluorescenza per l'analisi qualitativa dell'attività antibatterica di MgY_O15.

Figure 1
Figura 1: Diagrammi schematici per determinare le nanoparticelle MIC o MBC90-99.99 e le attività batteriostatiche o battericide in colture cellulari post-esposizione . (A) Metodo di cocoltura diretta17. B) Metodo dell'esposizione diretta. Abbreviazioni: CFU = unità formanti colonie; NPs= nanoparticelle; OD600 = densità ottica a 600 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrammi schematici per determinare la crescita batterica con contatto diretto e indiretto e all'interfaccia cellula-nanostruttura di superfici nanostrutturate. A) Metodo della coltura diretta14. B) Metodo di esposizione a contatto focalizzato16. Abbreviazioni: CFU = unità formanti colonie; SEM = microscopia elettronica a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rappresentazione di batteri e lieviti vitali quantificata mediante CFU/mL 24 ore dopo l'esposizione a 0-2,0 mg/mL nMgO. (A) CFU/mL di batteri gram-negativi, inclusi E. coli e P. aeruginosa. (B) CFU/ml di batteri gram-positivi, tra cui S. epidermidis, S. aureus e S. aureus meticillino-resistente. (C) CFU/ml di C. albicans sensibile ai farmaci, C. albicans FR resistente ai farmaci, C. glabrata sensibile ai farmaci e C. glabrata ER. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard (N = 9). *p ≤ 0,05, significativamente inferiore rispetto ai gruppi a 0-0,7 mg/mL nMgO per il rispettivo batterio o lievito. ^p ≤ 0,05, significativamente inferiore ai gruppi a 0-1 mg/mL nMgO per il rispettivo microrganismo. #p ≤ 0,05, significativamente inferiore rispetto ai gruppi a 0-0,5 mg/mL nMgO per il rispettivo microrganismo. &p ≤ 0,05, significativamente inferiore rispetto ai gruppi a 0-0,3 mg/mL nMgO per il rispettivo microrganismo17. Questa cifra è modificata da Nguyen et al.17. Abbreviazioni: FR = resistente al fluconazolo; ER = resistente all'echinocandina; nMgO = nanoparticelle di ossido di magnesio; CFU = unità formanti colonie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rappresentazione delle letture della densità ottica (OD600) prese in tempo reale per S. aureus resistente alla meticillina. Esposizione a MRSA a 1,2 mg/mL di nMgO, 2,9 mg/mL di nMg(OH)2, 6,25 μg/mL di trimetoprim e 1,0 μg/mL di vancomicina per 24 ore. p ≤ 0,025: la crescita di MRSA esposta a 1,0 μg/mL di vancomicina a 0,5 h è significativamente inferiore alla crescita di MRSA esposta a 2,9 mg/mL Mg(OH)2 a 7,5 ore. ^p ≤ 0,025: la crescita di MRSA esposto a 1,0 μg/mL di vancomicina a 24 ore dopo l'inoculazione è significativamente inferiore alla crescita di MRSA esposta a 2,9 mg/mL di Mg(OH)2 a 24 ore. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Rappresentazione di S. aureus vitale meticillino-resistente quantificata mediante CFU/ml a 24 ore dopo l'esposizione a campioni e controlli. I batteri sono stati seminati ad una densità effettiva di 7,5 × 105 cellule / ml e confermati da CFU / ml. I dati sono rappresentati come la media ± deviazione standard, n = 3; *p < 0,05. Equation 1p < 0,05 rispetto al CFU sui campioni ZC21. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Quantificazione rappresentativa mediante CFU/mL della densità di semina batterica 24 ore dopo l'esposizione a campioni di Mg trattati in superficie di campioni di controllo di 1,9 A, 1,9 AA, EPD e A-EPD e Mg e Ti. I batteri sono stati seminati ad una densità effettiva di 6 × 106 CFU / ml, come rappresentato dalla linea tratteggiata rossa. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard; n = 3. *p < 0,05. La linea nera continua indica i risultati dell'analisi statistica per la densità batterica sulle superfici del campione. La linea tratteggiata blu indica i risultati dell'analisi statistica per la densità batterica sui filtri che coprono le superfici del campione. Abbreviazioni: CFU = unità formanti colonie; A-EPD = deposizione elettroforetica dopo ricottura; EPD = deposizione elettroforetica prima della ricottura; A = anodizzazione prima della ricottura; AA = anodizzazione dopo ricottura. Questa cifra è stata modificata da Lin et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Immagini SEM rappresentative di E. coli gram-negativo e S. aureus gram-positivo esposti a 0-1,2 mg/mL nMgO. (A) E. coli hanno mostrato una morfologia simile a 1,2 mg/mL a 2,0 mg/mL nMgO. Per questo motivo, un'immagine a 1,2 mg/ml è mostrata come rappresentativa di E. coli esposto a concentrazioni più elevate di nMgO. (B) Anche S. aureus ha mostrato una morfologia simile a 1,2 mg/mL a 2,0 mg/mL nMgO. Per questo motivo, un'immagine a 1,2 mg/ml è mostrata come rappresentativa di S. aureus esposto a concentrazioni più elevate di nMgO17. Barre della scala = 5 μm. nMgO = nanoparticelle di ossido di magnesio. Questa cifra è stata modificata da Nguyen et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Immagini rappresentative di fluorescenza di E. coli aderenti ai substrati con quantificazione a 1 giorno, 2 giorni e 3 giorni di incubazione. (A) Immagini di fluorescenza di E. coli colorato con 10 μM di tioflavina T. (B) Quantificazione di E. coli esposto a materiali di interesse utilizzando cellule/ml. Non c'è stata aderenza batterica a MgY_O dopo 2 giorni di incubazione e una diminuzione dell'aderenza a MgY dopo 3 giorni di incubazione. Barra della scala = 10 μm. Questa cifra è stata modificata da Lock et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Abbiamo presentato quattro metodi in vitro (A-D) per caratterizzare le attività antibatteriche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate. Mentre ciascuno di questi metodi quantifica la crescita batterica e la vitalità nel tempo in risposta ai nanomateriali, esistono alcune variazioni nei metodi utilizzati per misurare la densità iniziale di semina batterica, la crescita e la vitalità nel tempo. Tre di questi metodi, il metodo della cocoltura diretta (A)17, il metodo della coltura diretta (C)14 e il metodo dell'esposizione a contatto focalizzato (D)16, quantificano la crescita batterica e la vitalità dopo un periodo di esposizione ai nanomateriali contando le CFU per unità di volume. In confronto, il metodo dell'esposizione diretta (B) quantifica la crescita batterica tramite misurazioni discrete della densità ottica in tempo reale (OD600). Questo metodo può essere applicato anche ai metodi di co-coltura diretta, coltura diretta e esposizione a contatto focalizzato se ci sono vincoli di tempo per quantificare le CFU e / o è necessaria una lettura della densità batterica in tempo reale per gli studi cinetici. Se non sono noti antibiotici efficaci per le specie batteriche da testare nel metodo di esposizione diretta, è necessario effettuare una ricerca bibliografica per determinare gli antibiotici corretti e i loro valori MIC che fungano da riferimento per i gruppi di nanomateriali. Una conferma dei valori MIC può essere fatta completando una curva di standardizzazione, che traccia la relazione tra i dati di spettrofotometria e la quantificazione delle unità formanti colonie in specifici punti temporali. Questo processo correla il numero di cellule presenti in coltura in punti specifici con la rispettiva densità ottica. Inoltre, i batteri in fase di crescita lag-stage vengono introdotti nelle nanoparticelle nel metodo di co-coltura diretta e le superfici nanostrutturate nei metodi di coltura diretta e di esposizione a contatto focalizzato. Al contrario, i batteri nella fase di crescita logaritmica vengono introdotti nelle nanoparticelle nel metodo dell'esposizione diretta. Inoltre, le densità di semina batterica sono quantificate come cellule/ml nel metodo di co-coltura diretta, nel metodo di coltura diretta e nel metodo di esposizione a contatto focalizzato, mentre la densità ottica (OD600) dei batteri viene misurata per tracciare la crescita in tempo reale nel metodo di esposizione diretta.

Sebbene ciascuno di questi metodi sia simile nel quadro, presentano anche caratteristiche uniche per distinguere gli effetti delle nanoparticelle o delle superfici nanostrutturate sui batteri. Ad esempio, il metodo della co-coltura diretta caratterizza le risposte batteriche all'aumento delle concentrazioni pre-misurate di nanoparticelle mediante quantificazione CFU/mL (Figura 3). Questo metodo genera concentrazioni minime inibitorie e battericide minime (MIC e MBC) di nanoparticelle per le specie microbiche di interesse e, se vengono esaminate più specie, la concentrazione più potente (MPC) di nanoparticelle17. L'identificazione di MIC, MBC90-99.99 e MPC è essenziale per l'applicazione di nanoparticelle nelle applicazioni a valle. Ad esempio, questi dati possono essere applicati agli esami in vivo dell'attività antibatterica delle nanoparticelle mantenendo la citocompatibilità quando sono state identificate anche concentrazioni meno che letali. Al contrario, il metodo di esposizione diretta caratterizza l'attività delle nanoparticelle come batteriostatica o battericida in modo simile alla classificazione degli antibiotici, in cui gli effetti sinergici o indesiderati devono essere identificati prima dell'uso nella ricerca o in contesti clinici.

La caratterizzazione dei composti antibatterici come batteriostatici o battericidi è rilevante per l'uso clinico e la ricerca in vitro e in vivo 38. Per questo motivo, quando si progettano metodi per esaminare queste caratteristiche, è necessario identificare eventuali effetti negativi che possono influire sui risultati. Qui, il metodo dell'esposizione diretta classifica le nanoparticelle come batteriostatiche o battericide per specifiche specie batteriche utilizzando misurazioni in tempo reale della densità ottica a 600 nm (Figura 4). I batteri nella fase di crescita logaritmica vengono miscelati con nanoparticelle a livello MIC per creare sospensioni di batteri e nanoparticelle. Queste sospensioni sono misurate discretamente in tempo reale per determinare gli effetti in corso dell'esposizione alle nanoparticelle sui batteri. Per verificare i risultati ottenuti, i batteri cresciuti contemporaneamente in sospensione con antibiotici batteriostatici e battericidi fungono da riferimento per confermare i tassi di crescita dei batteri esposti alle nanoparticelle.

L'incorporazione di nanoparticelle nelle scienze bioingegneristiche, cliniche e ambientali può avere possibilità di vasta portata, ma l'utilizzo dei dati antibatterici delle nanoparticelle per studi in vitro e in vivo su superfici nanostrutturate è difficile da realizzare. Per questo motivo, abbiamo presentato i metodi di coltura diretta e di esposizione a contatto focalizzato per caratterizzare le attività antibatteriche in vitro di superfici nanostrutturate. Il metodo della coltura diretta esamina gli effetti antibatterici delle superfici nanostrutturate quando i batteri sono a diretto contatto con i materiali di interesse14. Qui, i batteri sospesi in rSBF più 10% FBS sono esposti a superfici nanostrutturate, seguita dalla quantificazione della crescita batterica nel tempo per i batteri a diretto contatto con la superficie e in sospensione che circondano il materiale di interesse (contatto indiretto) utilizzando CFU/mL. In precedenza, i risultati sperimentali che coinvolgono nanostrutture in lega di magnesio (leghe ZC21 e ZSr41) hanno indicato che le attività antibatteriche aumentano quando i batteri sono in contatto diretto con superfici nanostrutturate rispetto al contatto indiretto, dove i batteri rimangono in sospensione con poco o nessun contatto14 (Figura 5). Infine, il metodo a contatto focalizzato caratterizza l'attività antibatterica all'interfaccia tra batteri e una superficie nanostrutturata16. Qui, abbiamo esaminato l'ossido di magnesio anodizzato o depositato elettroforeticamente sulla superficie di una lega di magnesio bioriassorbibile per determinare la potenziale interruzione dell'adesione batterica e della formazione di biofilm nel tempo. L'interruzione della formazione di biofilm può essere fondamentale per i processi di guarigione del paziente poiché i biofilm tendono a eludere le risposte immunitarie dell'ospite e le terapie antibiotiche39 e provocano infezioni estremamente difficili da trattare.

Qui presentiamo un metodo adattato dallo standard industriale giapponese JIS Z 2801:200016. Questo metodo garantisce che i batteri siano attaccati alla carta da filtro nitrocellulosa sterile seguita dall'esposizione a un'area fissa della superficie nanostrutturata. Ciò limita la caratterizzazione degli effetti superficiali sull'attività antibatterica alla sola area di prova. Nei risultati rappresentativi, i campioni di anodizzazione prima della ricottura (1,9 A), anodizzazione dopo ricottura (1,9 AA) e deposizione elettroforetica prima della ricottura (EPD) hanno mostrato effetti significativi sulla riduzione della crescita batterica e sulle corrispondenti carte da filtro rispetto ai campioni di controllo di magnesio, titanio e vetro. Anche la deposizione elettroforetica dopo i campioni di ricottura (A-EPD) è stata efficace nel ridurre la crescita batterica, ma questo risultato è stato meno significativo rispetto ai risultati ottenuti per i campioni 1.9A, 1.9AA ed EPD16 (Figura 6).

In sintesi, ogni metodo in vitro qui presentato è ragionevolmente facile da padroneggiare e incorpora materiali economici e prontamente disponibili. Questi metodi possono essere utilizzati per caratterizzare le interazioni tra una vasta gamma di nanomateriali e specie microbiche che sono di interesse per i ricercatori. Comprendere le somiglianze e le differenze tra questi metodi è necessario per progettare esperimenti ottimali per soddisfare gli obiettivi di ricerca. Qui, le conoscenze scientifiche acquisite da questi metodi in vitro possono essere applicate ad applicazioni mediche a valle in cui gli antibiotici devono essere limitati o rappresentare un approccio sfavorevole.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori apprezzano il sostegno finanziario della National Science Foundation degli Stati Uniti (NSF CBET award 1512764 e NSF PIRE 1545852), del National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), della University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, del Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) e dell'UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant assegnato a Patricia Holt-Torres. Gli autori apprezzano l'assistenza fornita dalla Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) della UC-Riverside per l'uso di SEM / EDS e dal Dr. Perry Cheung per l'uso di XRD. Gli autori desiderano anche ringraziare Morgan Elizabeth Nator e Samhitha Tumkur per la loro assistenza con gli esperimenti e le analisi dei dati. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation o del National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

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References

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Bioingegneria Numero 194 nanoparticelle antimicrobiche superfici nanostrutturate concentrazione minima inibitoria (MIC) concentrazione minima battericida (MBC) dose-dipendente batterio batteri
Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate <em>in vitro</em>
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Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

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