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Developmental Biology

Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

O estabelecimento da gravidez é um processo dinâmico que envolve o crosstalk embrionário e uterino complexo. As contribuições precisas do ambiente uterino materno para esses processos permanecem como uma área ativa de investigação. Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para ajudar no projeto de modelos animais in vivo para abordar essas questões de pesquisa.

Abstract

Para que a gravidez seja estabelecida, um blastocisto viável deve interagir com sucesso com um revestimento uterino receptivo (endométrio) para facilitar a implantação e a formação da placenta e permitir a gravidez contínua. As limitações ao sucesso da gestação causadas por defeitos embrionários são bem conhecidas e foram amplamente superadas nas últimas décadas com o surgimento da fertilização in vitro (FIV) e das tecnologias de reprodução assistida. No entanto, até o momento, o campo não superou as limitações causadas por um endométrio inadequadamente receptivo, resultando em taxas de sucesso de FIV estagnadas. As funções ovariana e endometrial estão intimamente interligadas, pois os hormônios produzidos pelo ovário são responsáveis pela ciclicidade menstrual do endométrio. Como tal, ao usar modelos de roedores de gravidez, pode ser difícil determinar se um resultado observado é devido a um déficit ovariano ou uterino. Para superar isso, um modelo de camundongo ovariectomizado foi desenvolvido com transferência embrionária ou decidualização artificial para permitir o estudo de contribuições uterino-específicas para a gravidez. Este artigo fornecerá instruções sobre como realizar ooforectomia e oferecerá insights sobre várias técnicas para fornecer hormônios exógenos para apoiar a decidualização artificial bem-sucedida ou gravidez após a transferência de embriões de doadoras saudáveis. Essas técnicas incluem injeção subcutânea, pastilhas de liberação lenta e minibombas osmóticas. As principais vantagens e desvantagens de cada método serão discutidas, permitindo que os pesquisadores escolham o melhor desenho de estudo para sua pergunta de pesquisa específica.

Introduction

Com o crescente uso de tecnologias de reprodução assistida nas últimas décadas, muitas barreiras à concepção foram superadas, permitindo que muitos casais constituíssem família apesar dos problemas de fertilidade1. Déficits de ovócitos ou espermatozoides muitas vezes podem ser contornados usando fertilização in vitro ou injeção intracitoplasmática de espermatozoides; No entanto, questões relacionadas ao útero e à receptividade endometrial permanecem uma "caixa preta" elusiva do potencial reprodutivo2.

A gravidez é estabelecida quando um embrião de alta qualidade interage com sucesso com um endométrio receptivo (revestimento uterino). As chances de sucesso da gravidez em qualquer ciclo menstrual são baixas, em torno de 30%3,4. Das que são bem-sucedidas, apenas 50%-60% avançam para além de 20 semanas de gestação, sendo a falha de implantação responsável por 75% das gestações que não atingem 20 semanas3. Apesar desses números remontam ao final da década de 1990, o campo ainda não superou as limitações causadas por um endométrio inadequadamente receptivo. Isso resultou em taxas de sucesso de FIV estagnadas e, às vezes, declinantes nos últimos anos 5,6.

Mulheres com infertilidade inexplicável muitas vezes têm uma janela deslocada de receptividade ou são incapazes de alcançar a receptividade por razões desconhecidas. Recentemente, foi desenvolvido o arranjo de receptividade endometrial, que avalia a expressão de centenas de genes com o objetivo de adequar o momento da transferência embrionária à janela de receptividade do indivíduo 7,8,9. No entanto, o campo ainda carece de uma compreensão da patogênese das complicações da gravidez que se manifestam após o processo de implantação ser concluído.

O sistema reprodutor feminino é altamente dinâmico e sob rígido controle hormonal. O eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) controla a liberação do hormônio luteinizante e do hormônio folículo-estimulante, que regulam aspectos do ciclo ovariano, incluindo a maturação dos folículos e a atividade de estrogênio e progesterona. Por sua vez, o ciclo menstrual uterino é regulado por estrógenos e progesterona10,11. Assim, o estudo dos mecanismos biológicos uterinos é complicado pela influência ovariana. Por exemplo, ao estudar como as terapias contra o câncer podem afetar o útero, pode ser difícil distinguir se qualquer fenótipo uterino observado (como perda gestacional ou acíclica menstrual) é o resultado de um insulto direto ao útero ou um efeito consequente de danos aos ovários.

Para compreender de forma abrangente a fertilidade, as contribuições uterinas para a gravidez devem ser caracterizadas. É importante ressaltar que esse entendimento deve ir além da função uterina sob controle ovariano. Isso não pode ser estudado em humanos; portanto, modelos animais são frequentemente empregados. Como tal, a ooforectomia (OVX) é comumente usada para permitir que os pesquisadores regulem os ciclos estrais dos roedores (análogos ao ciclo menstrual), fornecendo hormônios exogenamente. Além disso, a OVX permite que as respostas uterinas sejam estudadas independentemente da influência ovariana12. No entanto, se os hormônios não forem fornecidos imediatamente pós-OVX, um fenótipo de menopausa ocorrerá, o que precisa ser cuidadosamente considerado pelos pesquisadores.

A OVX é frequentemente utilizada em modelos de roedores13,14,15,16,17 e é relativamente fácil de ser realizada após treinamento adequado. Os métodos variam dependendo se o ovário sozinho ou o ovário e o oviduto são removidos, bem como dependendo da idade do animal (animais adultos, cicladores têm ovários maiores com um corpo lúteo visível em sua superfície, o que significa que seus ovários são mais fáceis de visualizar). Da mesma forma, existem muitos métodos de suplementação hormonal, incluindo injeções subcutâneas14, pastilhas de liberação lenta 15, minibombas osmóticas18 e enxerto ovariano.

Neste artigo, instruções detalhadas são fornecidas sobre como realizar ooforectomia e preparar três tipos de suplementação hormonal, incluindo injeções subcutâneas, pastilhas de liberação lenta e mini bombas osmóticas. Dois protocolos detalhados são fornecidos para desfechos experimentais que se beneficiam da OVX seguida de suplementação hormonal exógena (transferência embrionária e decidualização artificial). Este artigo discute os pontos fortes e fracos de cada abordagem com o objetivo de orientar os pesquisadores sobre como realizar estudos para isolar os impactos sobre o útero, especificamente nos campos de pesquisa da gravidez e fertilidade.

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Protocol

Todos os animais foram alojados em instalações de alta barreira com temperatura controlada (Monash University Animal Research Laboratory), com livre acesso à água e ração e ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a aprovação do comitê de ética da Monash Animal Research Platform (#21908, 17971) e realizados de acordo com o National Health and Medical Research Council Code of Practice for the care and use of animals.

1. Preparo cirúrgico

  1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, gazes e toalhas de papel necessários para os procedimentos em um ciclo de produtos duros/secos a 121 °C com um tempo de espera de 30 min e um tempo de secagem de 30 min.
  2. Coloque uma bancada estéril para o espaço de trabalho cirúrgico e prepare analgésicos.
    1. Diluir o carprofeno em solução salina estéril para 1 mg/ml e diluir a bupivacaína em solução salina estéril para solução a 0,5% (p/v).
    2. Adicionar 3,5 ml de meloxicam a uma garrafa de água de gaiola de 400 ml.
  3. Pré-aqueça a(s) almofada(s) térmica(s) para as gaiolas de recuperação e configure lâmpadas de calor para iluminar indiretamente os animais em recuperação.
  4. Certifique-se de que todos os EPIs apropriados sejam usados, incluindo uma rede de cabelo, máscara facial, avental e luvas.
  5. Pratique uma boa técnica estéril, incluindo pulverizar regularmente as luvas com etanol e deixá-las evaporar antes de manusear o animal ou ferramentas cirúrgicas para evitar a contaminação por etanol.

2. Realização de ooforectomia

  1. Usando um aparelho de anestesia a gás com isoflurano, pré-encha a caixa de indução por 3-5 min a isoflurano a 5% com a taxa de fluxo ajustada para 4 L/min.
  2. Coloque o rato dentro da caixa de indução e, uma vez inconsciente, mova-o para o cone nasal e reduza a taxa de fluxo para 0,4 L/min, com o vaporizador de isoflurano regulado para ~2,5%.
    NOTA: A porcentagem de isoflurano usada para o restante do procedimento varia com base na cepa do camundongo, idade e exposição a tratamentos (por exemplo, quimioterapia) e deve ser ajustada com base em uma avaliação rigorosa dos padrões respiratórios de cada animal. Os padrões respiratórios devem permanecer como respirações abdominais regulares. Respirações torácicas rápidas podem indicar que um plano cirúrgico profundo não foi alcançado ou mantido; Neste caso, ajuste a porcentagem do vaporizador de isoflurano conforme necessário.
  3. Aplique o lubrificante ocular generosamente, apertando o tubo e esfregando suavemente o olho.
  4. Faça a barba em uma pequena área (2 cm x 2 cm) na e abaixo do palpite da coluna.
  5. Administrar 5 mg/kg de carprofeno a partir de uma solução diluída de 1 mg/ml por via subcutânea no pescoço.
  6. Teste a profundidade da anestesia com o reflexo de pinça do dedo do pé apertando o dedo posterior do mouse. Se não houver reação de pinça do dedo do pé, o animal fica no plano cirúrgico profundo e o procedimento pode continuar.
  7. Aplique betadina na área cirúrgica e cubra com um pano cirúrgico (uma gaze com uma janela de 2 cm x 2 cm recortada).
  8. Usando pinças dentadas de rato, puxe a pele no ângulo das costas para cima e faça uma incisão longitudinal de ~5 mm.
    NOTA: Uma incisão de pele nesta altura no dorso do animal é melhor para a colocação de clipes cirúrgicos para reduzir a chance de o animal remover os clipes e exigir reparos do clipe.
  9. Usando pinças rombas, proceda à dissecação romba da pele para longe da camada muscular subjacente, movendo-se para baixo e para um lado em direção ao rim.
  10. Identifique visualmente o rim, ovário e coxim gorduroso ovariano através da parede muscular.
    NOTA: O rim aparecerá uma cor vermelha escura, a almofada de gordura aparecerá branco brilhante e, se visível, o ovário parecerá um pequeno ponto rosa dentro da almofada de gordura.
  11. Usando pinças, agarre e levante a camada muscular. Faça uma incisão de ~0,5-1 cm com tesoura cirúrgica afiada. Continue segurando a parede muscular com pinças e troque de tesoura para pinça romba para puxar o coxim de gordura ovariana através da incisão.
  12. Usando um porta-agulha curvo, pinça sob o ovário e oviduto na extremidade distal do corno uterino.
    NOTA: Alternativamente, o ovário sozinho pode ser removido, deixando o oviduto intacto. No entanto, um microscópio dissecante é necessário para visualizar com precisão a distinção entre o ovário e o oviduto.
  13. Retire o ovário com uma tesoura ou bisturi. Continue a clampar por 30 s para evitar sangramento excessivo.
  14. Retire a braçadeira e passe com gaze estéril, se necessário.
  15. Para fechar a incisão da parede muscular, use pinça para levantar o topo da incisão para que a incisão se prenda naturalmente.
  16. Use suturas de seda (tamanho 3-0) para fechar a incisão da parede muscular com um nó do cirurgião.
  17. Aplicar duas a três gotas de bupivacaína topicamente usando uma seringa de 1 mL sem agulha acoplada e repetir os passos 2,9-2,17 do outro lado.
  18. Para fechar a incisão da pele, use gaze para secar a área de excesso de bupivacaína e pressione os dois lados da pele juntos.
  19. Aplicar de um a dois clipes cirúrgicos de 7 mm, permitindo espaço para inchaço como parte do processo de cicatrização.
  20. Mova o mouse para uma gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos.
    OBS: Os animais devem acordar rapidamente; Certifique-se de monitorar a respiração de perto para padrões respiratórios torácicos normais.

3. Preparação hormonal: Injeção subcutânea

  1. Faça uma solução-mãe de 1 mg/mL de estradiol.
    1. Pesar 0,001 g (1 mg) de pó de estradiol em um tubo estéril de 1,5 mL.
    2. Adicione 1 mL de etanol a 100% ao tubo e o vórtice por alguns segundos.
      NOTA: O etanol permanecerá límpido com manchas visíveis de pó de estradiol.
    3. Envolva o tubo com filme para evitar qualquer evaporação de etanol.
    4. Embrulhe o tubo em papel alumínio e coloque-o em um balancim durante a noite para dissolver completamente o pó de estradiol.
    5. Diluir este estoque de 1 mg/mL em óleo de gergelim até a concentração final desejada.
      NOTA: Doses de 100 ng por 3 dias são necessárias para priming antes da decidualização artificial, e doses baixas adicionais de 25 ng são necessárias quando a progesterona é administrada. Isto é para combater a alça de feedback que controla a expressão do receptor de progesterona. Para a transferência de embriões, são necessárias duas doses de 100 ng no dia 1 e no dia 3 antes da transferência de embriões no dia 4. No momento da transferência embrionária, uma dose baixa de 25 ng também é necessária.
    6. Retirar a quantidade necessária de estradiol no óleo para uma seringa de 1 mL e, em seguida, anexar uma ponta de agulha de 26 G.
    7. Injetar a dose adequada por via subcutânea (no scruff ou flanco; 100 ng/100 μL ou 25 ng/100 μL para priming antes da transferência de embriões ou decidualização artificial ou no momento da transferência de embriões) com a frequência necessária.
      NOTA: O óleo é muito viscoso, por isso certifique-se de injetar lentamente e pausar por alguns segundos antes de remover a agulha. Isso minimizará a quantidade de óleo que vaza para fora do local da injeção.
  2. Fazer uma solução-mãe de 200 mg/mL de progesterona.
    1. Pesar 0,4 g (400 mg) de pó de progesterona em um tubo estéril de 5 mL.
    2. Adicione 2 mL de etanol a 100% ao tubo e vórtice por alguns segundos.
      NOTA: O etanol ficará de cor branca.
    3. Repita as etapas 3.1.3-3.1.4.
    4. Diluir o estoque de 200 mg/mL em óleo de gergelim até a concentração final desejada.
      NOTA: Doses de 2 mg por dia são necessárias para apoiar a transferência de embriões.
    5. Injetar a dose apropriada (por exemplo, 2 mg/100 μL por dia para apoiar a gravidez) por via subcutânea, como nos passos 3.1.6-3.1.7.

4. Preparação hormonal: Pellets de liberação lenta

  1. Coloque uma folha sobre a superfície de um fluxo laminar ou capa de biossegurança classe II.
  2. Coloque todo o equipamento (luvas, placas de Petri, seringas de 1 mL, pinça fina) no capô e ligue o UV por 20 min.
    NOTA: Não ligue o UV com o selante dentro da coifa, pois ele irá se ajustar.
  3. Lave a tubulação de silastic em etanol 100% e deixe secar ao ar na coifa. Depois de seco, marque ~1 cm de comprimento ao longo da tubulação e corte com bisturi.
  4. Retire o êmbolo de uma seringa e esprema ~200 μL de selante. Substitua o êmbolo e deprima uma pequena quantidade de selante para fora da seringa.
  5. Aplique uma pequena quantidade de selante em uma das extremidades da tubulação e alise com um dedo enluvado.
  6. Deixe secar durante a noite ou por 20-30 min em luz UV dentro do exaustor.
  7. Despeje uma quantidade adequada de progesterona em uma placa de Petri esterilizada. Usando pinças, coloque pellets no pó de progesterona para preencher o pellet.
    1. Bata a extremidade selada do pellet na superfície do capô para condensar a progesterona para baixo. Alternativamente, use a extremidade da pinça esterilizada para encher a progesterona. Deixe espaço suficiente para mais selante.
  8. Selar a extremidade aberta com selante, conforme descrito nos passos 3.4-3.5.
  9. Embrulhe a placa de Petri que contém os pellets de progesterona em papel alumínio para protegê-la da luz.
  10. Ativar os pellets durante um mínimo de 72 h antes da inserção subcutânea incubando em FCS descascado de carvão a 1% (cs-FCS: PBS) a 37 °C.
    NOTA: Os pellets podem ser feitos a granel com uma única extremidade selada com antecedência. No entanto, a progesterona fresca deve ser usada para preenchê-los cada vez. Certifique-se de que os pellets pré-fabricados sejam esterilizados por UV antes do enchimento com progesterona. Os pellets secretarão ~500 μg/dia por 6-10 dias, o que é suporte suficiente para decidualização artificial e procedimentos de transferência de embriões, embora uma injeção adicional de baixa dose de estrogênio possa ser necessária para manter a atividade do receptor de progesterona além de 4-5 dias. Além de 10 dias, uma pastilha de progesterona de reposição pode ser necessária.

5. Preparação hormonal: mini bombas osmóticas

  1. Preparar progesterona na concentração desejada em uma solução aquosa e selecionar o modelo apropriado de mini bomba osmótica (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Para a secção 7 (procedimento experimental: transferência de embriões), é necessária a administração de 2 mg/dia durante 12 dias. Portanto, dissolva 28 mg de progesterona em ~100 μL de água estéril por animal (siga as instruções do fabricante para o volume específico). Podem ser necessárias diluições em série. Para a seção 8 (procedimento experimental: decidualização artificial), é necessária a administração de 500 μg por dia durante 3 dias. Portanto, dissolva 1.500 μg de progesterona em ~100 μL de água estéril por animal. Prepare uma solução extra para contabilizar o volume perdido durante o procedimento de enchimento.
  2. Configure o equipamento (luvas, lenços umedecidos com fiapos baixos, placas de Petri, soro fisiológico estéril, seringas de 1 mL, barcos de pesagem pequenos, papel alumínio e balanças com precisão de 0,01 g) dentro de uma capa de biossegurança classe II e, em seguida, ligue o UV por 20 minutos.
  3. Introduza a solução hormonal numa seringa de 1 ml e, em seguida, fixe um tubo de enchimento estéril, certificando-se cuidadosamente de que não existem bolhas de ar.
  4. Pesar a bomba e seu moderador de fluxo dentro de um barco de pesagem estéril.
  5. Insira o tubo de enchimento através da abertura na parte superior da bomba até que ele não possa ir mais longe.
  6. Segurando a bomba na vertical, empurre lentamente o êmbolo da seringa para encher o tubo.
    NOTA: O enchimento rápido deve ser evitado, pois isso pode introduzir bolhas de ar na bomba.
  7. Quando a solução transbordar da parte superior da bomba, remova suavemente o tubo de enchimento e limpe o excesso de solução com um lenço estéril de fiapos baixos.
  8. Insira o moderador de fluxo através da abertura na parte superior da bomba até que ele não possa ir mais longe. Uma vez totalmente dentro, pressione firmemente a bomba e o moderador de fluxo juntos.
  9. Pese a bomba cheia com o moderador de fluxo no lugar.
    NOTA: A diferença de peso obtida a partir dos passos 5.3 e 5.8 dará o peso líquido da solução carregada (ou seja, um aumento de 0,1 g = 100 μL de solução adicionada).
  10. Coloque a bomba cheia em uma placa de Petri estéril cheia de soro fisiológico estéril.
  11. Depois que todas as bombas estiverem cheias, envolva a placa de Petri em papel alumínio e coloque-a dentro de uma incubadora de 37 °C para preparar por pelo menos 4-6 h (ou até estar pronta para uso).

6. Procedimento cirúrgico: Inserção de pastilhas de hormônio subcutâneo e mini bombas

  1. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
  2. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.3.
  3. Faça a barba de uma pequena área no pescoço (~1 cm x 1 cm).
  4. Administrar 5 mg/kg de carprofeno a partir de uma solução diluída de 1 mg/ml por via subcutânea no flanco da perna.
  5. Teste para o reflexo de pinça do dedo do pé. Se não houver reflexo, o animal fica no plano cirúrgico profundo, e o procedimento pode começar.
  6. Aplique betadina na área cirúrgica e cubra-a com um pano cirúrgico (uma gaze com uma janela de 2 cm x 2 cm recortada).
  7. Usando pinças dentadas de rato, puxe a pele no pescoço (a meio caminho entre o verdadeiro scruff e o palpite das costas) para cima e faça uma incisão longitudinal de ~5 mm.
  8. Usando pinças rombas, disseque a pele para longe da camada muscular subjacente em uma direção descendente.
    OBS: Para inserção da mini bomba osmótica, crie uma bolsa ao longo de um dos lados do animal para que a bomba não restrinja o movimento do animal ou pressione contra o local da incisão.
  9. Uma vez que o espaço suficiente tenha sido feito para a pastilha de hormônio ou mini bomba, use pinças estéreis para pegar o pellet ou mini bomba e insira-o na bolsa subcutânea feita com dissecção romba.
  10. Para fechar a incisão da pele, certifique-se de que o pellet ou minibomba esteja longe o suficiente no bolso para que os clipes cirúrgicos não o danifiquem.
  11. Aplicar topicamente a bupivacaína conforme passo 2.17.
  12. Feche a ferida com um clipe cirúrgico. Mova o mouse para uma gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos. Como se trata de um procedimento curto, os animais devem ser deambulados em poucos minutos.

7. Procedimento experimental: Transferência de embriões

  1. Para animais ovariectomizados, hormônio-prime 3 dias antes da transferência embrionária por injeção subcutânea de 100 ng/100 μL de estradiol (passo 3.1).
  2. Um dia antes da transferência embrionária, os animais receberam uma injeção subcutânea de 2 mg/100 μL de acetato de medroxiprogesterona (passo 3.2).
  3. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
  4. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.3.
  5. Inicie o procedimento de acordo com as etapas 2.4-2.10.
  6. Sob um microscópio dissecante, crie um ponto de injeção intrauterino com uma ponta de agulha de 26 G.
  7. Pipetar cinco blastocistos em uma gota de meio M2 e, em seguida, transferi-los para o corno uterino.
  8. Para fechar a incisão da parede muscular, levante o topo da incisão usando pinças para que a incisão se prenda naturalmente.
  9. Usando suturas de seda, feche o local da parede muscular com um nó do cirurgião. Aplicar gotas de bupivacaína topicamente.
  10. Repita as etapas 7.5-7.8 do outro lado.
  11. Para fechar a incisão da pele, use gaze para secar a área de excesso de bupivacaína e pressione os dois lados da pele juntos.
  12. Aplique de um a dois clipes cirúrgicos, deixando espaço para inchaço como parte do processo de cicatrização.
    NOTA: Se os animais são ovariectomizados, hormônios exógenos são necessários no momento da transferência embrionária. Injetar progesterona (2 mg) por via subcutânea ou inserir uma pastilha de progesterona subcutânea ou uma mini bomba osmótica. Para combater o excesso de progesterona, uma injeção subcutânea de baixa dose (25 ng/100 μL) de estrogênio é necessária no momento da transferência embrionária.
  13. Leve cuidadosamente o mouse para uma gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos.
    OBS: Os animais devem acordar rapidamente; Certifique-se de monitorar a respiração de perto para padrões respiratórios torácicos normais.

8. Procedimento experimental: Decalidualização artificial

  1. Primer hormônio-os animais com 100 ng/100 μL de estradiol no dia 1, dia 2 e dia 3, conforme seção 3 (preparação hormonal: injeção subcutânea) 8 dias antes da decidualização artificial.
  2. Primer hormônio-os animais com 5 ng/100 μL de estradiol no dia 7, dia 8 e dia 9, conforme seção 3 (preparação hormonal: injeção subcutânea) 2 dias antes da decidualização artificial.
    NOTA: A injeção final deve ocorrer no mínimo 3 h (e no máximo 4 h) antes do procedimento de decidualização artificial.
  3. Animais com pastilha subcutânea de progesterona ou mini bomba osmótica (500 μg/dia), conforme seção 4, seção 5 e seção 8, 2 dias antes da decidualização artificial.
  4. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
  5. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.2.
  6. Teste a profundidade da anestesia com o reflexo de pinça dos dedos. Se não houver reação de pinça do dedo do pé, o animal fica no plano cirúrgico profundo e o procedimento pode continuar.
  7. Coloque o rato em decúbito ventral, levante a cauda e insira lentamente um espéculo de 6 mm de diâmetro na vagina.
  8. Mantendo o nariz do animal no cone anestésico nasal, coloque a parte inferior do corpo do animal entre o primeiro e o segundo dedos da mão não dominante. Use o polegar para empurrar suavemente a cauda para cima para manter a abertura vaginal à vista.
  9. Transfira 20 μL de óleo de gergelim para um corno uterino usando uma ponta de transferência de embriões não cirúrgica (conectada a uma pipeta de 20 μL).
    1. Mantendo o nível da pipeta com a abertura vaginal, insira a ponta na vagina e através do colo do útero no corno uterino. Uma vez que a ponta está no corno uterino, pressione suavemente a ponta contra a superfície endometrial (se usar a técnica de manipulação acima, esse movimento será sentido contra o segundo dedo) e expulse lentamente o óleo.
      NOTA: Mantenha o êmbolo da pipeta pressionado, aguarde 10 s para garantir que todo o óleo se dispersou e remova lentamente a ponta de transferência, mantendo o êmbolo pressionado.
  10. Remova o espéculo da vagina.
  11. Leve cuidadosamente o mouse até a gaiola de recuperação e monitore de perto por 15 minutos.
    OBS: Os animais devem acordar rapidamente. Monitore sua respiração de perto para padrões respiratórios torácicos normais.
  12. Limitar o manuseio dos animais e mantê-los em ambiente silencioso por 96 h após o procedimento.
    NOTA: Ruídos altos ou mudanças abruptas em seu ciclo claro e escuro afetarão o sucesso do procedimento. No momento da dissecção tecidual, a extensão do sucesso da decidualização pode ser medida como uma razão entre o peso uterino e o peso corporal. O procedimento de decidualização artificial tem uma taxa de sucesso de 80%. Portanto, exclua os animais que não conseguem decifrar e leve isso em consideração ao selecionar tamanhos de amostra para os experimentos.

9. Procedimento cirúrgico: Recuperação pós-cirúrgica, monitorização e reparos de clipes

  1. Permita que os animais recuperem almofadas térmicas semiligadas e semiligadas durante a noite antes de devolvê-los à sua gaiola de origem.
  2. Monitorar os animais diariamente por 5 dias pós-operatórios, prestando muita atenção ao local da ferida em busca de sinais de infecção.
  3. Execute o reparo do clipe, se necessário.
    1. Preparar a área conforme seção 1 (preparação cirúrgica).
    2. Anestesiar os animais conforme os passos 2.1-2.3.
    3. Remova o clipe existente usando um removedor de clipe se o clipe ainda estiver presente.
    4. Aplicar um novo clipe cirúrgico, conforme passos 2.19-2.21.
  4. Remova os clipes cirúrgicos 7 dias após a cirurgia de acordo com as etapas 9.3.1-9.3.3 ou quando o animal estiver sob anestesia (como para uma transferência de embrião, o procedimento de decidualização artificial ou uma injeção subcutânea após a cirurgia).

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Representative Results

Um modelo bem caracterizado de decidualização artificial é descrito neste artigo de protocolo (Figura 1A). Aqui, camundongos fêmeas adultas jovens (8 semanas de idade) foram submetidos à ooforectomia cirúrgica, conforme descrito na seção 1 e na seção 2. Os camundongos foram então descansados por 2 semanas para garantir que os hormônios ovarianos endógenos se dissipassem antes de serem suportados com hormônios exógenos, conforme descrito nas seções 3-7 e seção 9. A decidualização artificial foi induzida por injeção intravaginal de óleo de gergelim e, em seguida, os animais foram descansados até a coleta do tecido, conforme descrito na seção 9. Neste estudo, a decidualização artificial foi realizada em camundongos C57BL6/J, uma linhagem de camundongos comumente usada. No momento da coleta do tecido, o peso corporal foi registrado, e o útero foi dissecado e bem aparado antes de ser pesado (Figura 1B). A extensão da resposta decidual foi registrada expressando-se o peso uterino como razão do peso corporal. Neste estudo, 80% dos camundongos C57BL6/J decidualizaram (0,01012 ± 0,001515, n = 15), enquanto 20% dos úteros dos animais não decidualizaram (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Resultados esquemáticos e representativos . (A) Linha do tempo esquemática para indução experimental de decidualização artificial em um modelo de camundongo. Abreviações: OVX = ooforectomia; E2 = estradiol (100 ng dias 1-3, 5 ng dias 7-9); P4 = progesterona. Nota: Uma pastilha P4 foi utilizada para gerar os resultados aqui apresentados. Métodos alternativos para administração de progesterona incluem injeções subcutâneas diárias e bombas mini-osmóticas. (B) Imagens representativas de úteros não decidualizados (ND) e decidualizados (D) de camundongos adultos jovens C57BL6/J. Barras da balança = 5 mm.(C) Comparação da relação peso uterino/peso corporal (UW:PC) em animais não decidualizados e decidualizados. Os dados são médios ± MEV; teste de Mann-Whitney, **p = 0,003; ND: n = 3, D: n = 15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Método de administração hormonal Pontos fortes Fraquezas
Injeções subcutâneas Nenhuma intervenção cirúrgica necessária Manuseio diário repetido
Técnica acessível que não requer treinamento cirúrgico (em comparação com o implante de pellets) Os hormônios presentes no óleo podem vazar para fora do local da injeção, portanto, a quantidade absorvida por cada animal pode variar
Pellets de liberação lenta Sem necessidade de manuseio diário Procedimento cirúrgico necessário
Pode ser feito em casa Não disponível comercialmente
Alternativa acessível às mini bombas osmóticas
Pequeno e muito bem tolerado pelos animais
Minibombas osmóticas Sem necessidade de manuseio diário Procedimento cirúrgico necessário
Disponível comercialmente Caro
Método de entrega mais preciso Muito maior do que os pellets de liberação lenta

Tabela 1: Pontos fortes e fracos dos métodos de administração hormonal.

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Discussion

Este artigo fornece instruções passo a passo sobre como realizar OVX e fornecer hormônios exógenos para estudos focados na compreensão das contribuições uterinas para a gravidez e fertilidade. Dois protocolos detalhados são fornecidos sobre duas aplicações experimentais desses métodos, incluindo a realização de transferência de embriões e indução de decidualização artificial.

Embora a realização da OVX possa ser um desafio inicial - especialmente para pesquisadores iniciantes em modelos de roedores - é um procedimento relativamente simples, uma vez adequadamente treinado e praticado. As principais etapas dos procedimentos incluem monitorar de perto os animais enquanto eles estão sob anestesia e garantir que não haja tecido ovariano deixado para trás. Em alguns modelos, o oviduto pode ser deixado intacto. Entretanto, deve-se ressaltar que o oviduto é um tecido responsivo a hormônios com abundantes receptores de estrógeno e progesterona19. O protocolo cirúrgico para remoção do ovário e oviduto é muito mais simples em comparação com a remoção apenas do ovário, pois o primeiro pode ser completado a olho nu. Para remover apenas o ovário e deixar o oviduto no lugar neste último caso, um microscópio dissecante é necessário, pois este é um procedimento muito mais intrincado. Consequentemente, o tempo operatório pode ser prolongado, pois o animal precisa ser deslocado entre a etapa do microscópio dissecante e o campo operatório para diferentes partes do procedimento, como a sutura da parede interna do corpo.

Os protocolos analgésicos detalhados aqui são padrão e aprovados pelo comitê de ética animal da Monash University, portanto, podem variar dependendo dos requisitos ou preferências do comitê de ética de cada instituição. Ressalta-se que não foi prevista analgesia para o procedimento de decidualização artificial, pois os anti-inflamatórios não hormonais típicos interferem no processo de decidualização. Se os pesquisadores desejam fornecer analgésicos no momento da decidualização artificial, isso deve ser levado em consideração.

Este trabalho apresenta três métodos de liberação hormonal para suplementação de hormônios ovarianos após a OVX, e cada método tem seus próprios pontos fortes e fracos (Tabela 1). Injeções subcutâneas de hormônios em óleo são comuns na literatura14,16,17. Esta técnica tem muitos pontos fortes, incluindo o fato de que nenhum procedimento cirúrgico é necessário e, portanto, nenhum treinamento formal em cirurgia de roedores ou anestesia com gás é necessário. Isso torna a injeção subcutânea uma opção acessível para quase todos os grupos de pesquisa. As injeções também são acessíveis e fáceis de realizar. Na prática, no entanto, apresentam algumas limitações, principalmente em modelos de gravidez. Para manter a gravidez em um animal OVX, a suplementação hormonal com progesterona deve ser administrada diariamente para apoiar a gravidez. Pode ser possível interromper as injeções diárias quando a placenta estiver suficientemente desenvolvida para assumir como principal fonte de progesterona, embora isso não tenha sido testado nos protocolos aqui apresentados. Curiosamente, é possível que os hormônios no óleo vazem do local da injeção após a injeção subcutânea. Em parte, isso pode ser devido ao tamanho da agulha necessário (26 G) para dispensar facilmente algo tão viscoso quanto o óleo de gergelim. Portanto, esse vazamento precisa ser monitorado e registrado ao realizar injeções em óleo, a fim de correlacioná-lo com os resultados experimentais.

Os pellets de liberação lenta são preferíveis às injeções subcutâneas, pois são econômicos e simples de fazer internamente. No entanto, eles exigem várias etapas durante a noite, que devem ser consideradas ao planejar cronogramas experimentais. Esses pellets secretam aproximadamente 500 μg diariamente (conforme avaliado durante um curso de tempo de incubação em meio de cultura celular e subsequente ELISA de progesterona). Deve-se notar que esta é uma concentração mais baixa em comparação com as injeções subcutâneas diárias descritas acima, e isso se deve à consistência na entrega de progesterona do pellet. Como mencionado anteriormente, as injeções de óleo podem vazar para fora do local de injeção, reduzindo assim a concentração total administrada. Em estudos anteriores, esses pellets só foram ativos in vivo por até 10 dias após serem inseridos cirurgicamente. Portanto, em estudos de gravidez, ainda não está claro se pode ser necessário inserir uma segunda pelota no meio da gestação ou se a placenta poderia fornecer suporte endócrino suficiente para a gravidez nessa fase. Esses pellets são, portanto, ideais para modelos de prenhez de curta duração, incluindo o protocolo de decidualização artificial aqui apresentado, bem como estudos de gestação até 10 dias pós-transferência embrionária. Enquanto os pellets de liberação lenta negam a necessidade de manuseio diário de animais e injeções, algumas injeções de estrogênio de baixa dose ainda são necessárias para equilibrar o ciclo de feedback do receptor de progesterona. Essa estratégia já foi utilizadaanteriormente 20,21.

Por fim, as minibombas osmóticas são o método de entrega hormonal mais preciso e estão disponíveis comercialmente, mas são a opção mais cara. As minibombas osmóticas podem fornecer uma concentração definida de hormônio diariamente por até 28 dias, dependendo do modelo selecionado. Semelhante aos pellets de liberação lenta, enquanto as minibombas osmóticas evitam a necessidade de manuseio diário dos animais, algumas injeções de estrogênio em baixas doses ainda são necessárias.

O protocolo de decidualização artificial aqui descrito permite o estudo de um marco gestacional precoce independente da influência ovariana e embrionária. Enquanto os seres humanos sofrem decidualização a cada ciclo menstrual, os roedores só decidualizam durante o estabelecimento da gravidez. Assim, este modelo tem imenso valor para estudar marcos de gravidez semelhantes aos humanos em um modelo de roedor manipulável. O procedimento aqui detalhado é relativamente não invasivo, pois usa um dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico (NSET) para entregar óleo de gergelim diretamente ao corno uterino através da vagina e do colo do útero. Embora esse procedimento seja menos invasivo do que outras metodologias, pode se tornar bastante caro quando se utilizam NSETs comerciais. Em comparação, outros modelos publicados de decidualização artificial requerem um procedimento cirúrgico para realizar injeções intrauterinas de óleo17. Isso requer uma configuração cirúrgica semelhante à descrita na seção 1 e nas etapas 2.1-2.11. No entanto, em animais que foram ovariectomizados previamente, pode ser mais difícil identificar e expor o corno uterino. Também pode haver aderências formadas a partir do procedimento cirúrgico prévio para ooforectomia. Assim, embora possa ser mais custo-efetivo realizar injeções cirúrgicas intrauterinas para induzir a decidualização, o tempo cirúrgico e anestésico é substancialmente maior do que a alternativa de uso de NSETs. Existem protocolos estabelecidos para alternativas fabricadas internamente22 aos NSETs disponíveis comercialmente, que são muito mais econômicos.

Embora o procedimento de transferência de embriões seja descrito aqui, publicamos anteriormente este modelo e suas taxas de sucesso em diferentes linhagens de camundongos14. Além disso, embora o método de transferência de embriões aqui descrito utilize uma abordagem cirúrgica, os NSETs também poderiam ser integrados a esse procedimento.

Direções futuras nessa área devem incluir estudos focados nas contribuições uterinas específicas para o estabelecimento e manutenção da gravidez. Esse conhecimento é fundamental para aprofundar nossa compreensão da infertilidade idiopática, falha de implantação e complicações na gravidez. Ampliar nosso conhecimento nessas áreas também é fundamental para melhorar os resultados clínicos de pacientes com FIV/ICSI, bem como nossa compreensão da gravidez como um processo biológico.

Em conclusão, a OVX é um procedimento simples que pode ser integrado em modelos animais para estudar as contribuições uterinas para a gravidez e fertilidade. No futuro, os modelos se beneficiarão da integração da OVX e da entrega de hormônios exógenos, de modo que possam ser feitas comparações entre contribuições específicas do ovário e do útero para a fertilidade e a gravidez.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros ou outros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi possível através do Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado Vitoriano e do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Governo Australiano (NHMRC) IRIISS. Este trabalho foi apoiado pela Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) para acessar a Monash Reproductive Services Platform. A A.L.W. é apoiada pelo financiamento DECRA DE21010037 do Australian Research Council (ARC). J.N.H. e L.R.A. são apoiados por uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano. A L.R.A. é apoiada por uma Bolsa de Excelência de Pós-Graduação Monash. K.J.H. é apoiado por uma ARC Future Fellowship FT190100265.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

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References

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Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado
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Griffiths, M. J., Higgins, J. N.,… More

Griffiths, M. J., Higgins, J. N., Cousins, F. L., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model. J. Vis. Exp. (194), e64763, doi:10.3791/64763 (2023).

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