Summary
Установление беременности - это динамический процесс, включающий сложные перекрестные помехи эмбриона и матки. Точный вклад материнской маточной среды в эти процессы остается активной областью исследований. Здесь представлены подробные протоколы, помогающие в разработке моделей животных in vivo для решения этих исследовательских вопросов.
Abstract
Чтобы беременность была установлена, жизнеспособная бластоциста должна успешно взаимодействовать с рецептивной слизистой оболочкой матки (эндометрием), чтобы облегчить имплантацию и формирование плаценты и обеспечить продолжение беременности. Ограничения на успешность беременности, вызванные эмбриональными дефектами, хорошо известны и были в значительной степени преодолены в последние десятилетия с появлением экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и вспомогательных репродуктивных технологий. Однако до сих пор эта область не преодолела ограничения, вызванные недостаточно рецептивным эндометрием, что приводит к стагнации показателей успешности ЭКО. Функции яичников и эндометрия тесно переплетены, так как гормоны, вырабатываемые яичником, отвечают за менструальную цикличность эндометрия. Таким образом, при использовании моделей беременности на грызунах может быть трудно определить, связан ли наблюдаемый результат с дефицитом яичников или матки. Чтобы преодолеть это, была разработана овариэктомия мышиной модели с переносом эмбрионов или искусственной децидуализацией, чтобы можно было изучить специфический для матки вклад в беременность. В этой статье будут представлены инструкции о том, как выполнить овариэктомию, и предложены различные методы поставки экзогенных гормонов для поддержки успешной искусственной децидуализации или беременности после переноса эмбрионов от здоровых доноров. Эти методы включают подкожные инъекции, гранулы с медленным высвобождением и осмотические мини-насосы. Будут обсуждаться основные преимущества и недостатки каждого метода, что позволит исследователям выбрать наилучший дизайн исследования для своего конкретного исследовательского вопроса.
Introduction
С ростом использования вспомогательных репродуктивных технологий в последние десятилетия многие барьеры на пути к зачатию были преодолены, что позволило многим парам создавать семьи, несмотря на проблемы с фертильностью1. Дефицит ооцитов или сперматозоидов часто можно обойти с помощью экстракорпорального оплодотворения или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида; Однако проблемы, связанные с маткой и восприимчивостью эндометрия, остаются неуловимым «черным ящиком» репродуктивного потенциала2.
Беременность устанавливается, когда качественный эмбрион успешно взаимодействует с рецептивным эндометрием (слизистой оболочкой матки). Шансы на успешную беременность в любом менструальном цикле невелики и составляют около 30%3,4. Из тех, которые успешны, только 50-60% продвигаются после 20 недель беременности, при этом неудача имплантации является причиной 75% беременностей, которые не достигают 20 недель3. Несмотря на то, что эти цифры относятся к концу 1990-х годов, этой области еще предстоит преодолеть ограничения, вызванные недостаточно рецептивным эндометрием. Это привело к стагнации, а иногда и к снижению показателей успешности ЭКО в последние годы 5,6.
Женщины с необъяснимым бесплодием часто имеют смещенное окно восприимчивости или не могут достичь восприимчивости по неизвестным причинам. Недавно был разработан массив рецептивности эндометрия, который оценивает экспрессию сотен генов с целью адаптации времени переноса эмбрионов к окну восприимчивости человека 7,8,9. Тем не менее, в этой области до сих пор отсутствует понимание патогенеза осложнений беременности, которые проявляются после завершения процесса имплантации.
Женская репродуктивная система очень динамична и находится под жестким гормональным контролем. Гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось (HPG) контролирует высвобождение лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона, которые регулируют аспекты овариального цикла, включая созревание фолликулов и активность эстрогена и прогестерона. В свою очередь, менструальный цикл матки регулируется эстрогенами и прогестероном10,11. Таким образом, изучение биологических механизмов матки осложняется влиянием яичников. Например, при изучении того, как терапия рака может повлиять на матку, может быть трудно различить, является ли какой-либо наблюдаемый фенотип матки (например, потеря беременности или менструальная ацикличность) результатом прямого оскорбления матки или косвенного эффекта от повреждения яичников.
Чтобы всесторонне понять фертильность, необходимо охарактеризовать вклад матки в беременность. Важно отметить, что это понимание должно выходить за рамки функции матки под контролем яичников. Это не может быть изучено на людях; Поэтому часто используются модели животных. Таким образом, овариэктомия (OVX) обычно используется для того, чтобы позволить исследователям регулировать эстральные циклы грызунов (аналогично менструальному циклу) путем экзогенного снабжения гормонами. Кроме того, OVX позволяет изучать реакцию матки независимо от влияния яичников12. Однако, если гормоны не будут немедленно доставлены после OVX, возникнет фенотип менопаузы, который должен быть тщательно рассмотрен исследователями.
OVX часто используется в моделях грызунов 13,14,15,16,17 и относительно легко выполняется после адекватного обучения. Методы варьируются в зависимости от того, удаляется ли только яичник или яичник и яйцевод, а также в зависимости от возраста животного (взрослые животные имеют более крупные яичники с видимым желтым телом на поверхности, что означает, что их яичники легче визуализировать). Точно так же существует множество методов гормональных добавок, включая подкожные инъекции14, гранулы с медленным высвобождением 15, осмотической мини-помпы18 и пересадку яичников.
В этой статье приведены подробные инструкции о том, как выполнять овариэктомию и готовить три типа гормональных добавок, включая подкожные инъекции, гранулы с медленным высвобождением и осмотические мини-помпы. Два подробных протокола предоставляются для экспериментальных конечных точек, которые выигрывают от OVX с последующим добавлением экзогенных гормонов (перенос эмбрионов и искусственная децидуализация). В этой статье обсуждаются сильные и слабые стороны каждого подхода с целью руководства исследователями относительно того, как проводить исследования, чтобы изолировать воздействие на матку, особенно в областях исследований беременности и фертильности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были размещены в помещениях с контролируемой температурой и высокими барьерами (Лаборатория исследований животных Университета Монаша) с бесплатным доступом к пище и воде и 12-часовым циклом света-темноты. Все процедуры были выполнены в соответствии с одобрением Комитета по этике платформы исследований животных Монаша (#21908, 17971) и выполнены в соответствии с Кодексом практики Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям по уходу за животными и их использованию.
1. Хирургическая подготовка
- Автоклавируйте все хирургические инструменты, марлю и бумажные полотенца, необходимые для проведения процедур, в цикле твердых/сухих грузов при температуре 121 °C со временем выдержки 30 минут и временем сушки 30 минут.
- Разложите стерильную настольную подушечку для хирургического рабочего пространства и приготовьте анальгетики.
- Разбавьте карпрофен в стерильном физиологическом растворе до 1 мг/мл и разбавьте бупивакаин в стерильном физиологическом растворе до 0,5% (мас./об.) раствора.
- Добавьте 3,5 мл мелоксикама в бутылку с водой в клетке объемом 400 мл.
- Предварительно разогрейте грелку (подушки) для клеток для восстановления и установите нагревательные лампы, чтобы направлять непрямой свет на выздоравливающих животных.
- Убедитесь, что вы носите все необходимые средства индивидуальной защиты, включая сетку для волос, маску для лица, халат и перчатки.
- Практикуйте хорошую стерильную технику, в том числе регулярно опрыскивайте перчатки этанолом и позволяйте им испаряться перед обращением с животным или хирургическими инструментами, чтобы избежать загрязнения этанолом.
2. Выполнение овариэктомии
- Используя газоанестезиологический аппарат изофлураном, предварительно заполните индукционную коробку в течение 3-5 минут 5% изофлураном со скоростью потока, установленной на уровне 4 л/мин.
- Поместите мышь в индукционную коробку и, когда она потеряет сознание, переместите ее в носовой конус и уменьшите скорость потока до 0,4 л / мин, установив испаритель изофлурана на ~ 2,5%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент изофлурана, используемого для оставшейся части процедуры, варьируется в зависимости от штамма мыши, возраста и воздействия лечения (например, химиотерапии) и должен быть скорректирован на основе тщательной оценки характера дыхания каждого отдельного животного. Паттерны дыхания должны оставаться такими же, как обычные дыхания живота. Быстрые грудные вдохи могут указывать на то, что глубокая хирургическая плоскость не была достигнута или поддерживалась; В этом случае отрегулируйте процент испарителя изофлурана по мере необходимости. - Обильно нанесите смазку для глаз, сжав тюбик и аккуратно промокнув глаз.
- Побрейте небольшую область (2 см х 2 см) на уровне и ниже горбинки позвоночника.
- Вводят 5 мг / кг карпрофена из разбавленного раствора 1 мг / мл подкожно на загривке.
- Проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса защемления пальца ноги, ущипнув задний палец мыши. Если нет реакции защемления пальцев ног, животное находится в глубокой хирургической плоскости, и процедура может продолжаться.
- Нанесите бетадин на операционную область и накройте хирургической простыней (марля с вырезанным окошком размером 2 см х 2 см).
- С помощью крысиных щипцов потяните кожу на горбинке спины вверх и сделайте продольный разрез ~5 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез кожи на этой высоте на спине животного лучше всего подходит для установки хирургических зажимов, чтобы уменьшить вероятность того, что животное удалит зажимы и потребует ремонта зажима. - Используя тупые щипцы, приступайте к тупому рассечению кожи от нижележащего мышечного слоя, двигаясь вниз и в одну сторону к почкам.
- Определите почку, яичник и жировой подушку яичников визуально через мышечную стенку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Почка будет иметь темно-красный цвет, жировая подушка будет ярко-белой, и если ее увидеть, яичник будет выглядеть как маленькая розовая точка внутри жировой подушечки. - С помощью щипцов захватите и поднимите мышечный слой. Сделайте разрез ~0,5-1 см острыми хирургическими ножницами. Продолжайте удерживать мышечную стенку щипцами и переходите от ножниц к тупым щипцам, чтобы протянуть жировую подушечку яичника через разрез.
- Используя изогнутый иглодержатель, зажмите под яичник и яйцевод на дистальном конце рога матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно удалить только яичник, оставив яйцевод нетронутым. Однако для точной визуализации различия между яичником и яйцеводом требуется рассекающий микроскоп. - Удаляют яичник ножницами или скальпелем. Продолжайте зажимать в течение 30 с, чтобы избежать чрезмерного кровотечения.
- Снимите зажим и при необходимости промокните его стерильной марлей.
- Чтобы закрыть разрез мышечной стенки, используйте щипцы, чтобы поднять верхнюю часть разреза, чтобы разрез естественным образом стянулся.
- Используйте шелковые швы (размер 3-0), чтобы закрыть разрез мышечной стенки узлом хирурга.
- Нанесите две-три капли бупивакаина местно с помощью шприца объемом 1 мл без прикрепленной иглы и повторите шаги 2.9-2.17 с другой стороны.
- Чтобы закрыть разрез кожи, используйте марлю, чтобы намочить область насухо от избытка бупивакаина, и прижмите две стороны кожи друг к другу.
- Установите один-два хирургических зажима диаметром 7 мм, оставляя пространство для отека в рамках процесса заживления.
- Переместите мышь в клетку для восстановления и внимательно следите за ней в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны быстро просыпаться; Обязательно внимательно следите за дыханием, чтобы убедиться в нормальном дыхании грудной клетки.
3. Гормональная подготовка: Подкожная инъекция
- Сделайте 1 мг / мл исходного раствора эстрадиола.
- Взвесьте 0,001 г (1 мг) порошка эстрадиола в стерильную пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 1 мл 100% этанола в пробирку и встряхните в течение нескольких секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол останется прозрачным с видимыми пятнами порошка эстрадиола. - Оберните трубку пленкой, чтобы предотвратить испарение этанола.
- Заверните тюбик в алюминиевую фольгу и поместите его на коромысло на ночь, чтобы полностью растворить порошок эстрадиола.
- Разбавьте этот бульон 1 мг / мл в кунжутном масле до желаемой конечной концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дозы 100 нг в течение 3 дней необходимы для праймирования перед искусственной децидуализацией, а дополнительные низкие дозы 25 нг требуются при введении прогестерона. Это необходимо для борьбы с петлей обратной связи, контролирующей экспрессию рецепторов прогестерона. Для переноса эмбрионов требуются две дозы по 100 нг в 1-й день и 3-й день до переноса эмбрионов на 4-й день. Во время переноса эмбрионов также требуется низкая доза 25 нг. - Наберите необходимое количество эстрадиола в масле в шприц объемом 1 мл, а затем приложите кончик иглы 26 г.
- Вводите соответствующую дозу подкожно (либо в загривок, либо в бок; 100 нг/100 мкл или 25 нг/100 мкл для прайминга перед переносом эмбрионов или искусственной децидуализацией или во время переноса эмбрионов) с требуемой частотой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Масло очень вязкое, поэтому обязательно вводите медленно и сделайте паузу на несколько секунд, прежде чем вынимать иглу. Это позволит свести к минимуму количество масла, которое вытекает из места впрыска.
- Сделайте 200 мг / мл исходного раствора прогестерона.
- Взвесьте 0,4 г (400 мг) порошка прогестерона в стерильную пробирку объемом 5 мл.
- Добавьте 2 мл 100% этанола в пробирку и встряхните в течение нескольких секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол станет белого цвета. - Повторите шаги 3.1.3-3.1.4.
- Разбавьте бульон 200 мг / мл в кунжутном масле до желаемой конечной концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дозы 2 мг в день необходимы для поддержки переноса эмбрионов. - Вводите соответствующую дозу (например, 2 мг/100 мкл в день для поддержки беременности) подкожно, как показано на этапах 3.1.6-3.1.7.
4. Гормональная подготовка: гранулы с медленным высвобождением
- Уложите фольгу по поверхности ламинарного потока или капюшона биобезопасности II класса.
- Поместите все оборудование (перчатки, чашки Петри, шприцы объемом 1 мл, тонкие щипцы) в капюшон и включите ультрафиолетовое излучение на 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не включайте УФ-излучение с герметиком внутри вытяжки, так как он застынет. - Вымойте силастическую трубку в 100% этаноле и дайте ей высохнуть на воздухе в вытяжке. После высыхания отметьте длину ~ 1 см вдоль трубки и разрежьте скальпелем.
- Снимите поршень со шприца и выдавите ~ 200 мкл герметика. Замените поршень и выдавите небольшое количество герметика из шприца.
- Нанесите небольшое количество герметика на один конец трубки и разгладьте его пальцем в перчатке.
- Дайте высохнуть в течение ночи или в течение 20-30 минут в ультрафиолетовом свете внутри вытяжки.
- Налейте необходимое количество прогестерона в стерилизованную чашку Петри. Используя щипцы, зачерпните гранулы в порошок прогестерона, чтобы заполнить гранулы.
- Постучите запечатанным концом гранулы по поверхности вытяжки, чтобы сконденсировать прогестерон. В качестве альтернативы используйте конец стерилизованных щипцов, чтобы набить прогестерон. Оставьте достаточно места для большего количества герметика.
- Запечатайте открытый конец герметиком, как описано в шагах 3.4-3.5.
- Заверните чашку Петри, содержащую гранулы прогестерона, в фольгу, чтобы защитить ее от света.
- Активируйте гранулы в течение как минимум 72 часов перед подкожным введением путем инкубации в 1% очищенном древесным углем FCS (cs-FCS: PBS) при 37 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты могут быть изготовлены навалом с одним запечатанным концом заранее. Тем не менее, свежий прогестерон следует использовать для их восполнения каждый раз. Убедитесь, что готовые гранулы стерилизованы ультрафиолетовым излучением перед заполнением прогестероном. Гранулы будут выделять ~ 500 мкг / день в течение 6-10 дней, что является достаточной поддержкой для процедур искусственной децидуализации и переноса эмбрионов, хотя для поддержания активности рецептора прогестерона в течение 4-5 дней может потребоваться дополнительная инъекция низких доз эстрогена. По истечении 10 дней может потребоваться замена гранул прогестерона.
5. Гормональная подготовка: осмотические мини-насосы
- Приготовьте прогестерон в нужной концентрации в водном растворе и выберите подходящую модель мини-осмотического насоса (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для раздела 7 (экспериментальная процедура: перенос эмбрионов) требуется доставка 2 мг / день в течение 12 дней. Поэтому растворите 28 мг прогестерона в ~ 100 мкл стерильной воды на животное (следуйте инструкциям производителя для конкретного объема). Могут потребоваться последовательные разведения. Для секции 8 (экспериментальная процедура: искусственная децидуализация) требуется доставка 500 мкг в сутки в течение 3 дней. Поэтому растворяют 1,500 мкг прогестерона в ~ 100 мкл стерильной воды на животное. Приготовьте дополнительный раствор, чтобы учесть объем, потерянный во время процедуры наполнения. - Установите оборудование (перчатки, салфетки с низким содержанием ворса, чашки Петри, стерильный физиологический раствор, шприцы объемом 1 мл, небольшие весы, фольгу и весы с точностью до 0,01 г) в капюшоне биобезопасности класса II, а затем включите ультрафиолетовое излучение на 20 минут.
- Наберите раствор гормона в шприц объемом 1 мл, а затем прикрепите стерильную заливочную трубку, тщательно следя за тем, чтобы в ней не было пузырьков воздуха.
- Взвесьте насос и его замедлитель потока в стерильной весовой лодке.
- Вставьте заправочную трубку через отверстие в верхней части насоса до тех пор, пока она не перестанет идти дальше.
- Удерживая насос в вертикальном положении, медленно нажмите на поршень шприца, чтобы заполнить трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать быстрого наполнения, так как это может привести к попаданию пузырьков воздуха в насос. - Когда раствор выльется из верхней части насоса, осторожно снимите заливную трубку и вытрите излишки раствора стерильной салфеткой с низким ворсом.
- Вставьте замедлитель потока через отверстие в верхней части насоса до тех пор, пока он не сможет двигаться дальше. После того, как он полностью войдет в систему, плотно прижмите насос и замедлитель потока друг к другу.
- Взвесьте заполненный насос с установленным замедлителем потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в весе, полученная на шагах 5.3 и 5.8, даст вес нетто загруженного раствора (т.е. увеличение на 0,1 г = 100 мкл добавленного раствора). - Поместите заполненный насос в стерильную чашку Петри, наполненную стерильным физиологическим раствором.
- После того, как все насосы заполнены, заверните чашку Петри в фольгу и поместите ее в инкубатор с температурой 37 ° C для заправки не менее чем на 4-6 часов (или до готовности к использованию).
6. Хирургическая процедура: введение подкожных гормональных гранул и мини-насосов
- Подготовьте область в соответствии с разделом 1 (хирургическая подготовка).
- Обезболивайте животных в соответствии с этапами 2.1-2.3.
- Побрейте небольшой участок на загриве (~1 см х 1 см).
- Вводят 5 мг / кг карпрофена из разбавленного раствора 1 мг / мл подкожно в бок ноги.
- Тест на рефлекс защемления пальцев ног. Если рефлекса нет, животное находится в глубокой хирургической плоскости, и можно начинать процедуру.
- Нанесите бетадин на операционную область и накройте ее хирургической простыней (марлей с вырезанным окошком размером 2 см х 2 см).
- С помощью крысиных щипцов потяните кожу на загривке шеи (на полпути между истинным загривком и горбинкой спины) вверх и сделайте продольный разрез ~5 мм.
- С помощью тупых щипцов тупыми рассекайте кожу от нижележащего мышечного слоя в направлении вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для введения осмотической мини-помпы создайте карман вдоль одной стороны животного, чтобы насос не ограничивал движения животного и не прижимался к месту разреза. - После того, как будет сделано достаточно места для гормональной гранулы или мини-помпы, используйте стерильные щипцы, чтобы взять гранулы или мини-помпу и вставить их в подкожный карман, сделанный с тупым рассечением.
- Чтобы закрыть разрез кожи, убедитесь, что гранулы или мини-насос находятся достаточно далеко в кармане, чтобы хирургические зажимы не повредили его.
- Местно применяют бупивакаин в соответствии с шагом 2.17.
- Закройте рану одним хирургическим зажимом. Переместите мышь в клетку для восстановления и внимательно следите за ней в течение 15 минут. Поскольку это короткая процедура, животные должны быть амбулаторны в течение нескольких минут.
7. Экспериментальная процедура: перенос эмбрионов
- Для животных, подвергшихся овариэктомии, гормональный прайм за 3 дня до переноса эмбрионов путем подкожной инъекции эстрадиола 100 нг/100 мкл (этап 3.1).
- За день до переноса эмбрионов подкожную инъекцию 2 мг/100 мкл медроксипрогестерона ацетата (этап 3.2).
- Подготовьте область в соответствии с разделом 1 (хирургическая подготовка).
- Обезболивайте животных в соответствии с этапами 2.1-2.3.
- Начните процедуру в соответствии с шагами 2.4-2.10.
- Под рассекающим микроскопом создайте точку внутриматочной инъекции с помощью кончика иглы 26 G.
- Пипеткой поместите пять бластоцист в каплю среды M2, а затем перенесите их в рог матки.
- Чтобы закрыть разрез мышечной стенки, приподнимите верхнюю часть разреза с помощью щипцов, чтобы разрез естественным образом стянулся.
- С помощью шелковых швов закройте участок мышечной стенки хирургическим узлом. Применяют капли бупивакаина местно.
- Повторите шаги 7.5-7.8 с другой стороны.
- Чтобы закрыть разрез кожи, используйте марлю, чтобы намочить область насухо от избытка бупивакаина, и прижмите две стороны кожи друг к другу.
- Наложите один-два хирургических зажима, оставляя место для отека в рамках процесса заживления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животные подвергнуты овариэктомии, во время переноса эмбрионов требуются экзогенные гормоны. Либо подкожно вводят прогестерон (2 мг), либо вводят подкожные гранулы прогестерона или осмотическую мини-помпу. Для борьбы с избытком прогестерона во время переноса эмбрионов требуется подкожная инъекция низкой дозы (25 нг/100 мкл) эстрогена. - Осторожно отнесите мышь в клетку для восстановления и внимательно следите за ней в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны быстро просыпаться; Обязательно внимательно следите за дыханием, чтобы убедиться в нормальном дыхании грудной клетки.
8. Экспериментальная процедура: Искусственная децидуализация
- Гормонально вводите животным эстрадиол 100 нг/100 мкл в 1-й, 2-й и 3-й дни в соответствии с разделом 3 (гормональный препарат: подкожная инъекция) за 8 дней до искусственной децидуализации.
- Гормонально вводите животным эстрадиол 5 нг/100 мкл на 7-й, 8-й и 9-й день в соответствии с разделом 3 (гормональный препарат: подкожная инъекция) за 2 дня до искусственной децидуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная инъекция должна произойти минимум за 3 часа (и максимум за 4 часа) до процедуры искусственной децидуализации. - Животные с гормональным препаратом с подкожной гранулой прогестерона или мини-осмотическим насосом (500 мкг / день) в соответствии с разделом 4, разделом 5 и разделом 8, за 2 дня до искусственной децидуализации.
- Подготовьте область в соответствии с разделом 1 (хирургическая подготовка).
- Обезболивайте животных в соответствии с этапами 2.1-2.2.
- Проверьте глубину анестезии рефлексом защемления пальца ноги. Если нет реакции защемления пальцев ног, животное находится в глубокой хирургической плоскости, и процедура может продолжаться.
- Поместите мышь в положение лежа, поднимите хвост и медленно вставьте во влагалище зеркало диаметром 6 мм.
- Удерживая нос животного в анестезирующем носовом конусе, поместите нижнюю часть тела животного между первым и вторым пальцами недоминантной руки. Большим пальцем осторожно подтолкните хвост вверх, чтобы влагалищное отверстие было в поле зрения.
- Перенесите 20 мкл кунжутного масла в один рог матки с помощью нехирургического наконечника для переноса эмбрионов (прикрепленного к пипетке объемом 20 мкл).
- Держа пипетку на одном уровне с отверстием влагалища, вводят наконечник во влагалище и через шейку матки в рог матки. Как только наконечник окажется в роге матки, осторожно прижмите наконечник к поверхности эндометрия (если вы используете технику обращения, описанную выше, это движение будет ощущаться против второго пальца) и медленно вытесните масло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите поршень пипетки нажатым, подождите 10 секунд, чтобы убедиться, что все масло рассеялось, и медленно снимите передаточный наконечник, удерживая поршень нажатым.
- Держа пипетку на одном уровне с отверстием влагалища, вводят наконечник во влагалище и через шейку матки в рог матки. Как только наконечник окажется в роге матки, осторожно прижмите наконечник к поверхности эндометрия (если вы используете технику обращения, описанную выше, это движение будет ощущаться против второго пальца) и медленно вытесните масло.
- Извлеките зеркало из влагалища.
- Осторожно поднесите мышь к клетке для восстановления и внимательно следите за ней в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны быстро просыпаться. Внимательно следите за их дыханием, чтобы убедиться в нормальном дыхании грудной клетки. - Ограничьте обращение с животными и держите их в тихой обстановке в течение 96 часов после процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Громкие звуки или резкие изменения их светлого и темного цикла повлияют на успех процедуры. Во время рассечения тканей степень успешности децидуализации может быть измерена как отношение массы матки к массе тела. Процедура искусственной децидуализации имеет 80% успеха. Поэтому исключите животных, которые не могут децидуализировать, и учитывайте это при выборе размеров выборки для экспериментов.
9. Хирургическая процедура: послеоперационное восстановление, мониторинг и восстановление зажимов
- Дайте животным восстановиться наполовину включенные, наполовину выключенные грелки в течение ночи, прежде чем возвращать их в домашнюю клетку.
- Наблюдайте за животными ежедневно в течение 5 дней после операции, уделяя пристальное внимание месту раны на наличие признаков инфекции.
- При необходимости выполните ремонт зажима.
- Подготовьте область в соответствии с разделом 1 (хирургическая подготовка).
- Обезболивайте животных в соответствии с этапами 2.1-2.3.
- Удалите существующий клип с помощью средства для удаления клипов, если он все еще присутствует.
- Установите новый хирургический зажим в соответствии с шагами 2.19-2.21.
- Удалите хирургические зажимы через 7 дней после операции в соответствии с шагами 9.3.1-9.3.3 или когда животное находится под наркозом (например, для переноса эмбрионов, процедуры искусственной децидуализации или подкожной инъекции после операции).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хорошо описанная модель искусственной децидуализации описана в данной протокольной статье (рис. 1А). Здесь молодые взрослые самки мышей (8 недель) подверглись хирургической овариэктомии, как описано в разделах 1 и 2. Затем мышей отдыхали в течение 2 недель, чтобы убедиться, что эндогенные гормоны яичников рассеиваются, прежде чем их поддерживали экзогенными гормонами, как описано в разделах 3-7 и разделе 9. Искусственная децидуализация была вызвана интравагинальной инъекцией кунжутного масла, а затем животные отдыхали до сбора ткани, как описано в разделе 9. В этом исследовании искусственная децидуализация была выполнена у мышей C57BL6 / J, широко используемого штамма мышей. Во время забора тканей регистрировалась масса тела, а матка была рассечена и хорошо обрезана перед взвешиванием (рис. 1B). Степень децидуального ответа регистрировали путем выражения массы матки как отношения к массе тела. В этом исследовании 80% мышей C57BL6/J децидуализировались (0,01012 ± 0,001515, n = 15), в то время как 20% маток животных не децидуализировались (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (рис. 1C).
Рисунок 1: Схематические и репрезентативные результаты . (A) Схематическая временная шкала для экспериментального индуцирования искусственной децидуализации в мышиной модели. Сокращения: OVX = овариэктомия; E2 = эстрадиол (100 нг дни 1-3, 5 нг дни 7-9); P4 = прогестерон. Примечание: Гранула P4 была использована для получения результатов, представленных здесь. Альтернативные методы доставки прогестерона включают ежедневные подкожные инъекции и мини-осмотические насосы. (B) Репрезентативные изображения недецидуализированной (ND) и децидуализированной (D) матки молодых взрослых мышей C57BL6 / J. Масштабные линейки = 5 мм.(C) Сравнение соотношения массы матки к массе тела (UW:BW) у недецидуализованных и децидуализированных животных. Данные являются средними ± SEM; Критерий Манна-Уитни, **p = 0,003; НД: n = 3, D: n = 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Метод доставки гормонов | Сильные стороны | Слабые стороны |
| Подкожные инъекции | Хирургическое вмешательство не требуется | Многократная ежедневная обработка |
| Доступная методика, не требующая хирургической подготовки (по сравнению с имплантацией пеллет) | Гормоны в масле могут вытекать из места инъекции, поэтому количество, поглощаемое каждым животным, может варьироваться | |
| Гранулы с медленным высвобождением | Нет необходимости в ежедневной обработке | Требуется хирургическое вмешательство |
| Может быть изготовлен в доме | Отсутствует в продаже | |
| Доступная альтернатива осмотических мини-насосам | ||
| Маленький и очень хорошо переносится животными | ||
| Осмотические мини-насосы | Нет необходимости в ежедневной обработке | Требуется хирургическое вмешательство |
| Имеющихся | Дорогой | |
| Самый точный способ доставки | Намного больше, чем гранулы с медленным высвобождением |
Таблица 1: Сильные и слабые стороны методов доставки гормонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлены пошаговые инструкции о том, как выполнять OVX и предоставлять экзогенные гормоны для исследований, направленных на понимание вклада матки в беременность и фертильность. Представлены два подробных протокола по двум экспериментальным применениям этих методов, включая перенос эмбрионов и искусственное индуцирование децидуализации.
Несмотря на то, что выполнение OVX может быть сложным на начальном этапе, особенно для исследователей, плохо знакомых с моделями грызунов, это относительно простая процедура после надлежащего обучения и практики. Ключевые шаги в процедурах включают тщательное наблюдение за животными, пока они находятся под наркозом, и обеспечение того, чтобы не осталось ткани яичника. В некоторых моделях яйцевод может быть оставлен нетронутым. Однако следует отметить, что яйцевод представляет собой гормоночувствительную ткань с обильным количеством рецепторов эстрогена и прогестерона19. Хирургический протокол удаления яичника и яйцевода намного проще по сравнению с удалением только яичника, так как первый может быть выполнен невооруженным глазом. Чтобы удалить только яичник и оставить яйцевод на месте в последнем случае, требуется рассекающий микроскоп, так как это гораздо более сложная процедура. Следовательно, время работы может быть увеличено, так как животное необходимо перемещать между сценой препарирующего микроскопа и операционным полем для различных частей процедуры, таких как наложение швов на внутреннюю стенку тела.
Протоколы обезболивания, описанные здесь, являются стандартными и одобрены комитетом по этике животных Университета Монаша, поэтому они могут варьироваться в зависимости от требований или предпочтений комитета по этике отдельного учреждения. Следует отметить, что для процедуры искусственной децидуализации анальгезия не проводилась, так как типичные нестероидные противовоспалительные средства мешают процессу децидуализации. Если исследователи хотят предоставить анальгетики во время искусственной децидуализации, это следует принять во внимание.
В этой работе представлены три метода доставки гормонов в дополнение к гормонам яичников после OVX, и каждый метод имеет свои сильные и слабые стороны (таблица 1). Подкожные инъекции гормонов в масло распространены в литературе14,16,17. Этот метод имеет много сильных сторон, в том числе тот факт, что не требуется хирургическая процедура и, следовательно, не требуется формального обучения хирургии грызунов или газовой анестезии. Это делает подкожную инъекцию доступным вариантом практически для всех исследовательских групп. Инъекции также доступны по цене и просты в проведении. Практически, однако, они имеют некоторые ограничения, особенно в моделях беременности. Чтобы поддерживать беременность у животного OVX, необходимо ежедневно принимать гормональные добавки с прогестероном для поддержки беременности. Возможно, удастся прекратить ежедневные инъекции, как только плацента достаточно развита, чтобы стать основным источником прогестерона, хотя это не было опробовано в представленных здесь протоколах. Как ни странно, гормоны в масле могут вытекать из места инъекции после подкожной инъекции. Отчасти это может быть связано с размером иглы, необходимой (26 г), чтобы легко дозировать что-то столь же вязкое, как кунжутное масло. Следовательно, эту утечку необходимо контролировать и регистрировать при выполнении впрыска масла, чтобы соотнести это с результатами эксперимента.
Гранулы с медленным высвобождением предпочтительнее подкожных инъекций, так как они экономичны и просты в изготовлении собственными силами. Тем не менее, они требуют нескольких ночных шагов, которые следует учитывать при планировании экспериментальных сроков. Эти гранулы выделяют приблизительно 500 мкг в день (по оценке во время инкубации во время инкубации в среде клеточных культур и последующего ИФА прогестерона). Следует отметить, что это более низкая концентрация по сравнению с ежедневными подкожными инъекциями, описанными выше, и связано это с постоянством доставки прогестерона из гранулы. Как упоминалось выше, впрыск масла может вытекать из места впрыска, тем самым снижая общую концентрацию. В предыдущих исследованиях эти гранулы были активны in vivo только в течение 10 дней после их хирургического введения. Таким образом, в исследованиях беременности остается неясным, может ли потребоваться введение второй гранулы в середине беременности или плацента может в достаточной степени обеспечить эндокринную поддержку беременности на этом этапе. Таким образом, эти гранулы оптимальны для краткосрочных моделей беременности, включая представленный здесь протокол искусственной децидуализации, а также исследования беременности до 10 дней после переноса эмбрионов. В то время как гранулы с медленным высвобождением сводят на нет необходимость ежедневного обращения с животными и инъекций, некоторые инъекции эстрогена в низких дозах по-прежнему необходимы, чтобы сбалансировать петлю обратной связи рецептора прогестерона. Эта стратегия использовалась ранее20,21.
Наконец, осмотические мини-насосы являются наиболее точным методом доставки гормонов и коммерчески доступны, но они являются самым дорогим вариантом. Осмотические мини-насосы могут доставлять установленную концентрацию гормона ежедневно в течение 28 дней, в зависимости от выбранной модели. Подобно гранулам с медленным высвобождением, в то время как осмотические мини-насосы избегают необходимости ежедневного обращения с животными, некоторые инъекции эстрогена в низких дозах по-прежнему требуются.
Описанный здесь протокол искусственной децидуализации позволяет изучать раннюю веху беременности независимо от влияния яичников и эмбрионов. В то время как люди подвергаются децидуализации с каждым менструальным циклом, грызуны децидуализируются только во время наступления беременности. Таким образом, эта модель имеет огромную ценность для изучения вех беременности, подобных человеку, в манипулируемой модели грызунов. Процедура, описанная в настоящем документе, является относительно неинвазивной, так как в ней используется нехирургическое устройство для переноса эмбрионов (NSET) для доставки кунжутного масла непосредственно в рог матки через влагалище и шейку матки. Хотя эта процедура менее инвазивна, чем другие методологии, она может стать довольно дорогой при использовании коммерческих NSET. Для сравнения, другие опубликованные модели искусственной децидуализации требуют хирургической процедуры для выполнения внутриматочных инъекций масла17. Для этого требуется хирургическая установка, аналогичная описанной в разделе 1 и шагах 2.1-2.11. Однако у животных, которые ранее подвергались овариэктомии, может быть сложнее идентифицировать и обнажить рог матки. Также могут быть спайки, образовавшиеся в результате предыдущей хирургической процедуры овариэктомии. Таким образом, хотя выполнение хирургических внутриматочных инъекций для индукции децидуализации может быть более рентабельным, время хирургического вмешательства и анестезии значительно больше, чем альтернатива использованию NSET. Существуют установленные протоколы для собственных изготовленных альтернатив22 коммерчески доступным NSET, которые являются гораздо более эффективными с точки зрения затрат.
Хотя процедура переноса эмбрионов описана здесь, мы ранее публиковали эту модель и ее показатели успеха на разных штаммах мышей14. Более того, в то время как метод переноса эмбрионов, описанный здесь, использует хирургический подход, NSET также могут быть интегрированы в эту процедуру.
Будущие направления в этой области должны включать исследования, сосредоточенные на конкретном вкладе матки в установление и поддержание беременности. Эти знания имеют решающее значение для дальнейшего понимания идиопатического бесплодия, неудачи имплантации и осложнений беременности. Расширение наших знаний в этих областях также имеет основополагающее значение для улучшения клинических результатов для пациентов с ЭКО / ИКСИ, а также для нашего понимания беременности как биологического процесса.
В заключение, OVX — это простая процедура, которая может быть интегрирована в модели на животных для изучения вклада матки в беременность и фертильность. Модели в будущем выиграют от интеграции OVX и доставки экзогенных гормонов, чтобы можно было сравнивать вклад яичников и матки в фертильность и беременность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых или иных интересов.
Acknowledgments
Эта работа стала возможной благодаря поддержке оперативной инфраструктуры правительства штата Виктория и Национальному совету по здравоохранению и медицинским исследованиям правительства Австралии (NHMRC) IRIISS. Эта работа была поддержана грантом на доступ к платформе медицины, сестринского дела и медицинских наук Университета Монаша для A.L.W. (Winship-PAG18-0343) для доступа к платформе репродуктивных услуг Монаша. A.L.W. поддерживается финансированием DECRA DE21010037 от Австралийского исследовательского совета (ARC). J.N.H. и L.R.A. поддерживаются стипендией Австралийской правительственной программы обучения исследованиям. L.R.A. поддерживается стипендией Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. поддерживается стипендией ARC Future Fellowship FT190100265.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientific | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientific | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientific | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientific | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientific | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose) |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al.
