Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Metoder för att studera livmoderbidrag till graviditetsetablering i en ovariektomiserad musmodell

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Graviditetsetablering är en dynamisk process som involverar komplexa embryon och livmoderöverhörning. De exakta bidragen från moderns livmodermiljö till dessa processer är fortfarande ett aktivt undersökningsområde. Här tillhandahålls detaljerade protokoll för att hjälpa till att utforma in vivo-djurmodeller för att ta itu med dessa forskningsfrågor.

Abstract

För att graviditet ska kunna fastställas måste en livskraftig blastocyst framgångsrikt interagera med en mottaglig livmoderfoder (endometrium) för att underlätta implantation och placentabildning och möjliggöra pågående graviditet. Begränsningarna för graviditetsframgång orsakad av embryonala defekter är välkända och har till stor del övervunnits under de senaste decennierna med ökningen av in vitro-fertilisering (IVF) och assisterad reproduktionsteknik. Hittills har fältet dock inte övervunnit de begränsningar som orsakas av ett otillräckligt mottagligt endometrium, vilket resulterar i stagnerande IVF-framgångsnivåer. Äggstocks- och endometriefunktioner är nära sammanflätade, eftersom hormoner som produceras av äggstocken är ansvariga för endometriums menstruationscyklicitet. Som sådan, när man använder gnagarmodeller av graviditet, kan det vara svårt att fastställa om ett observerat resultat beror på ett äggstocks- eller livmoderunderskott. För att övervinna detta utvecklades en ovariektomiserad musmodell med embryoöverföring eller artificiell decidualisering för att möjliggöra studier av livmoderspecifika bidrag till graviditet. Denna artikel kommer att ge instruktioner om hur man utför ovariektomi och erbjuda insikter i olika tekniker för att leverera exogena hormoner för att stödja framgångsrik artificiell decidualisering eller graviditet efter embryoöverföring från friska givare. Dessa tekniker inkluderar subkutan injektion, pellets med långsam frisättning och osmotiska minipumpar. De viktigaste fördelarna och nackdelarna med varje metod kommer att diskuteras, vilket gör det möjligt för forskare att välja den bästa studiedesignen för sin specifika forskningsfråga.

Introduction

Med den ökande användningen av assisterad reproduktionsteknik under de senaste decennierna har många hinder för befruktning övervunnits, vilket gör att många par kan starta familjer trots fertilitetsproblem1. Oocyt- eller spermieunderskott kan ofta kringgås med hjälp av in vitro-fertilisering eller intracytoplasmatisk spermieinjektion; Emellertid förblir problem relaterade till livmodern och endometriell mottaglighet en svårfångad "svart låda" av reproduktiv potential2.

Graviditet är etablerad när ett högkvalitativt embryo framgångsrikt interagerar med ett mottagligt endometrium (livmoderfoder). Chanserna för framgångsrik graviditet i en given menstruationscykel är låga, cirka 30%3,4. Av de som är framgångsrika avancerar endast 50% -60% förbi 20 veckors graviditet, med implantationsfel som ansvarar för 75% av graviditeterna som inte når 20 veckor3. Trots dessa siffror som går tillbaka till slutet av 1990-talet har fältet ännu inte övervunnit de begränsningar som orsakas av ett otillräckligt mottagligt endometrium. Detta har resulterat i stagnerande - och ibland minskande - IVF-framgångsgrader de senaste åren 5,6.

Kvinnor med oförklarlig infertilitet har ofta ett förskjutet fönster av mottaglighet eller kan inte uppnå mottaglighet av okända skäl. Nyligen utvecklades endometrial receptivity array, som bedömer uttrycket av hundratals gener i syfte att skräddarsy tidpunkten för embryoöverföring till en individs mottaglighetsfönster 7,8,9. Fältet saknar emellertid fortfarande förståelse för patogenesen av graviditetskomplikationer som manifesterar sig efter implantationsprocessen är klar.

Det kvinnliga reproduktionssystemet är mycket dynamiskt och under strikt hormonell kontroll. Den hypotalamus-hypofys-gonadala (HPG) axeln styr frisättningen av luteiniserande hormon och follikelstimulerande hormon, som reglerar aspekter av äggstockscykeln, inklusive follikelmognad och östrogen- och progesteronaktivitet. I sin tur regleras livmodermenstruationscykeln av östrogener och progesteron10,11. Således är studier av livmoderbiologiska mekanismer komplicerade av ovariepåverkan. När man till exempel studerar hur cancerbehandlingar kan påverka livmodern kan det vara svårt att skilja om någon livmoderfenotyp som observerats (såsom graviditetsförlust eller menstruell acyklicitet) är resultatet av en direkt förolämpning mot livmodern eller en följdeffekt från skador på äggstockarna.

För att fullständigt förstå fertiliteten måste livmoderbidragen till graviditeten karakteriseras. Det är viktigt att denna förståelse sträcker sig bortom livmoderfunktionen under äggstockskontroll. Detta kan inte studeras hos människor; Därför används ofta djurmodeller. Som sådan används ovariektomi (OVX) ofta för att göra det möjligt för forskare att reglera gnagarestrous cykler (analogt med menstruationscykeln) genom att leverera hormoner exogent. Dessutom tillåter OVX att livmodersvar studeras oberoende av ovariepåverkan12. Men om hormoner inte omedelbart levereras efter OVX, kommer en klimakteriet fenotyp att inträffa, vilket måste noggrant övervägas av forskarna.

OVX används ofta i gnagarmodellerna 13,14,15,16,17 och är relativt lätt att utföra efter adekvat träning. Metoderna varierar beroende på om äggstocken ensam eller äggstocken och äggledaren avlägsnas, liksom beroende på djurets ålder (vuxna, cyklande djur har större äggstockar med ett synligt corpus luteum på ytan, vilket innebär att deras äggstockar är lättare att visualisera). På samma sätt finns många metoder för hormontillskott, inklusive subkutana injektioner14, pellets med långsam frisättning15, osmotiska minipumpar18 och äggstockstransplantation.

I denna artikel, detaljerade instruktioner ges om hur man utför ovariektomi och förbereda tre typer av hormontillskott, inklusive subkutan injektioner, långsam frisättning pellets, och osmotiska minipumpar. Två detaljerade protokoll tillhandahålls för experimentella slutpunkter som drar nytta av OVX följt av exogent hormontillskott (embryoöverföring och artificiell decidualisering). Denna artikel diskuterar styrkor och svagheter i varje tillvägagångssätt med målet att vägleda forskare om hur man utför studier för att isolera effekterna på livmodern, särskilt inom graviditets- och fertilitetsforskningsområdena.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur var inrymda i temperaturkontrollerade, höga barriäranläggningar (Monash University Animal Research Laboratory) med gratis tillgång till mat och vatten och en 12 timmars ljus-mörk cykel. Alla procedurer utfördes i enlighet med godkännande från Monash Animal Research Platform Ethics Committee (#21908, 17971) och utfördes i enlighet med National Health and Medical Research Council Code of Practice för vård och användning av djur.

1. Kirurgisk förberedelse

  1. Autoklav alla kirurgiska instrument, gasväv och pappershanddukar som krävs för procedurerna på en hård/torr godscykel vid 121 °C med en hålltid på 30 min och en torktid på 30 minuter.
  2. Lägg ut en steril bänkplatta för den kirurgiska arbetsytan och förbered smärtstillande medel.
    1. Späd karprofen i steril saltlösning till 1 mg/ml och späd bupivakain i steril saltlösning till en 0,5 % (vikt/volym) lösning.
    2. Tillsätt 3,5 ml meloxikam till en 400 ml burvattenflaska.
  3. Förvärm värmedynan/värmedynorna för återhämtningsburarna och sätt upp värmelampor för att rikta indirekt ljus på de återställande djuren.
  4. Se till att all lämplig personlig skyddsutrustning bärs, inklusive hårnät, ansiktsmask, klänning och handskar.
  5. Öva god steril teknik, inklusive att regelbundet spraya handskarna med etanol och låta dem avdunsta innan du hanterar djuret eller kirurgiska verktyg för att undvika etanolkontaminering.

2. Utföra ovariektomi

  1. Använd en gasanestesimaskin med isofluran och förfyll induktionsboxen i 3-5 min vid 5% isofluran med flödeshastigheten inställd på 4 L/min.
  2. Placera musen inuti induktionsboxen och, när den är medvetslös, flytta den till noskonen och minska flödeshastigheten till 0,4 l/min, med isofluranförångaren inställd på ~2,5%.
    OBS: Procentandelen isofluran som används under resten av proceduren varierar beroende på musstam, ålder och exponering för behandlingar (t.ex. kemoterapi) och bör justeras baserat på en noggrann bedömning av varje enskilt djurs andningsmönster. Andningsmönster bör förbli som vanliga bukandetag. Snabba, bröstkorgsandetag kan indikera att ett djupt kirurgiskt plan inte har uppnåtts eller upprätthållits; Justera i så fall procentandelen isofluranförångare efter behov.
  3. Applicera ögonsmörjmedel generöst genom att klämma på tuben och badda försiktigt ögat.
  4. Raka ett litet (2 cm x 2 cm) område vid och under ryggraden.
  5. Administrera 5 mg/kg karprofen från en utspädd lösning av 1 mg/ml subkutant vid halsen.
  6. Testa anestesidjupet med tåklämningsreflexen genom att klämma musens baktå. Om det inte finns någon tånypreaktion, är djuret i det djupa kirurgiska planet, och proceduren kan fortsätta.
  7. Applicera betadin på det kirurgiska området och täck med ett kirurgiskt draperi (en gasbindning med ett 2 cm x 2 cm fönster utskuret).
  8. Använd råtttandad pincett, dra huden vid ryggens aning uppåt och gör ett ~ 5 mm längsgående snitt.
    OBS: Ett hudsnitt på denna höjd på djurets rygg är bäst för kirurgisk klippplacering för att minska risken för att djuret tar bort klämmorna och kräver klippreparationer.
  9. Använd trubbiga pincett, fortsätt att trubba dissekera huden bort från det underliggande muskelskiktet, flytta ner och åt sidan mot njuren.
  10. Identifiera njure, äggstock, och äggstockar fettkudde visuellt genom muskelväggen.
    OBS: Njuren kommer att visas en mörkröd färg, fettkudden kommer att se ljusvit ut, och om den är synlig kommer äggstocken att se ut som en liten rosa prick i fettkudden.
  11. Använd pincett, ta tag i och lyft muskelskiktet. Gör ett snitt på ~ 0,5-1 cm med vass kirurgisk sax. Fortsätt att hålla muskelväggen med pincett och byt från sax till trubbig pincett för att dra äggstocksfettkudden genom snittet.
  12. Använd en böjd nålhållare och kläm fast under äggstocken och äggledaren vid livmoderhornets distala ände.
    OBS: Alternativt kan äggstocken ensam avlägsnas och lämna äggledaren intakt. Ett dissekeringsmikroskop krävs emellertid för att exakt visualisera skillnaden mellan äggstocken och äggledaren.
  13. Ta bort äggstocken med sax eller skalpell. Fortsätt att klämma i 30 s för att undvika överdriven blödning.
  14. Ta bort klämman och badda den med steril gasväv om det behövs.
  15. För att stänga muskelväggssnittet, använd pincett för att lyfta toppen av snittet så att snittet naturligt drar ihop.
  16. Använd silkesuturer (storlek 3-0) för att stänga muskelväggsnittet med en kirurgknut.
  17. Applicera två till tre droppar bupivakain lokalt med en 1 ml spruta utan nål fastsatt, och upprepa steg 2.9-2.17 på andra sidan.
  18. För att stänga hudsnittet, använd gasväv för att badda området torrt av överskott av bupivakain och tryck ihop de två sidorna av huden.
  19. Applicera en till två 7 mm kirurgiska klämmor, vilket ger utrymme för svullnad som en del av läkningsprocessen.
  20. Flytta musen till en återhämtningsbur och övervaka noga i 15 minuter.
    OBS: Djuren ska vakna snabbt; Var noga med att övervaka andningen noga för normala bröstkorgsandningsmönster.

3. Hormonberedning: Subkutan injektion

  1. Gör en 1 mg/ml stamlösning av östradiol.
    1. Väg upp 0,001 g (1 mg) östradiolpulver i ett 1,5 ml sterilt rör.
    2. Tillsätt 1 ml 100% etanol till röret och virvel i några sekunder.
      OBS: Etanolen kommer att förbli klar med synliga fläckar av östradiolpulver.
    3. Vik röret med film för att förhindra etanolavdunstning.
    4. Vik röret i aluminiumfolie och placera det på en vippa över natten för att helt lösa upp östradiolpulvret.
    5. Späd denna 1 mg/ml buljong i sesamolja till önskad slutkoncentration.
      OBS: Doser på 100 ng i 3 dagar krävs för priming före artificiell decidualisering, och ytterligare låga doser på 25 ng krävs när progesteron ges. Detta för att bekämpa återkopplingsslingan som styr progesteronreceptoruttrycket. För embryoöverföring krävs två doser på 100 ng på dag 1 och dag 3 före embryoöverföring på dag 4. Vid tidpunkten för embryoöverföring krävs också en låg dos på 25 ng.
    6. Dra upp den erforderliga mängden östradiol i olja i en 1 ml spruta och fäst sedan en 26 G nålspets.
    7. Injicera lämplig dos subkutant (antingen vid skrubben eller flanken; 100 ng/100 μl eller 25 ng/100 μl för grundning före embryoöverföring eller artificiell decidualisering eller vid tidpunkten för embryoöverföring) med erforderlig frekvens.
      OBS: Olja är mycket viskös, så var noga med att injicera långsamt och pausa i några sekunder innan du tar bort nålen. Detta minimerar mängden olja som läcker ut från injektionsstället.
  2. Gör en 200 mg/ml stamlösning av progesteron.
    1. Väg upp 0,4 g (400 mg) progesteronpulver i ett 5 ml sterilt rör.
    2. Tillsätt 2 ml 100% etanol till röret och virvel i några sekunder.
      OBS: Etanolen blir vit i färgen.
    3. Upprepa steg 3.1.3-3.1.4.
    4. Späd 200 mg/ml i sesamolja till önskad slutkoncentration.
      OBS: Doser på 2 mg dagligen krävs för att stödja embryoöverföring.
    5. Injicera lämplig dos (t.ex. 2 mg/100 μl dagligen som stöd för graviditet) subkutant som i steg 3.1.6-3.1.7.

4. Hormonberedning: Pellets med långsam frisättning

  1. Lägg en folie över ytan på en laminär flödes- eller klass II-biosäkerhetshuv.
  2. Placera all utrustning (handskar, petriskålar, 1 ml sprutor, fina pincett) i huven och slå på UV i 20 minuter.
    OBS: Slå inte på UV-vätskan med tätningsmedlet inuti huven eftersom det kommer att stelna.
  3. Tvätta silastslangen i 100% etanol och låt den lufttorka i huven. När det är torrt, markera ~ 1 cm längder längs slangen och skär med en skalpell.
  4. Ta bort kolven från en spruta och tryck in ~200 μL tätningsmedel. Sätt tillbaka kolven och tryck ut en liten mängd tätningsmedel ur sprutan.
  5. Applicera en liten mängd tätningsmedel i ena änden av slangen och släta över den med ett handskfinger.
  6. Låt torka över natten eller i 20-30 min i UV-ljus inuti huven.
  7. Häll en lämplig mängd progesteron i en steriliserad petriskål. Använd pincett, skopa pellets i progesteronpulvret för att fylla pelleten.
    1. Knacka på den förseglade änden av pelleten på huvens yta för att kondensera progesteron ner. Alternativt, använd änden av steriliserade pincett för att fylla progesteron ner. Ge tillräckligt med utrymme för mer tätningsmedel.
  8. Försegla den öppna änden med tätningsmedel enligt beskrivningen i steg 3.4–3.5.
  9. Slå in petriskålen som innehåller progesteronpellets i folie för att skydda den från ljus.
  10. Aktivera pelletsen i minst 72 timmar före subkutan insättning genom inkubering i 1 % kolstrippad FCS (cs-FCS: PBS) vid 37 °C.
    OBS: Pellets kan tillverkas i bulk med en enda förseglad ände i förväg. Färskt progesteron bör dock användas för att fylla dem varje gång. Se till att de färdiga pelletsen är UV-steriliserade innan de fylls med progesteron. Pelletsen utsöndrar ~ 500 μg / dag i 6-10 dagar, vilket är tillräckligt stöd för artificiell decidualisering och embryoöverföringsprocedurer, även om en ytterligare lågdos östrogeninjektion kan krävas för att upprätthålla progesteronreceptoraktivitet utöver 4-5 dagar. Efter 10 dagar kan en ersättningsprogesteronpellet krävas.

5. Hormonberedning: Osmotiska minipumpar

  1. Bered progesteron i önskad koncentration i en vattenlösning och välj lämplig mini osmotisk pumpmodell (se Materialförteckning).
    OBS: För avsnitt 7 (experimentellt förfarande: embryoöverföring) krävs leverans av 2 mg / dag i 12 dagar. Lös därför 28 mg progesteron i ~ 100 μL sterilt vatten per djur (följ tillverkarens instruktioner för den specifika volymen). Serieutspädningar kan krävas. För avsnitt 8 (experimentellt förfarande: artificiell decidualisering) krävs leverans av 500 μg per dag i 3 dagar. Lös därför 1 500 μg progesteron i ~100 μl sterilt vatten per djur. Förbered extra lösning för att ta hänsyn till den volym som förlorats under påfyllningsproceduren.
  2. Ställ in utrustningen (handskar, våtservetter med låg ludd, petriskålar, steril saltlösning, 1 ml sprutor, små vägbåtar, folie och vågar med en noggrannhet på 0,01 g) i en klass II biosäkerhetshuv och slå sedan på UV i 20 minuter.
  3. Dra upp hormonlösningen i en 1 ml spruta och fäst sedan ett sterilt påfyllningsrör, se till att det inte finns några luftbubblor.
  4. Väg pumpen och dess flödesmoderator i en steril vågbåt.
  5. För in påfyllningsröret genom öppningen högst upp på pumpen tills det inte kan gå längre.
  6. Håll pumpen upprätt och tryck långsamt sprutkolven för att fylla röret.
    OBS: Snabb fyllning bör undvikas eftersom detta kan införa luftbubblor i pumpen.
  7. När lösningen flyter över från toppen av pumpen, ta försiktigt bort påfyllningsröret och torka av överflödig lösning med en steril lågluddservett.
  8. För in flödesmoderatorn genom öppningen högst upp på pumpen tills den inte kan gå längre. När du är helt in, tryck ihop pumpen och flödesmoderatorn ordentligt.
  9. Väg den fyllda pumpen med flödesmoderatorn på plats.
    OBS: Viktskillnaden som erhålls från steg 5.3 och steg 5.8 ger nettovikten för den laddade lösningen (dvs. en ökning på 0,1 g = 100 μL tillsatt lösning).
  10. Placera den fyllda pumpen i en steril petriskål fylld med steril saltlösning.
  11. När alla pumpar är fyllda, linda in petriskålen i folie och placera den i en 37 ° C inkubator för att grunda i minst 4-6 timmar (eller tills den är klar för användning).

6. Kirurgiskt ingrepp: Införande av subkutana hormonpellets och minipumpar

  1. Förbered området enligt avsnitt 1 (kirurgisk beredning).
  2. Bedöva djuren enligt steg 2.1-2.3.
  3. Raka ett litet område vid nacken (~1 cm x 1 cm).
  4. Administrera 5 mg/kg karprofen från en utspädd lösning av 1 mg/ml subkutant i benslakan.
  5. Test för tåklämreflexen. Om det inte finns någon reflex är djuret i det djupa kirurgiska planet, och proceduren kan börja.
  6. Applicera betadin på det kirurgiska området och täck det med ett kirurgiskt draperi (en gasbindning med ett 2 cm x 2 cm fönster utskuret).
  7. Använd råtttandad pincett och dra huden vid nacken (halvvägs mellan den sanna skrubben och ryggen) uppåt och gör ett ~ 5 mm längsgående snitt.
  8. Använd trubbiga pincett, dissekera huden bort från det underliggande muskelskiktet i nedåtgående riktning.
    OBS: För osmotisk minipumpinsättning, skapa en ficka längs ena sidan av djuret så att pumpen inte begränsar djurets rörelse eller trycker upp mot snittplatsen.
  9. När tillräckligt med utrymme har gjorts för hormonpelleten eller minipumpen, använd sterila pincett för att plocka upp pelleten eller minipumpen och sätt in den i den subkutana fickan med trubbig dissektion.
  10. För att stänga hudsnittet, se till att pelletsen eller minipumpen är tillräckligt långt i fickan så att kirurgiska klämmor inte skadar den.
  11. Applicera bupivakain lokalt enligt steg 2.17.
  12. Stäng såret med ett kirurgiskt klämma. Flytta musen till en återhämtningsbur och övervaka noga i 15 minuter. Eftersom detta är ett kort förfarande bör djuren vara ambulerande inom några minuter.

7. Experimentellt förfarande: Överföring av embryon

  1. För ovariektomerade djur, hormon-prime 3 dagar före embryoöverföring genom en subkutan injektion av 100 ng/100 μL estradiol (steg 3.1).
  2. En dag före embryoöverföringen hormonprimar djuren med en subkutan injektion av 2 mg/100 μl medroxiprogesteronacetat (steg 3.2).
  3. Förbered området enligt avsnitt 1 (kirurgisk beredning).
  4. Bedöva djuren enligt steg 2.1-2.3.
  5. Börja proceduren enligt steg 2.4-2.10.
  6. Under ett dissekerande mikroskop, skapa en intrauterin injektionspunkt med en 26 G nålspets.
  7. Pipettera fem blastocyster till en M2-mediadroppe och överför sedan dessa till livmoderhornet.
  8. För att stänga muskelväggsnittet, lyft toppen av snittet med pincett så att snittet naturligt drar ihop.
  9. Använd silkesuturer och stäng muskelväggplatsen med en kirurgknut. Applicera droppar bupivakain lokalt.
  10. Upprepa steg 7.5-7.8 på andra sidan.
  11. För att stänga hudsnittet, använd gasväv för att badda området torrt av överskott av bupivakain och tryck ihop de två sidorna av huden.
  12. Applicera en till två kirurgiska klämmor, vilket ger utrymme för svullnad som en del av läkningsprocessen.
    OBS: Om djuren är ovariektomerade krävs exogena hormoner vid tidpunkten för embryoöverföring. Injicera antingen progesteron subkutant (2 mg) eller sätt in en subkutan progesteronpellet eller osmotisk minipump. För att bekämpa överskott av progesteron krävs en subkutan injektion av lågdos (25 ng / 100 μL) östrogen vid tidpunkten för embryoöverföring.
  13. Bär försiktigt musen till en återhämtningsbur och övervaka noga i 15 minuter.
    OBS: Djuren ska vakna snabbt; Var noga med att övervaka andningen noga för normala bröstkorgsandningsmönster.

8. Experimentellt förfarande: Artificiell decidualisering

  1. Hormonprima djuren med 100 ng/100 μL estradiol dag 1, dag 2 och dag 3, enligt avsnitt 3 (hormonpreparat: subkutan injektion) 8 dagar före artificiell decidualisering.
  2. Hormonprima djuren med 5 ng/100 μL östradiol dag 7, dag 8 och dag 9, enligt avsnitt 3 (hormonpreparat: subkutan injektion) 2 dagar före artificiell decidualisering.
    OBS: Den slutliga injektionen måste ske minst 3 timmar (och högst 4 timmar) före den artificiella decidualiseringsproceduren.
  3. Hormonprima djur med en subkutan progesteronpellet eller mini osmotisk pump (500 μg/dag), enligt avsnitt 4, avsnitt 5 och avsnitt 8, 2 dagar före artificiell decidualisering.
  4. Förbered området enligt avsnitt 1 (kirurgisk beredning).
  5. Bedöva djuren enligt steg 2.1-2.2.
  6. Testa anestesidjupet med tåklämningsreflexen. Om det inte finns någon tånypreaktion, är djuret i det djupa kirurgiska planet, och proceduren kan fortsätta.
  7. Placera musen i ett benäget läge, lyft svansen och sätt långsamt in ett spekulum med en diameter på 6 mm i slidan.
  8. Medan djurets nos hålls i narkosnoskonen, placera djurets underkropp mellan den icke-dominanta handens första och andra finger. Använd tummen för att försiktigt trycka svansen uppåt för att hålla vaginalöppningen i sikte.
  9. Överför 20 μL sesamolja till ett livmoderhorn med hjälp av en icke-kirurgisk embryoöverföringsspets (fäst vid en 20 μL pipett).
    1. Håll pipetten i nivå med vaginalöppningen, sätt in spetsen i slidan och genom livmoderhalsen in i livmoderhornet. När spetsen är i livmoderhornet, tryck försiktigt spetsen mot endometrieytan (om du använder hanteringstekniken ovan kommer denna rörelse att kännas mot det andra fingret) och tryck långsamt ut oljan.
      OBS: Håll pipettkolven nedtryckt, vänta i 10 s för att säkerställa att all olja har skingrats och ta långsamt bort överföringsspetsen medan kolven hålls nedtryckt.
  10. Ta bort spekulum från slidan.
  11. För försiktigt musen till återhämtningsburen och övervaka noga i 15 minuter.
    OBS: Djuren ska vakna snabbt. Övervaka deras andning noga för normala bröstkorgsandningsmönster.
  12. Begränsa hanteringen av djuren och förvara dem i en lugn miljö i 96 timmar efter ingreppet.
    OBS: Höga ljud eller plötsliga förändringar i deras ljusa och mörka cykel kommer att påverka procedurens framgång. Vid tidpunkten för vävnadsdissektion kan omfattningen av decidualiseringsframgång mätas som ett förhållande mellan livmodervikt och kroppsvikt. Det artificiella decidualiseringsförfarandet har en framgångsgrad på 80%. Uteslut därför djur som inte decidualiseras och ta hänsyn till detta när du väljer provstorlekar för experimenten.

9. Kirurgiskt ingrepp: Postoperativ återhämtning, övervakning och klippreparationer

  1. Låt djuren återhämta sig halvt på, halvt av värmedynor över natten innan de återförs till sin hembur.
  2. Övervaka djuren dagligen i 5 dagar efter operationen, var noga med sårplatsen för tecken på infektion.
  3. Utför klippreparation om det behövs.
    1. Förbered området enligt avsnitt 1 (kirurgisk beredning).
    2. Bedöva djuren enligt steg 2.1-2.3.
    3. Ta bort det befintliga klippet med hjälp av en klippborttagare om klippet fortfarande finns.
    4. Applicera ett nytt kirurgiskt klämma enligt steg 2.19-2.21.
  4. Ta bort de kirurgiska klämmorna 7 dagar efter operationen enligt steg 9.3.1-9.3.3 eller när djuret är nästa under anestesi (t.ex. för en embryoöverföring, den artificiella decidualiseringsproceduren eller en subkutan injektion efter operation).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En väl karakteriserad modell av artificiell decidualisering beskrivs i detta protokollpapper (figur 1A). Här genomgick unga vuxna honmöss (8 veckor gamla) kirurgisk ovariektomi enligt beskrivningen i avsnitt 1 och avsnitt 2. Mössen vilades sedan i 2 veckor för att säkerställa att de endogena äggstockshormonerna försvann innan de stöddes med exogena hormoner enligt beskrivningen i avsnitt 3-7 och avsnitt 9. Artificiell decidualisering inducerades genom en intravaginal injektion av sesamolja, och sedan vilade djuren tills vävnadssamling, som beskrivs i avsnitt 9. I denna studie utfördes artificiell decidualisering i C57BL6/J-möss, en vanlig musstam. Vid tidpunkten för vävnadsinsamlingen registrerades kroppsvikten och livmodern dissekerades och trimmades väl innan den vägdes (figur 1B). Omfattningen av det decidala svaret registrerades genom att livmodervikten uttrycktes som ett förhållande mellan kroppsvikten. I denna studie decidualiserades 80% av C57BL6 / J-mössen (0,01012 ± 0,001515, n = 15), medan 20% av djurlivmodern inte decidualiserades (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Schematiska och representativa resultat . (A) Schematisk tidslinje för experimentellt inducerande artificiell decidualisering i en musmodell. Förkortningar: OVX = ovariektomi; E2 = östradiol (100 ng dagar 1-3, 5 ng dagar 7-9); P4 = progesteron. Obs: En P4-pellet användes för att generera de resultat som presenteras här. Alternativa metoder för progesteronleverans inkluderar dagliga subkutana injektioner och mini-osmotiska pumpar. (B) Representativa bilder av icke-decidualiserade (ND) och deciddualiserade (D) livmoder från unga vuxna C57BL6/J-möss. Skalstänger = 5 mm.(C) Jämförelse av förhållandet mellan livmodervikt och kroppsvikt (UW:BW) hos icke-decidualiserade och decidualiserade djur. Data är medelvärde ± SEM; Mann-Whitney-test, **p = 0,003; ND: n = 3, D: n = 15. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Hormon leveransmetod Styrkor Svagheter
Subkutana injektioner Inget kirurgiskt ingrepp krävs Upprepad daglig hantering
Tillgänglig teknik som inte kräver kirurgisk träning (jämfört med pelletsimplantation) Hormoner i olja kan läcka ut från injektionsstället, därför kan mängden som absorberas av varje djur variera
Pellets med långsam frisättning Inget behov av daglig hantering Kirurgiskt ingrepp krävs
Kan tillverkas i huset Inte kommersiellt tillgänglig
Prisvärt alternativ till osmotiska minipumpar
Små och mycket väl tolererade av djur
Osmotiska minipumpar Inget behov av daglig hantering Kirurgiskt ingrepp krävs
Kommersiellt tillgänglig Dyr
Mest exakta leveransmetod Mycket större än pellets med långsam frisättning

Tabell 1: Styrkor och svagheter i hormonleveransmetoderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna artikel ger steg-för-steg-instruktioner om hur man utför OVX och tillhandahåller exogena hormoner för studier som fokuserar på att förstå livmoderbidragen till graviditet och fertilitet. Två detaljerade protokoll tillhandahålls om två experimentella tillämpningar av dessa metoder, inklusive att utföra embryoöverföring och inducera decidualisering artificiellt.

Även om det kan vara utmanande att utföra OVX initialt - särskilt för forskare som är nya för gnagarmodeller - är det en relativt enkel procedur när den väl är lämpligt utbildad och praktiserad. De viktigaste stegen i förfarandena inkluderar noggrann övervakning av djuren medan de är under anestesi och se till att det inte finns någon äggstocksvävnad kvar. I vissa modeller kan ovidukten lämnas intakt. Det bör emellertid noteras att äggledaren är en hormonresponsiv vävnad med rikliga östrogen- och progesteronreceptorer19. Det kirurgiska protokollet för att ta bort äggstocken och äggledaren är mycket enklare jämfört med att bara ta bort äggstocken, eftersom den förra kan kompletteras med blotta ögat. För att bara ta bort äggstocken och lämna äggledaren på plats i det senare fallet krävs ett dissekeringsmikroskop, eftersom detta är ett mycket mer invecklat förfarande. Följaktligen kan driftstiden förlängas, eftersom djuret måste flyttas mellan dissekeringsmikroskopsteget och operationsfältet för olika delar av proceduren, såsom suturering av den inre kroppsväggen.

De smärtstillande protokollen som beskrivs här är standard och godkända av Monash University Animal Ethics Committee, så de kan variera beroende på den enskilda institutionens etiska kommittékrav eller preferenser. Det bör noteras att ingen analgesi tillhandahölls för det artificiella decidualiseringsförfarandet, eftersom typiska icke-steroida antiinflammatoriska medel stör decidualiseringsprocessen. Om forskare vill tillhandahålla smärtstillande medel vid tidpunkten för artificiell decidualisering, bör detta beaktas.

Detta arbete presenterar tre metoder för hormonleverans för att komplettera äggstockshormoner efter OVX, och varje metod har sina egna styrkor och svagheter (tabell 1). Subkutana injektioner av hormoner i olja är vanliga i litteraturen14,16,17. Denna teknik har många styrkor, inklusive det faktum att inget kirurgiskt ingrepp krävs, och därmed krävs ingen formell utbildning i gnagarkirurgi eller gasbedövning. Detta gör subkutan injektion till ett tillgängligt alternativ för nästan alla forskargrupper. Injektioner är också prisvärda och lätta att genomföra. I praktiken har de dock vissa begränsningar, särskilt i graviditetsmodeller. För att upprätthålla graviditeten hos ett OVX-djur måste hormontillskott med progesteron ges dagligen för att stödja graviditeten. Det kan vara möjligt att stoppa de dagliga injektionerna när moderkakan är tillräckligt utvecklad för att ta över som huvudkälla till progesteron, även om detta inte har prövats i de protokoll som presenteras här. Anekdotiskt är det möjligt för hormoner i olja att läcka från injektionsstället efter subkutan injektion. Delvis kan detta bero på den nålstorlek som krävs (26 G) för att enkelt dosera något så visköst som sesamolja. Därför måste detta läckage övervakas och registreras vid injektioner i olja för att korrelera detta med de experimentella resultaten.

Pellets med långsam frisättning är att föredra framför subkutana injektioner, eftersom de är kostnadseffektiva och enkla att göra internt. De kräver dock flera steg över natten, vilket bör beaktas vid planering av experimentella tidslinjer. Dessa pellets utsöndrar cirka 500 μg dagligen (enligt bedömning under en tidsförloppsinkubation i cellodlingsmedium och efterföljande progesteron ELISA). Det bör noteras att detta är en lägre koncentration jämfört med de dagliga subkutana injektionerna som beskrivits ovan, och detta beror på konsistensen vid leverans av progesteron från pelleten. Som tidigare nämnts kan oljeinjektioner läcka ut från injektionsstället, vilket minskar den totala koncentrationen som levereras. I tidigare studier har dessa pellets endast varit aktiva in vivo i upp till 10 dagar efter att de har satts in kirurgiskt. I graviditetsstudier är det därför fortfarande oklart om det kan vara nödvändigt att sätta in en andra pellet i mitten av dräktigheten eller om moderkakan i tillräcklig utsträckning kan ge endokrint stöd för graviditeten i det skedet. Dessa pellets är därför optimala för kortvariga graviditetsmodeller, inklusive det artificiella decidualiseringsprotokollet som presenteras här, samt graviditetsstudier upp till 10 dagar efter embryoöverföring. Medan pellets med långsam frisättning negerar behovet av daglig djurhantering och injektioner, krävs vissa lågdos östrogeninjektioner fortfarande för att balansera progesteronreceptorns återkopplingsslinga. Denna strategi har tidigare använts20,21.

Slutligen är osmotiska minipumpar den mest exakta hormonleveransmetoden och är kommersiellt tillgängliga, men de är det dyraste alternativet. Osmotiska minipumpar kan leverera en fast koncentration av hormon dagligen i upp till 28 dagar, beroende på vald modell. I likhet med pellets med långsam frisättning, medan osmotiska minipumpar undviker behovet av daglig djurhantering, krävs fortfarande vissa lågdos östrogeninjektioner.

Det artificiella decidualiseringsprotokollet som beskrivs här möjliggör studier av en tidig graviditetsmilstolpe oberoende av äggstocks- och embryonalt inflytande. Medan människor genomgår decidualisering med varje menstruationscykel, decidualiseras gnagare endast under graviditeten. Således har denna modell enormt värde för att studera mänskliga graviditetsmilstolpar i en manipulerbar gnagarmodell. Förfarandet som beskrivs här är relativt icke-invasivt, eftersom det använder en icke-kirurgisk embryoöverföringsanordning (NSET) för att leverera sesamolja direkt till livmoderhornet via slidan och livmoderhalsen. Även om denna procedur är mindre invasiv än andra metoder kan den bli ganska dyr när man använder kommersiella NSET. I jämförelse kräver andra publicerade modeller av artificiell decidualisering ett kirurgiskt ingrepp för att utföra intrauterina injektioner av olja17. Detta kräver en kirurgisk konfiguration liknande den som beskrivs i avsnitt 1 och steg 2.1-2.11. Men hos djur som har blivit ovariektomerade tidigare kan det vara mer utmanande att identifiera och exponera livmoderhornet. Det kan också finnas vidhäftningar bildade från det tidigare kirurgiska ingreppet för ovariektomi. Således, medan det kan vara mer kostnadseffektivt att utföra kirurgiska intrauterina injektioner för att inducera decidualisering, är kirurgisk och anestesitid betydligt längre än alternativet att använda NSET. Det finns etablerade protokoll för egentillverkade alternativ22 till kommersiellt tillgängliga NSET, som är mycket mer kostnadseffektiva.

Medan embryoöverföringsproceduren beskrivs här har vi tidigare publicerat denna modell och dess framgångsgrader över olika stammar av möss14. Även om den embryoöverföringsmetod som beskrivs här använder ett kirurgiskt tillvägagångssätt, skulle NSET också kunna integreras i denna procedur.

Framtida riktningar på detta område bör omfatta studier inriktade på de specifika livmoderbidragen till upprättandet och upprätthållandet av graviditeten. Denna kunskap är avgörande för att främja vår förståelse av idiopatisk infertilitet, implantationsfel och graviditetskomplikationer. Att utöka vår kunskap inom dessa områden är också grundläggande för att förbättra kliniska resultat för IVF / ICSI-patienter, liksom vår förståelse av graviditet som en biologisk process.

Sammanfattningsvis är OVX ett enkelt förfarande som kan integreras i djurmodeller för att studera livmoderns bidrag till graviditet och fertilitet. Modeller i framtiden kommer att dra nytta av att integrera OVX och exogen hormonleverans så att jämförelser kan göras mellan äggstocksspecifika och livmoderspecifika bidrag till fertilitet och graviditet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska eller andra intressen.

Acknowledgments

Detta arbete möjliggjordes genom Victorian State Government Operational Infrastructure Support och Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Detta arbete stöddes av Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant till A.L.W. (Winship-PAG18-0343) för att få tillgång till Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. stöds av DECRA-finansiering DE21010037 från Australian Research Council (ARC). J.N.H. och LRA stöds av ett stipendium från Australian Government Research Training Program. LRA stöds av ett Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. stöds av ett ARC Future Fellowship FT190100265.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Tags

Retraktion utgåva 194 fertilitet graviditet livmoder ovariektomi mottaglighet decidualisering
Metoder för att studera livmoderbidrag till graviditetsetablering i en ovariektomiserad musmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, M. J., Higgins, J. N.,… More

Griffiths, M. J., Higgins, J. N., Cousins, F. L., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model. J. Vis. Exp. (194), e64763, doi:10.3791/64763 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter