Summary
妊娠の確立は、複雑な胚と子宮のクロストークを含む動的なプロセスです。これらの過程に対する母体の子宮環境の正確な寄与は、依然として活発な研究分野である。ここでは、これらの研究課題に対処するための in vivo 動物モデルの設計を支援するための詳細なプロトコルが提供されています。
Abstract
妊娠が確立されるためには、生存可能な胚盤胞が受容性子宮内膜(子宮内膜)とうまく相互作用して、着床と胎盤形成を促進し、継続的な妊娠を可能にする必要があります。胚の欠陥によって引き起こされる妊娠の成功の限界はよく知られており、 体外 受精(IVF)と生殖補助医療技術の台頭により、ここ数十年で大部分が克服されました。しかし、この分野はまだ、受容性が不十分な子宮内膜によって引き起こされる制限を克服していないため、体外受精の成功率が停滞しています。卵巣によって産生されるホルモンが子宮内膜の月経周期性に関与しているため、卵巣と子宮内膜の機能は密接に絡み合っています。そのため、妊娠のげっ歯類モデルを使用する場合、観察された結果が卵巣または子宮の欠損によるものであるかどうかを確認するのは難しい場合があります。これを克服するために、妊娠への子宮特異的寄与の研究を可能にするために、胚移植または人工脱落膜化を伴う卵巣摘出マウスモデルが開発されました。この記事では、卵巣摘出術の実施方法について説明し、健康なドナーからの胚移植後の人工脱落膜化または妊娠の成功をサポートするための外因性ホルモンを供給するためのさまざまな技術に関する洞察を提供します。これらの技術には、皮下注射、徐放性ペレット、および浸透圧ミニポンプが含まれます。各方法の主な長所と短所について説明し、研究者が特定の研究課題に最適な研究デザインを選択できるようにします。
Introduction
ここ数十年で生殖補助医療の使用が増えるにつれ、受胎に対する多くの障壁が克服され、不妊の問題にもかかわらず多くのカップルが家族を始めることができました1。卵母細胞または精子の欠損は、 体外 受精または細胞質内精子注入を使用してバイパスできることがよくあります。しかし、子宮と子宮内膜受容性に関連する問題は、生殖能力のとらえどころのない「ブラックボックス」のままです2。
妊娠は、高品質の胚が受容性子宮内膜(子宮内膜)とうまく相互作用したときに確立されます。特定の月経周期で妊娠が成功する可能性は低く、約30%です3,4。成功したもののうち、妊娠20週を過ぎて前進するのは50%〜60%のみであり、着床の失敗は20週に達しない妊娠の75%の原因です3。これらの数字は1990年代後半にさかのぼりますが、この分野は、受容性が不十分な子宮内膜によって引き起こされる制限をまだ克服していません。その結果、近年、体外受精の成功率が停滞し、時には低下しています5,6。
原因不明の不妊症の女性は、多くの場合、受容性の窓がずれているか、未知の理由で受容性を達成できません。最近、子宮内膜受容性アレイが開発され、胚移植のタイミングを個人の受容性のウィンドウに合わせて調整する目的で、数百の遺伝子の発現を評価します7,8,9。しかし、この分野は、着床プロセスが完了した後に現れる妊娠合併症の病因についてまだ理解されていません。
女性の生殖器系は非常に動的で、厳密なホルモン管理下にあります。視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸は、卵胞の成熟やエストロゲンとプロゲステロンの活性など、卵巣周期の側面を調節する黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモンの放出を制御します。次に、子宮月経周期はエストロゲンとプロゲステロンによって調節されています10,11。したがって、子宮の生物学的メカニズムの研究は卵巣の影響によって複雑になります。たとえば、がん治療が子宮にどのように影響するかを研究する場合、観察された子宮表現型(妊娠喪失や月経非周期性など)が子宮への直接の侮辱の結果なのか、卵巣の損傷による結果的な影響なのかを区別するのは難しい場合があります。
生殖能力を包括的に理解するためには、妊娠への子宮の寄与を特徴付けなければなりません。重要なことに、この理解は卵巣の制御下にある子宮機能を超えて拡張されなければなりません。これは人間では研究できません。したがって、動物モデルがしばしば採用される。そのため、卵巣摘出術(OVX)は、研究者がホルモンを外因的に供給することにより、げっ歯類の発情周期(月経周期に類似)を調節できるようにするために一般的に使用されています。さらに、OVXは、卵巣の影響とは無関係に子宮反応を研究することを可能にします12。ただし、OVX後にホルモンがすぐに供給されない場合、更年期障害の表現型が発生するため、研究者は慎重に検討する必要があります。
OVXはげっ歯類モデル13,14,15,16,17で頻繁に利用され、適切な訓練後に比較的容易に実施できる。方法は、卵巣のみを取り除くか、卵巣と卵管を切除するか、および動物の年齢によって異なります(成体、サイクリング動物は、表面に黄体が見える大きな卵巣を持っているため、卵巣が視覚化しやすいことを意味します)。同様に、皮下注射14、徐放性ペレット15、浸透圧ミニポンプ18、および卵巣移植を含むホルモン補充の多くの方法が存在する。
この記事では、卵巣摘出術を行い、皮下注射、徐放性ペレット、浸透圧ミニポンプを含む3種類のホルモン補給を準備する方法について詳しく説明します。OVXとそれに続く外因性ホルモン補給(胚移植および人工脱落膜化)の恩恵を受ける実験エンドポイントには、2つの詳細なプロトコルが提供されています。この記事では、特に妊娠と生殖能力の研究分野で、子宮への影響を分離するための研究を実行する方法について研究者を導くことを目的として、各アプローチの長所と短所について説明します。
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Protocol
すべての動物は、温度管理された高バリア施設(モナッシュ大学動物研究所)に収容され、無料の食料と水へのアクセスと12時間の明暗サイクルがありました。すべての手順は、モナッシュ動物研究プラットフォーム倫理委員会(#21908、17971)の承認に従って実行され、動物の世話と使用に関する国立保健医療研究評議会の行動規範に従って実行されました。
1.外科的準備
- 処置に必要なすべての手術器具、ガーゼ、ペーパータオルを、121°Cのハード/ドライグッズサイクルで、保持時間30分、乾燥時間30分でオートクレーブします。
- 手術用ワークスペース用の滅菌ベンチパッドをレイアウトし、鎮痛薬を準備します。
- 滅菌生理食塩水中のカルプロフェンを1 mg / mlに希釈し、滅菌生理食塩水中のブピバカインを0.5%(w / v)溶液に希釈します。.
- 3.5 mLのメロキシカムを400 mLのケージウォーターボトルに追加します。
- 回復ケージのヒートパッドを事前に温め、回復中の動物に間接光を当てるようにヒートランプを設置します。
- ヘアネット、フェイスマスク、ガウン、手袋など、適切なPPEがすべて着用されていることを確認してください。
- エタノール汚染を避けるために、手袋に定期的にエタノールをスプレーし、動物や手術器具を取り扱う前に手袋を蒸発させるなど、優れた滅菌技術を実践してください。
2.卵巣摘出術の実施
- イソフルランを含むガス麻酔器を使用して、4 L / minに設定された流量で5%イソフルランで3〜5分間誘導ボックスに事前充填します。
- マウスを誘導ボックス内に置き、意識を失ったらノーズコーンに移動し、イソフルラン気化器を~2.5%に設定して、流量を0.4 L/minに減らします。
注:手順の残りの部分に使用されるイソフルランの割合は、マウスの系統、年齢、および治療(化学療法など)への曝露に基づいて異なり、個々の動物の呼吸パターンの綿密な評価に基づいて調整する必要があります。.呼吸パターンは、通常の腹式呼吸のままにする必要があります。急速な胸部呼吸は、深い手術面に到達または維持されていないことを示している可能性があります。この場合、必要に応じてイソフルラン気化器の割合を調整します。 - チューブを絞って目を軽くたたくことで、目の潤滑剤をたっぷりと塗ります。
- 背骨の直感とその下の小さな領域(2 cm x 2 cm)を剃ります。
- 1 mg / mLの希釈溶液から5 mg / kgのカルプロフェンを首筋の皮下に投与します。.
- マウスの後ろのつま先をつまんで、つま先ピンチ反射で麻酔の深さをテストします。つま先のつまみ反応がない場合、動物は深い手術面にいて、手順は続行できます。
- 手術部位にベタジンを塗布し、外科用ドレープ(2 cm x 2 cmの窓を切り取ったガーゼ)で覆います。
- ラットの歯付き鉗子を使用して、背中の猫背の皮膚を上に引き上げ、~5 mmの縦方向の切開を行います。
注意: 動物の背中のこの高さでの皮膚切開は、動物がクリップを取り外してクリップの修理を必要とする可能性を減らすために、外科的クリップの配置に最適です。 - 鈍い鉗子を使用して、下にある筋肉層から離れて皮膚を鈍く解剖し、腎臓に向かって片側に移動します。
- 腎臓、卵巣、卵巣の脂肪パッドを筋肉壁を通して視覚的に識別します。
注:腎臓は濃い赤色に見え、脂肪パッドは明るい白に見え、目に見える場合、卵巣は脂肪パッド内の小さなピンクの点のように見えます。 - 鉗子を使用して、筋肉層をつかんで持ち上げます。鋭利な手術用ハサミで~0.5-1cmの切開を行います。鉗子で筋肉壁を保持し続け、はさみから鈍い鉗子に変更して、切開部を通して卵巣脂肪パッドを引っ張ります。
- 湾曲したニードルホルダーを使用して、子宮角の遠位端にある卵巣と卵管の下に固定します。
注:あるいは、卵巣だけを切除して、卵管を無傷のままにすることもできます。ただし、卵巣と卵管の区別を正確に視覚化するには、解剖顕微鏡が必要です。 - ハサミまたはメスで卵巣を取り除きます。過度の出血を避けるために、30秒間クランプし続けます。
- クランプを取り外し、必要に応じて滅菌ガーゼで軽くたたきます。
- 筋肉壁切開を閉じるには、鉗子を使用して切開の上部を持ち上げ、切開が自然に一緒に引っ張られるようにします。
- シルク縫合糸(サイズ3-0)を使用して、外科医の結び目で筋肉壁の切開を閉じます。
- 針を取り付けずに1 mLシリンジを使用して2〜3滴のブピバカインを局所的に塗布し、反対側で手順2.9〜2.17を繰り返します。
- 皮膚の切開を閉じるには、ガーゼを使用して余分なブピバカインを軽くたたき、皮膚の両側を一緒に押します。
- 1〜2個の7 mm外科用クリップを適用し、治癒プロセスの一部として腫れのためのスペースを確保します。
- マウスをリカバリケージに移動し、15分間注意深く監視します。
注:動物はすぐに目を覚ます必要があります。正常な胸部の呼吸パターンがないか、呼吸を注意深く監視してください。
3.ホルモン製剤:皮下注射
- エストラジオールの1 mg / mLストック溶液を作ります。
- 0.001 g(1 mg)のエストラジオール粉末を1.5 mL滅菌チューブに計量します。.
- 1 mLの100%エタノールをチューブに加え、数秒間ボルテックスします。
注:エタノールは、エストラジオール粉末の目に見える斑点で透明なままです。 - エタノールの蒸発を防ぐために、チューブをフィルムで包みます。
- チューブをアルミホイルで包み、ロッカーに一晩置いてエストラジオール粉末を完全に溶かします。
- この1 mg / mLストックをゴマ油で目的の最終濃度に希釈します。.
注:人工脱落膜化前のプライミングには3日間100 ngの用量が必要であり、プロゲステロンを投与する場合はさらに25 ngの低用量が必要です。これは、プロゲステロン受容体の発現を制御するフィードバックループに対抗するためである。胚移植の場合、4日目の胚移植の前に、1日目と3日目に100 ngの2回の投与が必要です。胚移植時には、25ngの低用量も必要とされる。 - 必要量のオイル中のエストラジオールを1 mLのシリンジに吸い込み、26 Gの針先を取り付けます。
- 適切な用量を必要な頻度で皮下注射します(首筋または脇腹のいずれかに、胚移植または人工脱落膜形成の前または胚移植時にプライミングの場合は100 ng / 100 μLまたは25 ng / 100 μL)。
注意: オイルは非常に粘性が高いため、針を外す前にゆっくりと注入し、数秒間一時停止してください。これにより、注入部位から漏れるオイルの量が最小限に抑えられます。
- プロゲステロンの200 mg / mLストック溶液を作ります。
- 0.4 g(400 mg)のプロゲステロン粉末を5 mL滅菌チューブに計量します。.
- 2 mLの100%エタノールをチューブに加え、数秒間ボルテックスします。
注:エタノールは白色になります。 - 手順3.1.3-3.1.4を繰り返します。
- ゴマ油で200 mg / mLストックを目的の最終濃度に希釈します。
注:胚移植をサポートするには、毎日2 mgの用量が必要です。 - 適切な用量(例:.、妊娠をサポートするために毎日2 mg / 100 μL)をステップ3.1.6-3.1.7のように皮下注射します。.
4.ホルモンの準備:徐放性ペレット
- 層流またはクラスIIバイオセーフティフードの表面にホイルを置きます。
- すべての機器(手袋、ペトリ皿、1 mLシリンジ、ファイン鉗子)をフードに入れ、UVを20分間オンにします。
注意: フード内のシーラントでUVをオンにしないでください。 - シラスティックチューブを100%エタノールで洗浄し、フード内で風乾させます。乾いたら、チューブに沿って~1cmの長さに印を付け、メスで切ります。
- シリンジからプランジャーを取り外し、~200 μLのシーラントを絞ります。プランジャーを交換し、シリンジから少量のシーラントを押し出します。
- チューブの一方の端に少量のシーラントを塗布し、手袋をはめた指で滑らかにします。
- フード内のUV光で一晩または20〜30分間乾燥させます。
- 滅菌したペトリ皿に適量のプロゲステロンを注ぎます。鉗子を使用して、ペレットをプロゲステロン粉末にすくい取り、ペレットを満たします。
- フード表面のペレットの密封された端を軽くたたいて、プロゲステロンを凝縮します。あるいは、滅菌した鉗子の端を使ってプロゲステロンを詰めます。より多くのシーラントのために十分なスペースを確保してください。
- 手順3.4〜3.5で説明されているように、開口部をシーラントでシールします。
- プロゲステロンペレットが入っているペトリ皿をホイルで包み、光から保護します。
- 1%木炭ストリッピングFCS(cs-FCS:PBS)中で37°Cでインキュベートすることにより、皮下挿入の前に最低72時間ペレットを活性化します。
注:ペレットは、事前に単一の密封された端でバルクで作ることができます。しかし、新鮮なプロゲステロンは毎回それらを満たすために使用されるべきです。プロゲステロンを充填する前に、既製のペレットがUV滅菌されていることを確認してください。ペレットは6〜10日間~500μg/日を分泌し、人工脱落膜化および胚移植手順を十分にサポートしますが、プロゲステロン受容体活性を4〜5日を超えて維持するには、追加の低用量エストロゲン注射が必要になる場合があります。10日を超えると、交換用プロゲステロンペレットが必要になる場合があります。
5.ホルモンの準備:浸透圧ミニポンプ
- 水溶液中で所望の濃度でプロゲステロンを調製し、適切なミニ浸透圧ポンプモデルを選択する( 材料表参照)。
注:セクション7(実験手順:胚移植)の場合、2 mg /日を12日間送達する必要があります。したがって、動物あたり28 mgのプロゲステロンを~100 μLの滅菌水に溶解します(特定の容量については、製造元の指示に従ってください)。段階希釈が必要な場合があります。セクション8(実験手順:人工脱落膜化)では、1日あたり500μgを3日間送達する必要があります。したがって、1,500 μgのプロゲステロンを動物あたり~100 μLの滅菌水に溶解します。充填手順中に失われた量を考慮して、追加の溶液を準備してください。 - クラスIIバイオセーフティフード内に機器(手袋、低糸くずのワイプ、ペトリ皿、滅菌生理食塩水、1 mLシリンジ、小型計量ボート、ホイル、および0.01 gの精度のはかり)をセットアップし、UVを20分間オンにします。
- ホルモン溶液を1 mLの注射器に吸い込み、気泡がないことを慎重に確認しながら滅菌充填チューブを取り付けます。
- 滅菌計量ボート内でポンプとその流量減速材の重量を量ります。
- ポンプ上部の開口部から充填チューブを、それ以上進まなくなるまで挿入します。
- ポンプを直立させたまま、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してチューブを満たします。
注意: ポンプに気泡を導入する可能性があるため、急速な充填は避けてください。 - 溶液がポンプの上部から溢れたら、充填チューブをそっと取り外し、滅菌済みの低糸くずワイプで余分な溶液を拭き取ります。
- ポンプ上部の開口部からフローモデレーターを挿入し、それ以上進めなくなります。完全に入ったら、ポンプとフローモデレーターを一緒にしっかりと押します。
- フローモデレーターを所定の位置に置いた状態で、充填されたポンプの重量を量ります。
注:ステップ5.3とステップ5.8から得られた重量の差は、ロードされた溶液の正味重量を示します(つまり、0.1 gの増加= 100 μLの溶液が追加されます)。 - 充填したポンプを滅菌生理食塩水で満たされた滅菌ペトリ皿に入れます。
- すべてのポンプが満たされたら、ペトリ皿をホイルで包み、37°Cのインキュベーターに入れて、少なくとも4〜6時間(または使用する準備ができるまで)プライミングします。
6.外科的処置:皮下ホルモンペレットとミニポンプの挿入
- セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
- 手順2.1〜2.3に従って動物に麻酔をかけます。
- 首筋の小さな領域(~1 cm x 1 cm)を剃ります。
- 1 mg / mLの希釈溶液から5 mg / kgのカルプロフェンを脚の側面の皮下に投与します。.
- つま先ピンチ反射をテストします。反射がない場合、動物は深い手術面にあり、手順を開始できます。
- 手術部位にベタジンを塗布し、外科用ドレープ(2 cm x 2 cmの窓が切り取られたガーゼ)で覆います。
- ラット歯の鉗子を使用して、首の首筋(真の首筋と背中の猫の中間)の皮膚を上に引き上げ、~5 mmの縦方向の切開を行います。
- 鈍い鉗子を使用して、下にある筋肉層から下方向に皮膚を鈍く解剖します。
注意: 浸透圧ミニポンプを挿入するには、ポンプが動物の動きを制限したり、切開部位を押し上げたりしないように、動物の片側に沿ってポケットを作成します。 - ホルモンペレットまたはミニポンプ用に十分なスペースができたら、滅菌鉗子を使用してペレットまたはミニポンプをピックアップし、鈍的解剖で作られた皮下ポケットに挿入します。
- 皮膚の切開を閉じるには、ペレットまたはミニポンプがポケットに十分入って、外科用クリップで損傷しないことを確認します。
- ステップ2.17に従ってブピバカインを局所的に塗布します。
- 1つの手術用クリップで傷を閉じます。マウスをリカバリケージに移動し、15分間注意深く監視します。これは短い手順であるため、動物は数分以内に歩行可能になるはずです。
7.実験手順:胚移植
- 卵巣摘出動物の場合、100 ng / 100 μLエストラジオールの皮下注射による胚移植の3日前にホルモンプライム(ステップ3.1)。
- 胚移植の1日前に、酢酸メドロキシプロゲステロン2 mg / 100 μLの皮下注射で動物にホルモンプライミングを行います(ステップ3.2)。
- セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
- 手順2.1〜2.3に従って動物に麻酔をかけます。
- 手順2.4〜2.10に従って手順を開始します。
- 解剖顕微鏡下で、26 Gの針先で子宮内注射ポイントを作成します。
- 5つの胚盤胞をM2培地滴にピペットで移し、これらを子宮角に移します。
- 筋肉壁切開を閉じるには、鉗子を使用して切開の上部を持ち上げて、切開が自然に引っ張られるようにします。
- 絹縫合糸を使用して、外科医の結び目で筋肉壁部位を閉じます。ブピバカインを局所的に滴下する。
- 反対側で手順7.5〜7.8を繰り返します。
- 皮膚の切開を閉じるには、ガーゼを使用して余分なブピバカインを軽くたたき、皮膚の両側を一緒に押します。
- 1〜2個の外科用クリップを適用し、治癒プロセスの一部として腫れのためのスペースを確保します。
注:動物が卵巣摘出されている場合、胚移植時に外因性ホルモンが必要です。プロゲステロン(2 mg)を皮下注射するか、皮下プロゲステロンペレットまたは浸透圧ミニポンプを挿入します。過剰なプロゲステロンと戦うためには、胚移植時に低用量(25 ng / 100 μL)のエストロゲンの皮下注射が必要です。 - マウスを回復ケージに慎重に運び、15分間注意深く監視します。
注:動物はすぐに目を覚ます必要があります。正常な胸部の呼吸パターンがないか、呼吸を注意深く監視してください。
8.実験手順:人工脱落膜化
- 人工脱子虫化の8日前のセクション3(ホルモン製剤:皮下注射)に従って、1日目、2日目、および3日目に100 ng / 100 μLのエストラジオールで動物をホルモンプライミングします。
- 人工脱子虫化の2日前のセクション3(ホルモン製剤:皮下注射)に従って、7日目、8日目、および9日目に5 ng / 100 μLエストラジオールで動物をホルモンプライミングします。
注意: 最終注射は、人工脱落膜化手順の最低3時間(および最大4時間)前に行う必要があります。 - 人工脱子膜形成の2日前のセクション4、セクション5、およびセクション8に従って、皮下プロゲステロンペレットまたはミニ浸透圧ポンプ(500 μg /日)を備えたホルモンプライム動物。
- セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
- 手順2.1〜2.2に従って動物に麻酔をかけます。
- つま先ピンチ反射で麻酔の深さをテストします。つま先のつまみ反応がない場合、動物は深い手術面にいて、手順は続行できます。
- マウスを腹臥位に置き、尾を持ち上げて、直径6 mmの検鏡をゆっくりと膣に挿入します。
- 動物の鼻を麻酔薬の鼻錐形に保ちながら、利き手でない手の第1指と第2指の間に動物の下半身を置きます。親指を使って尾をそっと上に押し上げ、膣口が見えるようにします。
- 非外科的胚移植チップ(20μLピペットに取り付けられている)を使用して、20μLのゴマ油を1つの子宮角に移します。
- ピペットを膣口と同じ高さに保ちながら、先端を膣に挿入し、子宮頸部を通して子宮角に挿入します。先端が子宮角に入ったら、先端を子宮内膜表面にそっと押し付け(上記の取り扱い技術を使用している場合、この動きは2本目の指に対して感じられます)、ゆっくりとオイルを排出します。
注意: ピペットプランジャーを押したまま、10秒間待ってすべてのオイルが分散したことを確認し、プランジャーを押したままトランスファーチップをゆっくりと取り外します。
- ピペットを膣口と同じ高さに保ちながら、先端を膣に挿入し、子宮頸部を通して子宮角に挿入します。先端が子宮角に入ったら、先端を子宮内膜表面にそっと押し付け(上記の取り扱い技術を使用している場合、この動きは2本目の指に対して感じられます)、ゆっくりとオイルを排出します。
- 膣から検鏡を取り除きます。
- マウスを回復ケージに慎重に運び、15分間注意深く監視します。
注:動物はすぐに目を覚ますはずです。正常な胸部の呼吸パターンがないか、呼吸を注意深く監視します。 - 動物の取り扱いを制限し、処置後96時間は静かな環境に保管してください。
注意: 大きな音や明暗のサイクルの急激な変化は、手順の成功に影響を与えます。組織解剖時に、脱落膜形成の成功の程度は、体重に対する子宮重量の比として測定することができる。人工脱落膜化手順の成功率は80%です。したがって、脱落膜化に失敗した動物を除外し、実験のサンプルサイズを選択するときにこれを考慮に入れます。
9.外科的処置:術後の回復、モニタリング、およびクリップの修復
- 動物を自宅のケージに戻す前に、一晩中ハーフオン、ハーフオフのヒートパッドを回復させます。
- 手術後5日間毎日動物を監視し、感染の兆候がないか創傷部位に細心の注意を払います。
- 必要に応じてクリップの修復を実行します。
- セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
- 手順2.1〜2.3に従って動物に麻酔をかけます。
- クリップがまだ存在する場合は、クリップリムーバーを使用して既存のクリップを削除します。
- 手順2.19-2.21に従って、新しい外科用クリップを適用します。
- 手順7-9.3.1-9.3.3に従って、または動物が次に麻酔下にあるとき(胚移植、人工脱落膜形成手順、手術後の皮下注射など)に手術クリップを取り外します。
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Representative Results
人工脱落膜化の十分に特徴付けられたモデルは、このプロトコルペーパーに記載されています(図1A)。ここで、若年成体雌マウス(8週齢)は、セクション1およびセクション2に記載されるように外科的卵巣摘出術を受けた。その後、マウスを2週間休ませて、内因性卵巣ホルモンが消散してから、セクション3〜7およびセクション9に記載されているように外因性ホルモンでサポートされることを確認しました。ゴマ油の膣内注射によって人工的な脱落膜化を誘発し、次いで、セクション9に記載されるように、動物を組織採取まで休ませた。本研究では、一般的に使用されているマウス系統であるC57BL6/Jマウスで人工脱落膜化を行いました。組織採取時に体重を記録し、子宮を解剖し、十分にトリミングしてから体重を測定した(図1B)。脱落反応の程度は、子宮重量を体重の比として表すことによって記録した。この研究では、C57BL6/Jマウスの80%が脱落膜化し(0.01012 ± 0.001515、n = 15)、動物の子宮の20%は脱落膜化しなかった(0.002108 ± 0.0001764、n = 3)(図1C)。
図1:概略図と代表的な結果 。 (A)マウスモデルにおいて人工脱落膜化を実験的に誘導するための概略タイムライン。略語:OVX =卵巣摘出術;E2 =エストラジオール(100ng日1〜3、5ng日7〜9);P4 =プロゲステロン。注:P4ペレットを使用して、ここに示す結果を生成しました。プロゲステロン送達のための代替方法には、毎日の皮下注射およびミニ浸透圧ポンプが含まれる。(B)若年成体C57BL6/Jマウスの非脱落膜化(ND)および脱落膜化(D)子宮の代表的な画像。スケールバー= 5 mm(C)非脱落動物と脱落膜動物における子宮重量対体重(UW:BW)比の比較。データはSEM±平均です。マンホイットニー検定、**p = 0.003;ND:n = 3、D:n = 15。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ホルモン送達方法 | 強み | 弱点 |
| 皮下注射 | 外科的介入は必要ありません | 毎日の繰り返しの取り扱い |
| 外科的トレーニングを必要としないアクセス可能な技術(ペレット注入と比較して) | 油中のホルモンは注射部位から漏れる可能性があるため、各動物が吸収する量はさまざまです | |
| 徐放性ペレット | 日常の取り扱いが不要 | 外科的処置が必要 |
| 社内で作ることができます | 市販されていない | |
| 浸透圧ミニポンプの手頃な価格の代替品 | ||
| 小さくて動物に非常によく耐えられる | ||
| 浸透圧ミニポンプ | 日常の取り扱いが不要 | 外科的処置が必要 |
| 市販 | 高い | |
| 最も正確な配送方法 | 徐放性ペレットよりもはるかに大きい |
表1:ホルモン送達方法の長所と短所。
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Discussion
この記事では、妊娠と出産への子宮の寄与を理解することに焦点を当てた研究のために、OVXを実行し、外因性ホルモンを提供する方法について段階的に説明します。これらの方法の2つの実験的応用について、胚移植の実施および人工的な脱落膜化の誘導を含む2つの詳細なプロトコルが提供されている。
OVXの実行は、特にげっ歯類モデルに不慣れな研究者にとって、最初は困難な場合がありますが、適切にトレーニングおよび実践すれば、比較的簡単な手順です。手順の重要なステップには、麻酔下にある動物を注意深く監視し、卵巣組織が残っていないことを確認することが含まれます。一部のモデルでは、卵管が無傷のままになることがあります。しかしながら、卵管は豊富なエストロゲンおよびプロゲステロン受容体を有するホルモン応答性組織であることに留意すべきである19。卵巣と卵管を切除するための外科的プロトコルは、前者が肉眼で完了できるため、卵巣だけを切除する場合に比べてはるかに簡単です。後者の場合、卵巣だけを取り除き、卵管を所定の位置に残すには、これははるかに複雑な手順であるため、解剖顕微鏡が必要です。その結果、内壁の縫合など、手順のさまざまな部分について、動物を解剖顕微鏡ステージと手術野の間を移動する必要があるため、手術時間を延長することができます。
ここで詳述されている鎮痛プロトコルは標準であり、モナッシュ大学動物倫理委員会によって承認されているため、個々の機関の倫理委員会の要件または好みによって異なる場合があります。典型的な非ステロイド性抗炎症薬が脱落膜形成プロセスを妨害するので、人工脱落膜化手順には鎮痛は提供されなかったことに留意すべきである。研究者が人工脱落膜化時に鎮痛薬を提供したい場合は、これを考慮に入れる必要があります。
本研究では、OVXに続く卵巣ホルモンを補うための3種類のホルモン送達法を提示し、それぞれの方法には独自の長所と短所がある(表1)。油中のホルモンの皮下注射は、文献14、16、17において一般的である。この技術は、外科的処置が必要とされないという事実を含む多くの長所を有し、したがって、げっ歯類手術またはガス麻酔の正式な訓練は必要とされない。これにより、皮下注射はほとんどすべての研究グループにとってアクセス可能なオプションになります。注射も手頃な価格で簡単に実行できます。しかし、実際には、特に妊娠のモデルでは、いくつかの制限があります。OVX動物の妊娠を維持するためには、妊娠をサポートするためにプロゲステロンによるホルモン補給を毎日行わなければなりません。胎盤がプロゲステロンの主な供給源として引き継ぐのに十分に発達したら、毎日の注射を中止することは可能かもしれませんが、これはここに提示されたプロトコルでは試行されていません。逸話的に、皮下注射後に油中のホルモンが注射部位から漏れる可能性があります。部分的には、これはゴマ油のような粘性のあるものを簡単に分配するために必要な針のサイズ(26 G)が原因である可能性があります。したがって、これを実験結果と相関させるために、油に注入するときにこの漏れを監視および記録する必要があります。
徐放性ペレットは、費用対効果が高く、社内で簡単に製造できるため、皮下注射よりも好ましいです。ただし、複数の夜間ステップが必要であり、実験のタイムラインを計画するときに考慮する必要があります。これらのペレットは毎日約500 μgを分泌します(細胞培養培地でのタイムコースインキュベーションおよびその後のプロゲステロンELISA中に評価されます)。これは上記の毎日の皮下注射と比較してより低い濃度であり、そしてこれはペレットからのプロゲステロンの送達における一貫性によるものであることに留意すべきである。前述のように、オイル注入は注入部位から漏れる可能性があるため、供給される全体的な濃度が低下します。以前の研究では、これらのペレットは、外科的に挿入されてから最大10日間しかin vivoで活性ではありませんでした。したがって、妊娠研究では、妊娠中期に2番目のペレットを挿入する必要があるかどうか、または胎盤がその段階までに妊娠に対して内分泌サポートを十分に提供できるかどうかは不明です。したがって、これらのペレットは、ここに示されている人工脱落膜化プロトコル、および胚移植後10日までの妊娠研究を含む妊娠の短期モデルに最適です。徐放性ペレットは毎日の動物の取り扱いと注射の必要性を否定しますが、プロゲステロン受容体フィードバックループのバランスをとるために、いくつかの低用量エストロゲン注射が依然として必要です。この戦略は以前に使用されていました20,21。
最後に、浸透圧ミニポンプは最も正確なホルモン送達方法であり、市販されていますが、最も高価なオプションです。浸透圧ミニポンプは、選択したモデルに応じて、最大28日間、毎日設定された濃度のホルモンを供給できます。徐放性ペレットと同様に、浸透圧ミニポンプは毎日の動物の取り扱いの必要性を回避しますが、いくつかの低用量エストロゲン注射が依然として必要です。
ここに記載されている人工的な脱落膜化プロトコルは、卵巣および胚の影響とは無関係に妊娠初期のマイルストーンの研究を可能にします。人間は月経周期ごとに脱落膜化を受けますが、げっ歯類は妊娠中にのみ脱落膜化します。したがって、このモデルは、操作可能なげっ歯類モデルで人間のような妊娠のマイルストーンを研究するための計り知れない価値があります。ここで詳述する手順は、非外科的胚移植装置(NSET)を使用して、膣および子宮頸部 を介して ゴマ油を子宮角に直接送達するため、比較的非侵襲的である。この手順は他の方法論よりも侵襲性は低いですが、商用NSETを使用すると非常に高価になる可能性があります。比較すると、人工脱落膜化の他の公表されたモデルは、油の子宮内注射を行うための外科的処置を必要とする17。これには、セクション1および手順2.1〜2.11で説明されているのと同様の外科的セットアップが必要です。ただし、以前に卵巣摘出された動物では、子宮角を特定して露出させることがより困難な場合があります。卵巣摘出術のための以前の外科的処置から形成された癒着もあり得る。したがって、脱落膜形成を誘導するために外科的子宮内注射を行う方が費用効果が高いかもしれませんが、外科的および麻酔時間はNSETを使用する代替手段よりも大幅に長くなります。市販のNSETに対する社内で製造された代替品22 の確立されたプロトコルがあり、はるかに費用効果が高いです。
胚移植手順が本明細書に記載されているが、我々は以前にこのモデルおよびマウスの異なる系統にわたるその成功率を公表している14。さらに、ここで説明する胚移植法は外科的アプローチを使用しますが、NSETをこの手順に統合することもできます。
この分野における将来の方向性には、妊娠の確立と維持への特定の子宮の貢献に焦点を当てた研究が含まれるべきです。この知識は、特発性不妊症、着床失敗、妊娠合併症の理解を深めるために重要です。これらの分野での知識を広げることは、IVF/ICSI患者の臨床転帰を改善し、生物学的プロセスとしての妊娠を理解するための基本でもあります。
結論として、OVXは、妊娠と出産への子宮の寄与を研究するために動物モデルに統合することができる簡単な手順です。将来のモデルは、OVXと外因性ホルモン送達を統合することで恩恵を受け、生殖能力と妊娠に対する卵巣特異的寄与と子宮特異的寄与を比較できるようになります。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的またはその他の利益を宣言しません。
Acknowledgments
この作業は、ビクトリア州政府の運用インフラストラクチャサポートとオーストラリア政府国家保健医療研究評議会(NHMRC)IRIISSを通じて可能になりました。この作業は、モナッシュ大学医学部、看護、健康科学プラットフォームへのアクセス助成金によってサポートされました A.L.W.(Winship-PAG18-0343)モナッシュ生殖サービスプラットフォームにアクセスするため。A.L.W.は、オーストラリア研究評議会(ARC)からのDECRA資金DE21010037によってサポートされています。JNHとLRAは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金によってサポートされています。LRAは、モナッシュ大学院優秀奨学金によってサポートされています。KJHは、ARCフューチャーフェローシップFT190100265によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientific | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientific | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientific | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientific | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientific | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose) |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
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