Summary
Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.
Abstract
La technologie CRISPR / Cas9 a augmenté la valeur du poisson zèbre pour la modélisation des maladies génétiques humaines, l’étude de la pathogenèse des maladies et le dépistage de médicaments, mais les limitations du motif adjacent protospacer (PAM) sont un obstacle majeur à la création de modèles animaux précis de troubles génétiques humains causés par des variantes mononucléotidiques (SNV). Jusqu’à présent, certaines variantes de SpCas9 avec une large compatibilité PAM ont montré leur efficacité chez le poisson zèbre. L’application de l’éditeur optimisé de base adénine médiée par SpRY (ABE), zSpRY-ABE8e et de l’ARNg synthétiquement modifié chez le poisson zèbre a permis une conversion efficace de la base adénine-guanine sans restriction PAM. Décrit ici est un protocole pour l’édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM chez le poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e. En injectant un mélange d’ARNm zSpRY-ABE8e et d’ARNg synthétiquement modifié dans des embryons de poisson zèbre, un modèle de maladie du poisson zèbre a été construit avec une mutation précise qui simulait un site pathogène du facteur de maturation du ribosome TSR2 (tsr2). Cette méthode fournit un outil précieux pour l’établissement de modèles de maladie précis pour l’étude des mécanismes et des traitements de la maladie.
Introduction
Les variantes mononucléotidiques (SNV) qui provoquent des mutations faux-sens ou des mutations absurdes sont la source la plus courante de mutations dans le génome humain1. Pour déterminer si un SNV particulier est pathogène et pour faire la lumière sur sa pathogenèse, des modèles animaux précis sont nécessaires2. Le poisson zèbre est un bon modèle de maladie humaine, présentant un degré élevé d’homologie physiologique et génétique avec les humains, un cycle de développement court et une forte capacité de reproduction, ce qui est avantageux pour la recherche sur les caractéristiques et les mécanismes pathogènes, ainsi que pour le dépistage de médicaments3.
Le système CRISPR (Clustered Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 a été largement appliqué dans l’édition du génome de diverses espèces, y compris le poisson zèbre4. Avec le guidage de l’ARNg, le système CRISPR / Cas9 peut générer des cassures double brin d’ADN (DSB) sur le site cible, ce qui permet ensuite la substitution d’une seule base par recombinaison du site cible avec des modèles d’ADN donneur via la voie de réparation dirigée par homologie (HDR). Cependant, l’efficacité de cette méthode de remplacement de base est assez faible car le processus de réparation de l’ADN cellulaire est principalement effectué par la voie de jonction terminale non homologue (NHEJ), qui s’accompagne généralement de mutations d’insertion et de délétion (indel)5. Heureusement, la technologie d’édition à base unique basée sur CRISPR / Cas9 atténue considérablement ce problème en utilisant des éditeurs de base, qui permettent une édition à base unique plus efficace sans induire de DSB. Deux grandes classes d’éditeurs de base, les éditeurs de base d’adénine (ABE) et les éditeurs de bases de cytosine (CBE), ont été développées pour mettre en œuvre l’édition de substitution de base pour A· T à G· C et C·G à T· A, respectivement 6,7,8,9,10,11. Ces quatre types de substitutions de base couvrent 30 % des variantes pathogènes humaines12. Les deux classes d’éditeurs de base, y compris PmCDA1, le système BE, CBE4max, ABE7.10 et ABE8e, ont été signalées pour travailler chez le poisson zèbre, BE4max et ABE8e étant particulièrement signalés pour atteindre une activité d’édition élevée 13,14,15,16,17,18,19.
Les protéines Cas9 de différentes espèces, y compris Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes et S. canis, ont été mises en œuvre dans l’édition de gènes de poisson zèbre, le Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) étant utilisé le plus largement20,21,22,23. Cependant, SpCas9 ne peut reconnaître que les sites cibles avec un motif adjacent protospacer NGG (PAM), ce qui limite sa portée modifiable et peut entraîner la découverte d’aucune séquence appropriée près du site pathogène d’intérêt24. Pour élargir la plage cible, une variété de variantes SpCas9 ont été conçues pour reconnaître différents PAM grâce à une évolution dirigée et à une conception guidée par la structure. Cependant, peu de variantes sont efficaces chez les animaux, en particulier chez le poisson zèbre, ce qui limite l’application du poisson zèbre dans la recherche sur les maladies liées au SNV25,26,27,28. Récemment, deux variantes de SpCas9, SpG et SpRY, avec des restrictions PAM moins strictes (NGN pour SpG et NNN pour SpRY avec une préférence plus élevée pour NRN que NYN) ont été signalées comme présentant une activité d’édition élevée dans les cellules et les plantes humaines 29,30,31,32. Par la suite, SpG et SpRY, ainsi qu’un certain nombre de leurs éditeurs de base médiés, tels que les CBE médiés par SpRY et les ABE à médiation SpRY, ont également été signalés pour travailler sur le poisson zèbre, ce qui améliorera l’application des modèles de poisson zèbre dans l’étude mécanistique et le dépistage médicamenteux des maladies liées au SNV 18,33,34,35 . En outre, i-Silence a été proposé comme une stratégie efficace et précise d’élimination des gènes par la conversion du codon de départ médiée par ABE d’ATG en GTG ou ACG36. La combinaison de la stratégie i-Silence et de l’éditeur de base médié par SpRY zSpRY-ABE8e fournit une nouvelle méthode de modélisation de la maladie18. Ce protocole montre comment effectuer l’édition de gènes en utilisant zSpRY-ABE8e chez le poisson zèbre pour construire un modèle tsr2 (M1V) en utilisant la stratégie i-Silence. L’efficacité de l’édition et les phénotypes qui apparaissent dans les modèles de poisson zèbre ont été évalués et analysés.
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Protocol
Cette étude a été menée dans le strict respect des directives du Comité de soin et d’utilisation de l’Université normale de Chine du Sud.
1. Préparation de l’ARNg synthétiquement modifié et de l’ARNm zSpRY-ABE8e
- Concevoir l’ARNg selon les publications précédentes37,38.
- Sélectionnez de préférence NRN comme séquence PAM, car zSpRY-ABE8e montre une préférence plus élevée pour NRN PAM que NYN PAM (où R est A ou G, et Y est C ou T)18. Assurez-vous que le nucléotide adénine cible se trouve dans la fenêtre d’édition hautement active (troisième à neuvième nucléotide le long du protospacer).
- Commandez EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modifié avec du 2′-O-méthyl-3′-phosphorothioate (MS) aux deux extrémités (Figure 1).
REMARQUE: L’ARNg EE doit être dissous dans de l’eau exempte de RNase et stocké à -80 ° C. - Linéariser le plasmide zSpRY-ABE8e18.
- Linéariser 6 μg du plasmide avec l’enzyme XbaI (Table of Materials) dans un bain métallique à 37 °C pendant 3 h.
- Purifier le plasmide linéarisé à l’aide du kit de purification de l’ADN (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Transcrire l’ARNm à l’aide du kit de transcription in vitro (Table of Materials).
- Transcrire l’ARNm zSpRY-ABE8e avec le plasmide linéarisé comme matrice selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: Toutes les opérations impliquant l’ARNm et l’ARNg nécessitent l’utilisation de fournitures de laboratoire sans RNase.
- Transcrire l’ARNm zSpRY-ABE8e avec le plasmide linéarisé comme matrice selon les instructions du fabricant.
- Utilisez le kit de purification de l’ARN (Tableau des matériaux) pour purifier l’ARNm conformément aux instructions du fabricant.
NOTE: Avant élution, l’éthanol doit être séché pour éviter la cytotoxicité, et l’ARNm doit être conservé à -80 ° C s’il n’est pas utilisé immédiatement.
2. Préparation des capillaires en verre de micro-injection
- Installez le système d’extraction de micropipettes et préchauffez pendant au moins 30 minutes.
- Effectuer un essai au rampe pour déterminer le pouvoir calorifique nécessaire pour faire fondre les capillaires en verre borosilicaté (avec un diamètre extérieur de 1 mm et un diamètre intérieur de 0,58 mm) conformément aux instructions du fabricant.
- Sélectionnez un programme et cliquez sur le numéro du clavier pour entrer les valeurs des paramètres. Définissez les paramètres suivants pour tirer les capillaires en verre : chaleur = valeur de test de rampe, traction = 50, vitesse = 100, temps = 50 et pression = 30.
- Installez le tube capillaire en vous assurant qu’il est dans la rainure. Appuyez sur PULL START/STOP pour exécuter le programme.
- Préservez les capillaires tirés en les insérant dans de la mousse contenant des lacunes, en gardant l’aiguille suspendue.
3. Microinjection du mélange d’ARNm zSpRY-ABE8e et d’ARNg EE dans des embryons de poisson zèbre
- Installez des bassins d’élevage la veille de l’injection. Insérez un séparateur, placez deux femelles et un poisson zèbre mâle de souche AB (3-18 mois) dans chaque aquarium et couvrir avec le couvercle. Voir les publications précédentes pour les distinctions entre les sexes39.
NOTE: Pour obtenir plus d’embryons, sélectionnez des poissons qui ne se sont pas reproduits depuis au moins 1 semaine. - Le lendemain matin avant l’injection, décongeler l’ARNm zSpRY-ABE8e et l’ARNg EE sur de la glace. Mélanger l’ARNm et l’ARNg à des concentrations finales de 400 ng/μL et 200 ng/μL, respectivement.
- Effectuez toute la procédure sur la glace à l’aide d’embouts et de tubes sans RNase, et manipulez avec des gants.
- Configurez le microinjecteur pneumatique. Fermez la soupape de pression partielle de la pompe à air et ouvrez d’abord la vanne principale, dévissez la bouteille de gaz et réglez la pression de la soupape de pression partielle à 0,2 MPa/29 psi.
- Allumez le microinjecteur pneumatique, réglez le mode sur TIMER et réglez la valeur de pression initiale du paramètre à 20,0 psi et la valeur TIMER à 0,040 s.
- Utilisez des pinces fines pour casser soigneusement les aiguilles des capillaires en verre tiré sous un stéréomicroscope, en vous assurant que les aiguilles sont coupées à un angle pour faciliter le perçage du chorion et de l’œuf.
REMARQUE: Le point de rupture de l’aiguille doit être au bon endroit et être assez fort pour percer l’œuf mais assez mince pour minimiser les dommages à l’œuf. - Ajouter le mélange d’ARNm zSpRY-ABE8e et d’ARNg à l’extrémité d’un capillaire en verre à l’aide d’un embout de pipette de microchargeur, en évitant les bulles dans le capillaire. Fixez l’aiguille au micromanipulateur et configurez la pression et la valeur TIMER de l’injecteur pour vous assurer que 2 nL de mélange sont produits par injection à l’aide d’un microcapuchon.
- Débranchez les séparateurs des bassins de reproduction et laissez les poissons se reproduire pendant 10-15 min. Prélevez les œufs à l’aide d’une passoire et examinez le stade cellulaire et la qualité des œufs au stéréomicroscope. Sélectionnez les œufs à l’état unicellulaire pour l’injection afin d’améliorer l’efficacité de l’édition.
- Tapisser les œufs sur une plaque d’injection d’agarose à 1,5% et injecter 2 nL du mélange dans la cellule, et non le jaune, des embryons au microscope pour améliorer l’efficacité de l’édition. Conserver au moins 15 œufs comme groupe témoin.
- Utilisez 1x tampon E3 pour recueillir les œufs dans des boîtes de Petri et placez-les dans un incubateur à 28 °C. Retirez les œufs morts et changez le tampon de culture toutes les 12 heures jusqu’à 48 heures après la fécondation (HPF).
4. Analyse de l’efficacité de l’édition de base avec EditR
- À 48 hpf, prélever trois groupes de six embryons injectés sélectionnés au hasard et six embryons témoins sélectionnés au hasard dans des tubes de PCR respectivement. Utilisez une pipette pour aspirer le tampon E3 résiduel.
- Ajouter 40 μL de NaOH 50 mM dans les tubes PCR. Mettez les tubes dans un bain métallique à 95 °C pendant 20 min, puis vortex pendant 15 s.
- Ajouter 4 μL de 1 M de tris· HCl (pH 8,0) dans chaque tube pour neutraliser le NaOH. Centrifuger brièvement à 2 000 x g pendant 10 s à température ambiante pour éliminer les gouttelettes de la paroi du tube. Recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes PCR et les stocker à −20 °C.
- Concevoir des amorces appropriées en amont et en aval des sites cibles de l’ARNg. Utiliser 1 μL du surnageant ci-dessus comme matrice pour les réactions de PCR d’un volume de 50 μL. Les amorces utilisées pour la PCR dans cette étude sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1.
- Effectuer une électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN pour assurer des bandes correctes et spécifiques, suivie d’un séquençage de Sanger comme décrit précédemment40.
- Analysez les données de séquençage de Sanger avec le programme EditR (1.0.10)41.
- Téléchargez le fichier de séquençage (format ab1) dans la zone « Télécharger le fichier .ab1 ».
- Entrez la séquence d’ARNg de 20 pb en orientation 5′-3′ dans la case « Entrer la séquence d’ARNg ».
- Ouvrez le fichier de séquençage (format ab1) et confirmez les positions de base où la séquence d’ARNg de 20 pb commence et se termine. Entrez la position de base correspondante dans les cases « 5' start » et « 3' end ».
- Cliquez sur Édition prédite pour obtenir l’efficacité d’édition de base. Vérifiez la qualité des données de séquençage près de la séquence cible de l’ARNg pour éviter les pics désordonnés ou les indels.
REMARQUE: En général, les pics désordonnés peuvent être efficacement éliminés en ajustant la température de recuit PCR.
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Representative Results
Il a été rapporté que la mutation de TSR2 causait l’anémie de Diamond Blackfan (DBA)42. Ici, un modèle de poisson zèbre DBA a été construit avec une mutation tsr2 (M1V) en utilisant la stratégie i-Silence. L’adénine du codon de départ du poisson-zèbre tsr2 a été convertie avec succès en guanine à l’aide de zSpRY-ABE8e (Figure 3).
L’analyse EditR des résultats du séquençage de Sanger a montré qu’il y avait un chevauchement A/G à la base adénine du codon de départ tsr2 (Figure 4).
Après que les fondateurs de F0 ont été accouplés avec un adulte mutant hétérozygote tsr2 précédemment généré, les phénotypes embryonnaires ont été observés 2 jours après la fécondation (dpf) au microscope. Plusieurs embryons présentaient un phénotype d’yeux plus petits et un péricarde enflé par rapport aux témoins (Figure 5). Les embryons ont été anesthésiés avec 0,03% de tricaïne, fixés sur 4% de méthylcellulose et photographiés.
Figure 1 : Diagramme schématique de la séquence et de la structure secondaire de l’ARNg EE chargé dans la protéine zSpRY-ABE8e. Les nucléotides chimiquement modifiés sont marqués avec des étoiles noires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diagramme schématique de la structure de l’ARNm zSpRY-ABE8e contenant TadA8e optimisé pour les codons (zTadA8e) et SpRYCas9 optimisé pour les codons (zSpRYCas9). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagramme schématique de la mutation tsr2 (M1V) du poisson-zèbre à l’aide de zSpRY-ABE8e. Les séquences PAM sont surlignées en rouge, les bases éditées en bleu et les acides aminés ciblés en gras. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats du chromatogramme de séquençage de la mutation tsr2 (M1V) du poisson zèbre à l’aide de zSpRY-ABE8e. L’axe x représente la séquence de base, l’axe y représente la hauteur du pic et la base modifiée est indiquée par une pointe de flèche rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Phénotype des embryons tsr2 (M1V) à 2 dpf par rapport aux témoins. (A,C) La vue latérale et la vue dorsale (B,D) des embryons de poisson zèbre AB de type sauvage et des embryons (C,D) tsr2 (M1V) à 2 dpf. La pointe de flèche rouge en C indique un gonflement péricardique. La monture rouge et le diamètre reflètent la taille des yeux. Barre d’échelle: 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce protocole décrit la construction d’un modèle de maladie du poisson zèbre à l’aide de l’éditeur de base zSpRY-ABE8e. Par rapport à la voie HDR traditionnelle pour la substitution de base, ce protocole peut permettre une édition de base plus efficace et réduire l’apparition d’indels. Dans le même temps, ce protocole implique la mise en œuvre de la stratégie d’élimination du gène i-Silence récemment proposée chez le poisson zèbre. Ensemble, zSpRY-ABE8e améliorera l’application des modèles de poisson zèbre dans la recherche sur les maladies.
Les effets hors cible sont un problème courant dans les systèmes CRISPR/Cas9. Compte tenu de la restriction sans PAM, l’effet hors cible de zSpRY-ABE8e peut être plus élevé, même si aucune cible significative n’a été trouvée dans une étude antérieure incluant tsr2 ciblant18. Heureusement, ce problème peut être évité par des normes strictes de conception de l’ARNg, qui garantissent qu’une seule séquence du génome correspond exactement à l’ARNg avec PAM et maintiennent le nombre total de sites hors cible prévus au minimum. De plus, une étude a montré que l’injection de ribonucléoprotéine (RNP) et d’ARNg réduit la probabilité hors cible par rapport à l’injection d’ARNm et d’ARNg43. De plus, la modification de l’ARNg et du Cas9 peut également réduire les effets hors cible44,45. Chez le poisson zèbre, plusieurs générations de reproduction peuvent également être criblées pour les phénotypes cibles afin d’obtenir des modèles animaux avec de faibles effets hors cible.
Il y a encore quelques limites dans ce protocole. Bien que zSpRY-ABE8e n’ait pas de restriction PAM, il présente toujours une préférence PAM, NRN étant préféré à NYN chez le poisson zèbre. En outre, l’ABE ne peut mettre en œuvre que deux types de substitution de base, ce qui signifie qu’il n’est applicable qu’à la construction de modèles partiels. D’autres éditeurs de base doivent encore être développés pour implémenter les substitutions de base restantes chez le poisson zèbre.
En conclusion, ce protocole fournit des conseils détaillés pour l’utilisation de l’éditeur de base unique zSpRY-ABE8e dans le poisson zèbre. Il fournit une méthode réalisable et efficace pour construire des modèles précis de maladie du poisson zèbre, élargissant l’application des modèles de poisson zèbre dans les études de la pathogenèse et du traitement des maladies liées au SNV.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) pour avoir édité le texte anglais d’une ébauche de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche et développement dans les domaines clés de la province du Guangdong (2019B030335001), le Programme national de R&D clé de la Chine (2019YFE0106700), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070819, 31970782) et le Programme de fonds de recherche du laboratoire clé de biologie pathogène et d’épidémiologie des animaux économiques aquatiques de la province du Guangdong (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
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