Summary
Быстрая релаксация миокарда и сердца необходима для нормальной физиологии. В настоящее время известно, что механизмы механической релаксации зависят от скорости деформации. В этом протоколе представлен обзор сбора и анализа экспериментов для дальнейшего изучения механического управления релаксацией.
Abstract
Диастолическая дисфункция является распространенным фенотипом в проявлениях сердечно-сосудистых заболеваний. В дополнение к повышенной сердечной жесткости (повышенное конечное диастолическое давление левого желудочка), нарушение сердечной релаксации является ключевым диагностическим показателем диастолической дисфункции. В то время как релаксация требует удаления цитозольного кальция и дезактивации саркомерных тонких нитей, нацеливание на такие механизмы еще не обеспечило эффективного лечения. Было высказано предположение, что механические механизмы, такие как кровяное давление (т.е. постнагрузка), изменяют релаксацию. Недавно мы показали, что изменение скорости деформации растяжения, а не постнагрузки, было необходимым и достаточным для изменения последующей скорости релаксации ткани миокарда. Зависимость скорости деформации релаксации, называемая механическим контролем релаксации (MCR), может быть оценена с использованием интактных сердечных трабекул. Этот протокол описывает подготовку модели мелкого животного, экспериментальной системы и камеры, изоляцию сердца и последующую изоляцию трабекулы, подготовку экспериментальной камеры, а также протоколы экспериментов и анализа. Данные о удлинении напряжений в неповрежденном сердце свидетельствуют о том, что MCR может предоставить новые арены для лучшей характеристики фармакологического лечения, а также метод оценки кинетики миофиламентов в интактных мышцах. Таким образом, изучение MCR может пролить свет на путь к новым подходам и новым рубежам в лечении сердечной недостаточности.
Introduction
Сердечная релаксация нарушается почти при всех формах сердечной недостаточности (включая сердечную недостаточность со сниженной фракцией выброса) и при многих сердечно-сосудистых заболеваниях. В дополнение к многочисленным методам оценки сердечной функции в пермеабилизированных мышцах, оценка интактных сердечных мышц вызывает все больший интерес. Такие ткани оцениваются как ненагруженные (концы могут свободно сокращаться) или нагруженные (контролируемая длина или сила). Исторически сложилось так, что интактные изолированные миоциты оценивались в ненагруженном состоянии, когда тело клетки может свободно укорачиваться во время сокращения. Интактные сердечные трабекулы часто оцениваются в изометрических условиях, когда длина не может изменяться, но создается напряжение (сила на площадь поперечного сечения). Как интактные миоцитарные, так и трабекульные методы начинают сближаться с модификациями нагрузки 1,2.
Протоколы нагрузочного зажима мышцы (т.е. контроля развивающегося напряжения мышцы при заданном значении, имитирующем физиологические постнагрузки) разрабатывались в течение нескольких десятилетий 3,4,5. В интактных сердечных тканях нагрузочные зажимы позволяют исследователям более точно имитировать сердечный цикл in vivo с использованием изотонических или виндкессельских постнагрузок 6,7,8,9. Целью этого протокола является получение данных, используемых для количественной оценки MCR (т.е. зависимости скорости деформации от скорости релаксации)8,9.
В то время как протокол MCR был адаптирован из предыдущей работы, основное внимание в этом протоколе (по сравнению с аналогичными протоколами, использующими интактные сердечные ткани) уделяется биомеханическим механизмам, которые модифицируют релаксацию. Существует несколько протоколов, использующих зажим нагрузки 3,4,5,7,10, и протоколы, ориентированные на модели Виндкесселя 1,2,11, но этот протокол конкретно описывает, как растяжение перед релаксацией изменяет скорость релаксации. Мы показали, что этот контроль происходит во время протодиастолического периода8, фазы, первоначально описанной Виггерсом12. В нормальных здоровых сердцах миокард подвергается удлиняющей нагрузке во время выброса до закрытия аортального клапана (т. е. до изоволюмиальной релаксации)13. Это имитируется продлением продолжительности контроля постнагрузки до тех пор, пока мышца не начнет растягиваться. Клинические данные свидетельствуют о том, что это удлинение может быть ослаблено или утрачено при болезненных состояниях14, а последствия и механизмы изменения скорости конечной систолической деформации не были полностью выяснены. Учитывая редкие варианты лечения диастолических заболеваний и сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса, мы предполагаем, что MCR может дать представление о новых механизмах, лежащих в основе нарушения релаксации.
В то время как грубое вскрытие, описанное здесь, фокусируется на грызунах, выделение трабекулы может быть выполнено из любого неповрежденного сердца и ранее использовалось с сердечной трабекулой8 человека. Аналогичным образом, сбор и анализ данных также могут быть применены к кардиомиоцитам или другим изолированным типам мышц 1,10. Обсуждение включает комментарии о возможных изменениях и адаптациях метода, а также ограничения, такие как предостережение против использования сосочковых мышц из-за механических свойств хорд9.
Protocol
Следующий протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Государственного университета Уэйна. Протокол описывает этапы использования экспериментальных субъектов на грызунах, но может быть адаптирован для использования в других модельных организмах.
1. Подготовка
- Получите испытуемого и дайте ему акклиматизироваться в лаборатории.
- Приготовьте 250 мл перфузионного раствора и 250 мл модифицированного раствора Тирода (таблица 1), насыщая кислородом каждый до 10-20 ppmO2 с pH 7,3.
- Подготовьте шприц объемом 5 мл с прикрепленной канюлей. Наполните шприц перфузионным раствором. Используйте канюли с весом 23 G для мыши и 18 или 16 G для маленькой или большой крысы соответственно. Наденьте полиэтиленовую трубку длиной 1 мм на конец затупленной иглы (Таблица материалов), чтобы предотвратить соскальзывание аорты с канюли после завязывания.
- Полная подготовка зоны вскрытия и канюляции (рис. 1)
- Наполните два чистых весовых контейнера перфузионным раствором не менее чем наполовину. Погрузите кончик канюли в перфузионный раствор по крайней мере с одним двойным швом, наложенным вокруг канюли. Удерживайте шприц на месте с помощью зажима.
- Поместите хирургические ножницы, гемостат, щипцы для радужной оболочки, пару маленьких изогнутых ножниц и два щипца #3 для легкого доступа.
- Подготовьте экспериментальную систему (рис. 2) путем грунтовки и циркуляции модифицированного раствора Тирода по всей экспериментальной системе. Убедитесь, что камера полностью заполнена и стабильна.
- Включите все блоки сбора данных, включая датчик силы, двигатель длины, систему стимуляции, систему контроля температуры и компьютер сбора данных.
- Скопируйте и переименуйте папку шаблона, содержащую необходимые файлы *.dap и указателей, чтобы ссылаться на текущий эксперимент. Откройте программное обеспечение для сбора данных.
- Подготовьте инструменты для изоляции трабекул (ножницы Vannas, щипцы #5 или #55, стеклянный зонд), погрузив их кончики в 10% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в сверхчистой воде или перфузионном растворе, чтобы покрыть металл белком (рис. 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся экспериментальная система должна быть подготовлена перед вскрытием.
2. Грубое вскрытие и канюляция
- Запишите идентификацию, массу тела и другую соответствующую информацию о животном.
- При желании можно ввести 1000 ЕД/кг гепарина в стерильном физиологическом растворе грызуну посредством внутрибрюшинной инъекции не менее чем за 10 минут до эвтаназии, чтобы свести к минимуму риск свертывания крови перед коронарной перфузией.
- Поместите животное в индукционную камеру и индуцируйте общую анестезию, используя 3-5% изофлурана, испаренного в 100% кислороде, в соответствии со стандартной процедурой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включите все внешние поглотители, вытяжные столы или вытяжные шкафы, используемые для минимизации воздействия изофлурана. - Как только грызун теряет рефлекс выпрямления и частота дыхания замедляется:
- (Для крысы) извлеките животное из индукционной камеры и поместите его лежа на спине на подушечке для вскрытия с продолжением анестезии через носовой конус.
- (Для мыши) выполняют шейный вывих сразу после извлечения животного из индукционной камеры. Носовой обтекатель не нужен. Включите испаритель изофлурана на 0%.
- При необходимости прикрепите верхние конечности грызуна к вдали от стенки грудной клетки с помощью ленты, поддерживаемой штифтами, стараясь не вонзиться в животное. Проверьте надлежащую глубину анестезии (отсутствие реакции на защемление пальцев ног), прежде чем приступать к рассечению.
- С помощью хирургических ножниц (Майо для крыс, Метценбаум для мышей), чуть ниже ксифоидного отростка, разрезают кожу поперечно по всей ширине брюшка грызуна в брюшное пространство.
- С помощью хирургических ножниц сделайте два вертикальных парасагиттальных надреза (вверх по бокам грудной стенки) как с левой, так и с правой стороны грудной стенки от поперечного разреза. Затем разрежьте поперек диафрагмы, соединив парасагиттальные разрезы и освободив грудное пространство.
- Зажмите и поднимите ксифоидный отросток с помощью гемостата к голове грызуна, чтобы переместить грудину и грудную стенку вверх к голове грызуна, обнажив грудное пространство и сердце. При необходимости быстро распространите парасагиттальные разрезы почти до второго позвоночного пространства, чтобы полностью обнажить сердце и/или сломать оболочку перикарда.
- Используя изогнутые щипцы радужной оболочки, осторожно приподнимите сердце, чтобы визуализировать большие сосуды. Поместите щипцы между миокардом и позвоночником грызуна, зажмите большие сосуды и поднимите сердце, стараясь не зажать предсердия или желудочковые сегменты.
- Слегка приподнимая сердце, быстро поместите изогнутые ножницы радужной оболочки (вогнутые вверх) между изогнутыми щипцами радужной оболочки и позвоночником грызуна и отрежьте крупные сосуды и легкие от сердца. Быстро переместите сердце в весовую лодку или стакан со свежим перфузионным раствором и встряхните, чтобы очистить сердце кровью.
- Поверните испаритель изофлурана на 0%, если это еще не сделано. Если большие сегменты легких, перикарда или других тканей остаются прикрепленными к сердцу, аккуратно отрежьте и выбросьте их в это время, чтобы свести к минимуму вмешательство в канюляцию.
- Используя изогнутые щипцы радужной оболочки, переместите сердце в чистую весовую лодку или стакан с погруженной в воду подготовленной канюлей. Канюляция аорты, закрепление аорты путем затягивания петлевого шелкового шва и промывание до 5 мл перфузионного раствора.
- Извлеките сердце из канюли и поместите его в весовую чашку с силиконовым эластомерным покрытием, чтобы подготовиться к выделению трабекулы.
3. Выделение и уравновешивание трабекулы
- Поместите сердце в чашку с силиконовым эластомерным покрытием под стереомикроскопом и осветите его.
- Найдите правый желудочковый выходной тракт. Прикрепите левое предсердие и верхушку желудочка к силиконовому эластомеру в чашке.
- С помощью длинных ножниц Vannas, разрежьте от правого желудочкового оттока до верхушки вдоль перегородки. Разрез от выходного тракта правого желудочка до правого предсердия возле аорты, затем разрез через правое предсердие (рис. 3B).
- С помощью щипцов осторожно оттяните правую желудочковую стенку (ПЖ) от выходного тракта, стараясь не растянуть ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментаторы могут найти тонкие белые нити соединительной ткани, которые можно без проблем разрезать. Более крупные пряди розового (тканевого) цвета следует оценивать с осторожностью, так как они могут быть трабекулами, которые можно выделить. - Прикрепите свободную стенку треугольника правого желудочка к тарелке, чтобы обнажить правый желудочек (рис. 3C).
- Используя стеклянную пипетку, которая была расплавлена и сформирована с тонким (диаметром <500 мкм), но не острым концом, обыщите открытый эндокард на наличие отдельно стоящих трабекул (рис. 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельно стоящая трабекула - это полоска мышцы, под которой можно полностью прощупать. Используйте трабекулы, которые имеют параллельные стороны (постоянная ширина), избегая треугольных сосочковых мышц. Будьте осторожны во время этого процесса и последующего рассечения, так как натяжение на трабекулу может привести к повреждению, уменьшая развиваемую силу. - Рассекайте трабекулу с помощью маленьких ножниц Ваннаса. Оставьте нарезанный кубиками кусочек ткани размером ≥1 мм на каждом конце трабекулы, чтобы можно было прикрепиться. Не растягивайте трабекулу там, где это возможно, и сведите к минимуму контакт металлических инструментов, так как оба они также могут привести к повреждению мышц. Переместите штифты, удерживающие сердце, по мере необходимости, чтобы свести к минимуму нагрузку на мышцы рядом с идентифицированными трабекулами.
- Отрежьте ~ 2 дюйма от конца пипетки для переноса объемом 7 мл, медленно втяните трабекулу в пипетку и перенесите ее в новую весовую чашку, содержащую 50% перфузионного раствора и 50% модифицированного раствора Тирода. Дайте мышце уравновеситься к увеличению внеклеточного кальция в смешанном растворе в течение нескольких минут.
- Повторите шаги 3.7-3.8, чтобы на этот раз препарировать дополнительные трабекулы, чтобы получить дополнительные трабекулы в качестве резервных.
- Выключите насос, подающий суперфузию и/или всасывание в экспериментальную камеру. Используя пипетку для переноса большого диаметра, переместите трабекулу в экспериментальную камеру, заполненную раствором Тирода.
- Прикрепите один кубический кусок ткани размером >1 мм на конце трабекулы к крючку на преобразователе силы, затем прикрепите второй куб к двигателю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделите двигатель и датчик силы при установке первой стороны для лучшего доступа к датчику, затем переместите крючки как можно ближе друг к другу при установке второго куба ткани, пока трабекула остается слабой. - Перезапустите суперфузию и начните тренировать мышцу, чтобы определить пороговое напряжение. Темп на 20% выше порогового напряжения в течение примерно 1 ч, чтобы позволить трабекуле уравновеситься.
- В конце этого периода равновесия медленно растягивайте мышцу с помощью микрометра, подключенного к двигателю, до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная развитая генерация напряжения, наблюдая за развитым (от минимума до пика) напряжением. Прекратите увеличивать длину мышц, когда пассивное диастолическое напряжение возрастает быстрее, чем пиковое напряжение, что указывает на то, что оптимальная длина пройдена.
- Выключите подсветку проходящего микроскопа, а трабекулу осветите с помощью осветителя гусиной шеи под крутым углом. С помощью камеры, подключенной через оптику микроскопа, которая ранее была откалибрована, сделайте снимок трабекулы во время диастолы в экспериментальную папку. Если трабекула шире, чем поле зрения камеры, сделайте несколько снимков мышцы.
- Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений, которое сообщает расстояния в пикселях.
- Измерьте расстояние между пикселями диаметра мышцы четыре раза по ее длине. Измерьте длину мышцы (трабекулы) в пикселях, исключая большой куб ткани.
- Если длина мышцы больше, чем поле зрения, используйте опорные точки вдоль мышцы, чтобы измерить всю длину.
- Используя шаблон в экспериментальной папке, усредните меры диаметра и преобразуйте диаметр и длины из пикселей в миллиметры, используя ранее полученную калибровку. Рассчитайте площадь поперечного сечения как π * диаметр 2/4 мм2 и длину мышцы в мкм.
4. Сбор данных
- Как только мышца будет уравновешена, откройте программное обеспечение для сбора данных, выберите «Эксперименты» | Контроль длины и введите калиброванную длину трабекулы (FL) и площадь поперечного сечения (площадь [м2]) в поле калибровки.
- В папке шаблона (шаг 1.7) убедитесь, что freeform_file.txt указывает на правильную папку, и откройте файл freeform.dap в текстовом редакторе. Установите изотонический уровень (изотон) на 32 000 в файле *.dap.
- В поле «Управление длиной» выберите вкладку « Свободная форма » и перейдите к соответствующему файлу списка «Произвольная форма». Убедитесь, что путь к файлу данных также является правильной папкой для сохранения данных. Начните сбор данных с полностью изометрических подергиваний, нажав кнопку Run Experiment, а затем получите данные о зажиме нагрузки с помощью элемента управления обратной связью с пропорциональными и интегрированными параметрами усиления.
- Получите данные с зажатыми нагрузкой, определив постнагрузку (изотон) в файле *.dap, и выполните итерацию значений параметров пропорционального усиления (propgain) и интегрирования (Ki), сохранив файл в текстовом редакторе. Нажмите «Запустить эксперимент » в программном интерфейсе сбора данных.
- Убедитесь, что зажим включает в себя повторное удлинение до исходной длины (иногда называемое релаксационной нагрузкой5) во время этой итерации для достижения максимального диапазона скоростей деформации, установив режим (flswitch) с единицы и увеличив порог для завершения нагрузочного зажима (flthreshold) с нуля.
- Управляйте концом зажима нагрузки, изменяя режим (flswitch) с единицы на ноль. Повторите получение, изменяя конец зажима нагрузки с нулевого удлинения на полное повторное удлинение обратно к начальной длине.
- Чтобы увеличить длину, постепенно увеличивайте порог прекращения зажима нагрузки (порог) с нуля до тех пор, пока мышца почти не вернется к своей первоначальной длине.
- Сбросьте режим (flswitch = 1) и пороговое значение (flthreshold = 0) и запустите один последний сбор данных.
- При желании изменить постнагрузку в исследовании, повторив этапы 4.4-4.6. Это приобретение может быть сделано немедленно.
- При желании измените преднатяг, растянув или укоротив мышцу, или обработайте мышцу, добавив соединения в раствор Tyrode. При изменении предварительного натяга или добавлении соединений подождите не менее 20 минут, чтобы убедиться, что реакциямедленной силы 9,15 стабилизировалась и/или чтобы соединение полностью проникло в мышцу.
- После завершения сбора данных удалите трабекулу. При необходимости заморозьте или зафиксируйте трабекулу для биохимического или гистологического анализа.
- Очистите рабочие зоны и экспериментальную систему, промойте все трубки водой и выключите все компоненты.
5. Анализ данных
- Откройте файлы данных с помощью программы количественного анализа, направив программу по соответствующему пути к файлу.
- Количественно оцените релаксацию, убедившись, что программа анализа данных анализирует зажатый ритм и что программа правильно получает начало зажима нагрузки.
- Убедитесь, что конец зажима нагрузки идентифицирован, чтобы скорость релаксации (1/τ) была количественно определена из пиковой отрицательной производной напряжения во время изометрической релаксации.
- Используйте методГланца 16 для определения этой экспоненциальной постоянной времени или другой подходящей количественной оценки релаксации (минимальная производная напряжения, логистическая постояннаявремени 17 или кинематическая модель18).
- Убедитесь, что программа анализа данных вычисляет скорость деформации, принимая производную по времени деформации, где деформация вычисляется как длина в зависимости от времени, деленная на длину при оптимальном сокращении.
- Повторите описанные выше шаги для всех следов данного состояния.
- Постройте график взаимосвязи между скоростью релаксации и скоростью деформации, ограничив максимальные данные физиологической скоростью деформации менее 1 с-1. Исключите данные при низких скоростях деформации (рис. 4С), так как фаза релаксации может не отражать экспоненциальный распад17,18.
- Получите наклон линии между скоростью релаксации и скоростью деформации и запишите наклон как индекс MCR.
- Повторите приведенный выше анализ для каждого опрашиваемого состояния.
Representative Results
Репрезентативный набор данных показан на рисунке 4, а дополнительные результаты можно найти в предыдущих публикациях 8,9. Вкратце, скорость деформации рассчитывается из производной деформации, непосредственно перед изометрической релаксацией. Напряжение - это длина в зависимости от времени, деленная на длину мышцы при оптимальной длине. Скорость релаксации вычисляется как 1/τ, где τ — экспоненциальная постояннаявремени 16. Множественные скорости деформации и их результирующие скорости релаксации необходимы для определения механического управления релаксацией (MCR). Эти данные нанесены на график зависимости скорости релаксации от скорости деформации. Наклон линии обеспечивает индекс MCR.
Обратите внимание, что конечные систолические и диастолические деформации вряд ли превысят 1 с-1. Следовательно, наклон должен включать только скорости деформации < 1 с-1. Скорость релаксации при низких скоростях деформации может быть искажена изменениями минимальной производной напряжения по времени (dStress/dtmin), и в этих случаях данные о растяжениях менее чем приблизительно 0,15 с-1 могут быть проигнорированы.
Рисунок 1: Настройка грубого рассечения и зоны канюляции сердца. Справа налево: а. Анестезиологическая индукционная камера для животного расположена рядом с зоной рассечения. b. Шноркель для дополнительного поглотителя летучих газов. c. Подушечка для рассечения, куда животное будет помещено лежа на спине, окружена (по часовой стрелке) d. носовым обтекателем, чтобы обеспечить непрерывную анестезию грызуна, e. гемостаты, f. хирургические ножницы, g. изогнутые тонкие ножницы, расположенные для легкого доступа доминирующей (режущей) рукой, h. изогнутые щипцы радужной оболочки, расположенные для легкого доступа с недоминантной рукой. Верхние конечности грызуна могут быть прикреплены к диссекционной подушечке с помощью ленты, и i. рядом следует поместить диссекционную тарелку (или маленький стакан) с перфузионным раствором для промывания сердца. j. Рядом должна быть оборудована площадка для канюляции. Шприц с соответствующей канюлей устанавливается на кольцевую подставку. k. (Вставка) Более близкое изображение канюли 16 G с прикрепленной трубкой PE205 толщиной 1 мм и неплотно завязанным узлом швом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная зона и инструменты . (А) Опытный район. Экспериментальная камера и система сбора данных подготовлены на соседнем перевернутом микроскопе (слева). Изоляция и монтаж трабекулы происходит под стереоскопом (справа). (B) Наконечники двух щипцов, больших и маленьких ножниц Vannas и специального стеклянного зонда готовятся путем замачивания в 10% растворе BSA. (C) Дополнительные инструменты вскрытия. Чашка с силиконовым эластомерным покрытием позволяет монтировать сердце во время тонкого рассечения. Пипетка для переноса объемом 7 мл с отрезанным концом показана под чашкой и стеклянным зондом. Отрезанный наконечник пипетки для переноса отбрасывается, а увеличенное отверстие используется для переноса мышцы с минимальным риском растяжения или обезвоживания. D) увеличенное изображение конца стеклянной пипетки длиной приблизительно 2 мм и диаметром 0,25-0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Руководство по вскрытию . (А) Грубое рассечение следует начинать с поперечного разреза (1. зеленого) через кожу в брюшную полость ниже ксифоидного отростка (нижние ребра и ксифоид обозначены тонкой серой линией). Далее следуют парасагиттальные разрезы от брюшной полости вверх по грудной клетке (2. бирюзовая и 3. синяя линии), после чего диафрагма должна быть разрезана. Затем гемостат можно использовать для зажима ксифоидного отростка и поднятия грудной стенки к голове. (B) Интактное сердце крысы, прикрепленное к кремниево-эластомерной чашке, ориентированное с видом на выходной тракт правого желудочка (RVOT), правое предсердие (RA), аорту (Ao) и левое предсердие (LA). Первый набор надрезов должен быть от RVOT до вершины вдоль перегородки (1. Желтая линия). Второй набор разрезов должен быть от RVOT вдоль основания сердца, затем через правое предсердие (2. оранжевая линия). (C) RVOT можно осторожно оттянуть от аорты, чтобы открыть сердце и закрепить его обратно. Желтые и оранжевые линии соответствуют разрезам, описанным в B. Свободно стоящие трабекулы часто встречаются у основания свободной стенки RV и вблизи перегородки, но могут возникать где угодно (красные линии указывают на общие места). (D) Увеличенный вид стеклянного зонда под трабекулой (желтая стрелка указывает на пересечение трабекулы и зонда). (E) Трабекула (красная стрелка) установлена на экспериментальной системе между датчиком силы (слева) и двигателем (в центре справа) и окружена двумя проводами для стимуляции (горизонтально над и под трабекулой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные следы и результаты . (A) Одна сердечная трабекула, освещенная светодиодным светом на гусиной шее под крутым (~ 75 °) углом от оси линзы микроскопа, что усиливает контраст трабекулы. В этом примере два изображения разбиты на плитки, чтобы показать всю длину трабекулы. (B) Кривые времени напряжения (вверху) и времени деформации (внизу) для одной и той же трабекулы. Показано изометрическое подергивание, а также три подергивания с нагрузочным зажимом при увеличении скорости конечной систолической деформации. (C) Репрезентативный расчет MCR. MCR определяется как наклон линии между скоростью релаксации и скоростью деформации. Как отмечалось в обсуждении, скорости деформации могут быть ограничены для получения количественного, воспроизводимого MCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Discussion
Механический контроль релаксации (MCR) количественно определяет зависимость скорости релаксации миокарда от скорости деформации мышцы, протекающей релаксации 8,9. Скорость деформации, а не постнагрузка, необходима и достаточна для изменения скорости релаксации8. Поскольку не было доказано, что вмешательства по изменению нормы кальция существенно улучшают сердечную релаксацию, механическое вмешательство может дать новое понимание механизма и обеспечить новое лечение диастолической дисфункции.
В протоколе изменения скорости деформации миокарда, описанном здесь, используется изотонический зажимнагрузки 8,9. Сильной стороной изотонического нагрузочного зажима является количественный контроль постнагрузочного напряжения. Протоколы, подобные протоколам Виндкесселя, могут быть использованы для дальнейшего исследования изменений в постнагрузке, преднагрузке и работе сердца 2,6,7. Рампа, не контролируемая зажимом нагрузки, также может быть использована для лучшей изоляции изменения деформации от скорости деформации. Несмотря на это, сама постнагрузка, по-видимому, не является сильным модификатором скорости релаксации8.
Протокол также может быть адаптирован для приближения к более физиологическим условиям температуры и скорости стимуляции. Текущие детали протокола были использованы, чтобы показать наличие MCR. Обычно рекомендуется проводить эксперименты в физиологических условиях, в зависимости от экспериментального вопроса. Однако эксперименты, проводимые при 37 ° C или при высокой скорости стимуляции, могут быстрее вызвать истощение (повреждение) мышцы. Может потребоваться решение с улучшенной пропускной способностью кислорода. Кроме того, сбор данных должен иметь возможность выборки длины и силы достаточно быстро, чтобы устранить быстрые подергивания и обеспечить контроль обратной связи.
Текущий протокол не описывает измерение кальция или измерение и контроль длины саркомера. Измерения кальция рассматривались в других протоколах11, в то время как измерение длины саркомера может быть добавлено с помощью соответствующего оборудования. Контроль длины саркомера не используется в текущих исследованиях MCR, поскольку длина мышц является наиболее корреляционным параметром для клинического состояния19. Дальнейший контроль длины саркомера (по сравнению с контролем длины мышц) даст конкретные ответы на кинетические вопросы, но вряд ли добавит к трансляционным знаниям из-за межсаркомеровых вариаций и минимального понимания изменений длины саркомера in vivo.
Здесь выделены три экспериментальных соображения для повышения воспроизводимости данных.
Во-первых, у некоторых животных может быть трудно обнаружить отдельно стоящие сердечные трабекулы (неопубликованные результаты и сообщения). В то время как подергивание мышц можно обнаружить у большинства крыс, разумный показатель успеха для получения данных из трабекулы у крыс составляет один к трем. Успех Trabecula может быть выше у крыс Brown Norway x Lewis F1, которые также использовались исторически20 и, как сообщается, имеют больше трабекул (неопубликованные сообщения). Для мышей показатели успеха, вероятно, будут ниже, и менее одного из 10 ожидается для мышей с фоном BL / 6; однако более высокий показатель ожидается для мышей с фоном FVBN (неопубликованные сообщения и наблюдения).
Во-вторых, повреждение мышц может снизить производительность. Если развитые силы составляют менее 10 мН мм-2 при 25 ° C и частоте 0,5 Гц, исследователям может потребоваться выполнить поиск и устранение неисправностей, чтобы оценить, происходит ли непреднамеренное растяжение или контакт между металлическими щипцами и мышцей, если растворы не приготовлены должным образом, или правильно ли функционирует кардиостимулятор или экспериментальное оборудование. Другие протоколы, использующие интактную трабекулу, предлагают использовать шприцы с замком Люэра в качестве передаточных сосудов11. Хотя это возможно, особенно если пользователь контролирует очень медленную скорость потока или меньший мышечный сегмент, в текущем протоколе используется пипетка для переноса отверстия гораздо большего размера, чтобы свести к минимуму возможные повреждения. Еще один этап, на котором может произойти ишемическое повреждение, - это рассечение. Аорту следует канюлировать и промывать перфузионным раствором в течение 3 мин после первого разреза брюшной полости (крыса) или вывиха шейки матки (мышь), аналогично пределам, указанным в протоколах выделения кардиомиоцитов21,22. Это сводит к минимуму время, когда сердечная ткань не подвергается воздействию кардиоплегического перфузионного раствора. Кроме того, рассечения продолжительностью более 30 минут обычно не вызывают подергивания трабекулы. Таким образом, операторы должны практиковать быстрое, но осторожное вскрытие, чтобы свести к минимуму ущерб. Площадь поперечного сечения выше 0,2мм2 (2 x 10-7 м2) может страдать от ишемии ядра20.
В-третьих, следует учитывать способ, которым мышцы прикреплены к двигателю и преобразователю силы. Этот протокол в настоящее время фокусируется на крючках и отдельно стоящих трабекулах. Иногда быстрая скорость растяжения перед расслаблением может привести к скольжению мышцы, если она не прикреплена должным образом, поэтому текущий протокол не использует «корзины» для удержания трабекулы23,24. Альтернативные методы монтажа (клеи, зажимы и т. Д.25,26) также могут быть рассмотрены и проверены. В описанном здесь протоколе используются трабекулы, а не папиллярные мышцы. Хорды сосочковой мышцы индуцируют последовательную эластичность, которая может ингибировать изменения MCR9. Тем не менее, точное размещение прикреплений в мышце вряд ли повлияет на меры, потому что длина (и диаметр) трабекулы существенно различаются.
Ограничением прокалывания концов мышц крючками является то, что сама точка крепления также может быть повреждена. Возможный разрыв прикрепленной мышечной ткани при частых сокращениях (в зависимости от их силы) может изменить длину или эластичность ряда. Такую скорость разрыва трудно контролировать. Точно так же повреждение ткани и крючка может усугубиться во время растяжения, что также может вызвать проблемы. Визуальный осмотр и разработанные значения силы, оставшиеся >80% от уравновешенной изометрической силы, должны использоваться для оценки того, поврежден ли препарат, и должны быть исключены.
Другое ограничение или соображение влияет на то, на какие экспериментальные вопросы можно ответить с помощью метода. Например, рассмотрим использование 2,3-бутандионмоноксима (BDM) в перфузионном растворе. BDM - это фосфатаза, которая может изменять функцию мышц. Кроме того, длительный период разгрузки и отсутствие темпа означают, что состояние скрытого фосфорилирования, вероятно, изменилось. Таким образом, следует соблюдать осторожность, если вы пытаетесь напрямую оценить сократимость мышц животного (по сравнению с различиями между генотипами или методами лечения), поскольку сократительное состояние, вероятно, изменилось. Однако влияние фосфорилирования можно оценить фармакологически путем добавления агониста или антагониста пути.
Таким образом, MCR дает представление о том, как расслабление регулируется движением мышц (скоростью напряжения). MCR может помочь лучше понять диагностику и мониторинг диастолического заболевания, а также цели фармакологического вмешательства, такие как изменение кинетики миозина. В протоколе и рекомендациях, изложенных здесь, изложены знания, накопленные за несколько лет испытаний, и они должны быть применимы к другим системам и моделям сердечных заболеваний.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения (1R01HL151738) и Американской кардиологической ассоциацией (18TPA34170169).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| 23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
| 5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
| Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Data acquisition software | SLControl | ||
| Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
| Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
| Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
| Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
| Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Imaging software | IrfanView | ||
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
| Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
| Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
| Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
| Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
| Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
| pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
| Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
| Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
| Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |
References
- Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).
- Dowrick, J. M., et al. Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload. Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).
- ter Keurs, H. E., Rijnsburger, W. H., van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Sonnenblick, E. H. Force-velocity relations in mammalian heart muscle. The American Journal of Physiology. 202, 931-939 (1962).
- Brutsaert, D. L., Rademakers, F. E., Sys, S. U. Triple control of relaxation: implications in cardiac disease. Circulation. 69 (1), 190-196 (1984).
- Taberner, A. J., Han, J. C., Loiselle, D. S., Nielsen, P. M. F. An innovative work-loop calorimeter for in vitro measurement of the mechanics and energetics of working cardiac trabeculae. Journal of Applied Physiology. 111 (6), 1798-1803 (2011).
- De Tombe, P. P., Little, W. C. Inotropic effects of ejection are myocardial properties. Am J Physiol. 266, 1202-1213 (1994).
- Chung, C. S., Hoopes, C. W., Campbell, K. S. Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 103, 65-73 (2017).
- Schick, B. M., et al. Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics. Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909 (2021).
- Parikh, S. S., Zou, S. Z., Tung, L. Contraction and relaxation of isolated cardiac myocytes of the frog under varying mechanical loads. Circulation Research. 72 (2), 297-311 (1993).
- Dowrick, J. M., et al. Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (176), e62799 (2021).
- Wiggers, C. J. Studies on the consecutive phases of the cardiac cycle I. The duration of the consecutive phases of the cardiac cycle and the criteria for their precise determination. American Journal of Physiology-Legacy Content. 56 (3), 415-438 (1921).
- Rosen, B. D., et al. Late systolic onset of regional LV relaxation demonstrated in three-dimensional space by MRI tissue tagging. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1740-1746 (2004).
- Saito, M., et al. The differences in left ventricular torsional behavior between patients with hypertrophic cardiomyopathy and hypertensive heart disease. International Journal of Cardiology. 150 (3), 301-306 (2011).
- Monasky, M. M., Biesiadecki, B. J., Janssen, P. M. L. Increased phosphorylation of tropomyosin, troponin I, and myosin light chain-2 after stretch in rabbit ventricular myocardium under physiological conditions. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (5), 1023-1028 (2010).
- Raff, G. L., Glantz, S. A. Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart. Circulation Research. 48, 813-824 (1981).
- Matsubara, H., Takaki, M., Yasuhara, S., Araki, J., Suga, H. Logistic time constant of isovolumic relaxation pressure-time curve in the canine left ventricle. Better alternative to exponential time constant. Circulation. 92 (8), 2318-2326 (1995).
- Chung, C. S., Kovacs, S. J. Physical determinants of left ventricular isovolumic pressure decline: model prediction with in vivo validation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1589-1596 (2008).
- Campbell, K. B., Kirkpatrick, R. D., Tobias, A. H., Taheri, H., Shroff, S. G. Series coupled non-contractile elements are functionally unimportant in the isolated heart. Cardiovascular Research. 28 (2), 242-251 (1994).
- Raman, S., Kelley, M. A., Janssen, P. M. Effect of muscle dimensions on trabecular contractile performance under physiological conditions. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 451 (5), 625-630 (2006).
- Czeiszperger, T. L., Wang, M. P., Chung, C. S. Membrane stabilizer Poloxamer 188 improves yield of primary isolated rat cardiomyocytes without impairing function. Physiol Rep. 8 (4), 14382 (2020).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Loiselle, D. S., Johnston, C. M., Han, J. C., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Muscle heat: a window into the thermodynamics of a molecular machine. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 311-325 (2016).
- de Tombe, P. P., ter Keurs, H. E. Force and velocity of sarcomere shortening in trabeculae from rat heart. Effects of temperature. Circulation Research. 66 (5), 1239-1254 (1990).
- Palmer, B. M., Bell, S. P. Preparing excitable cardiac papillary muscle and cardiac slices for functional analyses. Frontiers in Physiology. 13, 817205 (2022).
- Brunello, E., et al. Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 8177-8186 (2020).
