Summary
Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.
Abstract
La tecnología CRISPR / Cas9 ha aumentado el valor del pez cebra para modelar enfermedades genéticas humanas, estudiar la patogénesis de enfermedades y la detección de fármacos, pero las limitaciones del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos de trastornos genéticos humanos causados por variantes de un solo nucleótido (SNV). Hasta ahora, algunas variantes de SpCas9 con amplia compatibilidad con PAM han demostrado eficiencia en el pez cebra. La aplicación del editor de base de adenina (ABE) mediado por SpRY optimizado, zSpRY-ABE8e y el ARNg modificado sintéticamente en el pez cebra ha permitido una conversión eficiente de la base de adenina-guanina sin restricción de PAM. Aquí se describe un protocolo para la edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM en peces cebra que usan zSpRY-ABE8e. Al inyectar una mezcla de ARNm de zSpRY-ABE8e y ARNg modificado sintéticamente en embriones de pez cebra, se construyó un modelo de enfermedad del pez cebra con una mutación precisa que simulaba un sitio patogénico del factor de maduración del ribosoma TSR2 (tsr2). Este método proporciona una herramienta valiosa para el establecimiento de modelos de enfermedad precisos para estudiar los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.
Introduction
Las variantes de un solo nucleótido (SNV) que causan mutaciones sin sentido o sin sentido son la fuente más común de mutaciones en el genoma humano1. Para determinar si un SNV en particular es patógeno y para arrojar luz sobre su patogénesis, se requieren modelos animales precisos2. El pez cebra son buenos modelos de enfermedades humanas, exhibiendo un alto grado de homología fisiológica y genética con los humanos, un ciclo de desarrollo corto y una fuerte capacidad reproductiva, lo que es ventajoso para la investigación de características y mecanismos patogénicos, así como para el cribado de drogas3.
El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9 se ha aplicado ampliamente en la edición del genoma de varias especies, incluido el pez cebra4. Con la guía de ARNg, el sistema CRISPR / Cas9 puede generar roturas de doble cadena de ADN (DSB) en el sitio objetivo, lo que luego permite la sustitución de base única a través de la recombinación del sitio objetivo con plantillas de ADN del donante a través de la vía de reparación dirigida por homología (HDR). Sin embargo, la eficiencia de este método de reemplazo de bases es bastante baja, ya que el proceso de reparación del ADN celular se lleva a cabo principalmente por la vía de unión final no homóloga (NHEJ), que generalmente se acompaña de mutaciones de inserción y deleción (indel)5. Afortunadamente, la tecnología de edición de base única basada en CRISPR / Cas9 alivia significativamente este problema mediante el uso de editores de base, que permiten una edición de base única más eficiente sin inducir DSB. Se han desarrollado dos clases principales de editores de base, los editores de base de adenina (ABE) y los editores de base de citosina (CBE), para implementar la edición de sustitución de bases para A· T a G· C y C·G a T· A, respectivamente 6,7,8,9,10,11. Estos cuatro tipos de sustituciones de bases cubren el 30% de las variantes patogénicas humanas12. Se ha informado que ambas clases de editores base, incluidos PmCDA1, BE system, CBE4max, ABE7.10 y ABE8e, funcionan en peces cebra, con BE4max y ABE8e especialmente reportados para lograr una alta actividad de edición 13,14,15,16,17,18,19.
Las proteínas Cas9 de diferentes especies, incluyendo Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y S. canis, se han implementado en la edición de genes de pez cebra, con el Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) siendo el más ampliamente utilizado20,21,22,23. Sin embargo, SpCas9 sólo puede reconocer sitios objetivo con un motivo adyacente al protoespaciador NGG (PAM), lo que limita su rango editable y puede resultar en que no se encuentre una secuencia adecuada cerca del sitio patógeno de interés24. Para ampliar el rango objetivo, se han diseñado una variedad de variantes de SpCas9 para reconocer diferentes PAM a través de la evolución dirigida y el diseño guiado por la estructura. Sin embargo, pocas variantes son efectivas en animales, especialmente en el pez cebra, lo que limita la aplicación del pez cebra en la investigación de enfermedades relacionadas con SNV25,26,27,28. Recientemente, se ha informado que dos variantes de SpCas9, SpG y SpRY, con restricciones de PAM menos estrictas (NGN para SpG y NNN para SpRY con una mayor preferencia por NRN que NYN) exhiben una alta actividad de edición en células y plantas humanas 29,30,31,32. Posteriormente, también se ha informado que SpG y SpRY, así como varios de sus editores de base mediados, como los CBE mediados por SpRY y los ABE mediados por SpRY, trabajan en peces cebra, lo que mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en el estudio mecanicista y la detección farmacológica de enfermedades relacionadas con SNV 18,33,34,35. Además, i-Silence se propuso como una estrategia efectiva y precisa de eliminación de genes a través de la conversión de codones de inicio mediada por ABE de ATG a GTG o ACG36. La combinación de la estrategia i-Silence y el editor base mediado por SpRY zSpRY-ABE8e proporciona un nuevo método para el modelado de enfermedades18. Este protocolo demuestra cómo realizar la edición de genes usando zSpRY-ABE8e en pez cebra para construir un modelo tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. Se evaluó y analizó la eficiencia de edición y los fenotipos que aparecen en los modelos de pez cebra.
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Protocol
Este estudio se realizó en estricto cumplimiento de las directrices del Comité de Cuidado y Uso de la Universidad Normal del Sur de China.
1. Preparación de ARNg modificado sintéticamente y ARNm de zSpRY-ABE8e
- Diseñar el ARNg según publicaciones anteriores37,38.
- Seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM (donde R es A o G, e Y es C o T)18. Asegúrese de que el nucleótido de adenina objetivo esté en la ventana de edición altamente activa (tercer a noveno nucleótido a lo largo del protoespaciador).
- Solicite EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificado con 2′-O-metil-3′-fosforotioato (MS) en ambos extremos (Figura 1).
NOTA: El ARNg EE debe disolverse en agua libre de RNasa y almacenarse a -80 °C. - Linealizar el plásmido zSpRY-ABE8e18.
- Linealizar 6 μg del plásmido con la enzima XbaI (Tabla de materiales) en un baño metálico a 37 °C durante 3 h.
- Purificar el plásmido linealizado utilizando el kit de purificación de ADN (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Transcribir el ARNm utilizando el kit de transcripción in vitro (Tabla de materiales).
- Transcribir el ARNm zSpRY-ABE8e con el plásmido linealizado como plantilla de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Todas las operaciones que involucran ARNm y ARNg requieren el uso de suministros de laboratorio libres de RNasa.
- Transcribir el ARNm zSpRY-ABE8e con el plásmido linealizado como plantilla de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice el kit de purificación de ARN (Tabla de materiales) para purificar el ARNm de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Antes de eluir, el etanol debe secarse para evitar la citotoxicidad, y el ARNm debe almacenarse a -80 °C si no se usa inmediatamente.
2. Preparación de capilares de vidrio de microinyección
- Configure el sistema de extracción de micropipetas y precaliente durante al menos 30 minutos.
- Realice una prueba de rampa para determinar el valor calorífico necesario para fundir los capilares de vidrio de borosilicato (con 1 mm de diámetro exterior y 0,58 mm de diámetro interior) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Seleccione un programa y haga clic en el número del teclado para introducir los valores de los parámetros. Establezca los siguientes parámetros para tirar de los capilares de vidrio: calor = valor de prueba de rampa, tracción = 50, velocidad = 100, tiempo = 50 y presión = 30.
- Instale el tubo capilar, asegurándose de que esté en la ranura. Presione PULL START/STOP para ejecutar el programa.
- Conserve los capilares tirados insertándolos en espuma que contenga huecos, manteniendo la aguja suspendida.
3. Microinyección de la mezcla de ARNm de zSpRY-ABE8e y ARNg de EE en embriones de pez cebra
- Instale tanques de cría la noche antes de la inyección. Inserte un divisor, coloque dos hembras y un macho de pez cebra de cepa AB (3-18 meses de edad) en cada tanque y cubra con la tapa. Consulte las publicaciones anteriores para las distinciones de género39.
NOTA: Para obtener más embriones, seleccione peces que no hayan estado criando durante al menos 1 semana. - A la mañana siguiente antes de la inyección, descongele el ARNm de zSpRY-ABE8e y el ARNg de EE en hielo. Mezclar el ARNm y el ARNg hasta concentraciones finales de 400 ng/μL y 200 ng/μL, respectivamente.
- Realice todo el procedimiento en hielo utilizando puntas y tubos sin RNasa, y manéjelo con guantes.
- Configure el microinyector neumático. Cierre la válvula de presión parcial de la bomba de aire y abra primero la válvula principal, desenrosque el cilindro de gas y ajuste la presión de la válvula de presión parcial a 0.2 MPa / 29 psi.
- Encienda el microinyector neumático, ajuste el modo a TIMER y ajuste el valor de presión del parámetro inicial a 20,0 psi y el valor del TIMER a 0,040 s.
- Use pinzas finas para romper cuidadosamente las agujas de los capilares de vidrio tirado bajo un microscopio estereoscópico, asegurándose de que las agujas se corten en ángulo para facilitar la perforación del corion y el óvulo.
NOTA: El punto de rotura de la aguja debe estar en el lugar correcto y ser lo suficientemente fuerte como para perforar el huevo, pero lo suficientemente delgado como para minimizar el daño al huevo. - Añadir la mezcla de zSpRY-ABE8e mRNA y gRNA a la punta de un capilar de vidrio utilizando una punta de pipeta microloader, evitando burbujas en el capilar. Conecte la aguja al micromanipulador y configure la presión y el valor de TEMPORIZADOR del inyector para garantizar que se produzcan 2 nL de mezcla por inyección utilizando una microtapa.
- Desenchufe los divisores de los tanques de reproducción y permita que los peces se reproduzcan durante 10-15 minutos. Recoja los óvulos usando un colador y examine la etapa celular y la calidad de los huevos bajo un microscopio estereoscópico. Seleccione los huevos en el estado de celda única para la inyección para mejorar la eficiencia de edición.
- Forre los huevos en una placa de inyección de agarosa al 1,5% e inyecte 2 nL de la mezcla en la célula, no en la yema, de los embriones bajo un microscopio para mejorar la eficiencia de edición. Retener al menos 15 huevos como grupo de control.
- Use 1x tampón E3 para recolectar los huevos en placas de Petri y colóquelos en una incubadora a 28 ° C. Retire los huevos muertos y cambie el tampón de cultivo cada 12 h hasta 48 horas después de la fertilización (hpf).
4. Análisis de eficiencia de la edición base con EditR
- A 48 hpf, recolecte tres grupos de seis embriones inyectados seleccionados al azar y seis embriones de control seleccionados al azar en tubos de PCR, respectivamente. Utilice una pipeta para aspirar el tampón E3 residual.
- Añadir 40 μL de NaOH de 50 mM en los tubos de PCR. Poner los tubos en un baño metálico a 95 °C durante 20 min, y luego vórtice durante 15 s.
- Añadir 4 μL de 1 M Tris· HCl (pH 8.0) en cada tubo para neutralizar el NaOH. Centrifugar brevemente a 2.000 x g durante 10 s a temperatura ambiente para eliminar las gotas de la pared del tubo. Recoger el sobrenadante en nuevos tubos de PCR y almacenarlos a -20 °C.
- Diseñar cebadores apropiados aguas arriba y aguas abajo de los sitios objetivo de ARNg. Utilice 1 μL del sobrenadante anterior como plantilla para las reacciones de PCR de volumen de 50 μL. Los cebadores utilizados para la PCR en este estudio se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.
- Realizar una electroforesis en gel de agarosa de ADN para asegurar bandas correctas y específicas, seguida de la secuenciación de Sanger como se describió anteriormente40.
- Analizar los datos de secuenciación de Sanger con el programa EditR (1.0.10)41.
- Cargue el archivo de secuenciación (formato ab1) en el cuadro "Cargar archivo .ab1".
- Introduzca la secuencia de ARNg de 20 pb en orientación 5′-3′ en el cuadro "Introducir secuencia de ARNg".
- Abra el archivo de secuenciación (formato ab1) y confirme las posiciones base donde comienza y termina la secuencia de ARNg de 20 pb. Introduzca la posición base correspondiente en los cuadros "5′ inicio" y "3′ final".
- Haga clic en Edición prevista para obtener la eficiencia de edición base. Compruebe la calidad de los datos de secuenciación cerca de la secuencia diana de ARNg para evitar picos o indeles desordenados.
NOTA: En general, los picos desordenados se pueden eliminar eficazmente ajustando la temperatura de recocido de PCR.
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Representative Results
Se ha descrito que la mutación de TSR2 causa anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aquí, se construyó un modelo de pez cebra DBA con una mutación tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. La adenina del codón de inicio del pez cebra tsr2 se convirtió con éxito en guanina utilizando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
El análisis EditR de los resultados de la secuenciación de Sanger mostró que había una superposición A/G en la base de adenina del codón de inicio tsr2 (Figura 4).
Después de que los fundadores de F0 se aparearon con un adulto mutante heterocigoto tsr2 generado previamente, los fenotipos embrionarios se observaron a los 2 días posteriores a la fertilización (dpf) bajo el microscopio. Varios embriones exhibieron un fenotipo de ojos más pequeños y un pericardio hinchado en comparación con los controles (Figura 5). Los embriones fueron anestesiados con tricocaína al 0,03%, fijados en metilcelulosa al 4% y fotografiados.
Figura 1: Diagrama esquemático de la secuencia y estructura secundaria del ARNg EE cargado en la proteína zSpRY-ABE8e. Los nucleótidos modificados químicamente están marcados con estrellas negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático de la estructura de ARNm de zSpRY-ABE8e que contiene TadA8e optimizado para codones (zTadA8e) y SpRYCas9 optimizado para codones (zSpRYCas9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama esquemático de la mutación del pez cebra tsr2 (M1V) usando zSpRY-ABE8e. Las secuencias PAM se resaltan en rojo, las bases editadas se resaltan en azul y los aminoácidos objetivo están en negrita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados del cromatograma de secuenciación de la mutación tsr2 (M1V) del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e. El eje x representa la secuencia de bases, el eje y representa la altura del pico y la base editada se indica con una punta de flecha roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Fenotipo de los embriones tsr2 (M1V) a 2 dpf en comparación con los controles. (A,C) La vista lateral y (B,D) vista dorsal de (A,B) pez cebra de tipo salvaje AB y embriones (C,D) tsr2 (M1V) a 2 dpf. La punta de flecha roja en C indica hinchazón pericárdica. El marco rojo y el diámetro reflejan el tamaño del ojo. Barra de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla suplementaria 1: Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este protocolo describe la construcción de un modelo de enfermedad del pez cebra utilizando el editor base zSpRY-ABE8e. En comparación con la vía HDR tradicional para la sustitución de bases, este protocolo puede lograr una edición de base más eficiente y reducir la aparición de indeles. Al mismo tiempo, este protocolo implica la implementación de la estrategia de eliminación de genes i-Silence recientemente propuesta en el pez cebra. En conjunto, zSpRY-ABE8e mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en la investigación de enfermedades.
Los efectos fuera del objetivo son un problema común en los sistemas CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta la restricción sin PAM, el efecto fuera del objetivo de zSpRY-ABE8e puede ser mayor, incluso si no se encontró un objetivo significativo fuera del objetivo en un estudio previo que incluyó la focalización tsr2 18. Afortunadamente, este problema puede evitarse mediante estrictos estándares de diseño de ARNg, que aseguran que solo una secuencia del genoma coincida exactamente con el ARNg con PAM y mantengan el número total de sitios fuera del objetivo previstos al mínimo. Además, un estudio ha demostrado que la inyección de ribonucleoproteína (RNP) y ARNg reduce la probabilidad fuera del objetivo en comparación con la inyección de ARNm y ARNg43. Además, la modificación del ARNg y Cas9 también puede reducir los efectos fuera del objetivo44,45. En el pez cebra, también se pueden examinar múltiples generaciones de reproducción para detectar los fenotipos objetivo para obtener modelos animales con bajos efectos fuera del objetivo.
Todavía hay algunas limitaciones en este protocolo. Aunque zSpRY-ABE8e no tiene restricción de PAM, todavía exhibe preferencia PAM, con NRN preferido a NYN en pez cebra. Además, el ABE solo puede implementar dos tipos de sustitución de bases, lo que significa que solo es aplicable a la construcción de modelos parciales. Todavía se necesitan desarrollar más editores de base para implementar las sustituciones de base restantes en el pez cebra.
En conclusión, este protocolo proporciona una guía detallada para el uso del editor de base única zSpRY-ABE8e en pez cebra. Proporciona un método factible y eficiente para construir modelos precisos de la enfermedad del pez cebra, ampliando la aplicación de modelos de pez cebra en estudios de patogénesis y tratamiento de enfermedades relacionadas con SNV.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación y Desarrollo del Área Clave de la Provincia de Guangdong (2019B030335001), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFE0106700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070819, 31970782) y el Programa del Fondo de Investigación del Laboratorio Provincial Clave de Biología Patogénica y Epidemiología para Animales Acuáticos Económicos de Guangdong (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
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