Summary
Этот протокол описывает, как выполнить эффективное редактирование аденинового основания без ограничения PAM для построения точной модели болезни рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e.
Abstract
Технология CRISPR/Cas9 повысила ценность рыбок данио-рерио для моделирования генетических заболеваний человека, изучения патогенеза заболеваний и скрининга лекарств, но ограничения смежных мотивов протоспейсеров (PAM) являются основным препятствием для создания точных животных моделей генетических нарушений человека, вызванных однонуклеотидными вариантами (SNV). До сих пор некоторые варианты SpCas9 с широкой совместимостью с PAM показали эффективность у рыбок данио. Применение оптимизированного SpRY-опосредованного редактора адениновых оснований (ABE), zSpRY-ABE8e и синтетически модифицированной гРНК у рыбок данио-рерио позволило эффективно конформировать аденин-гуаниновое основание без ограничения PAM. Здесь описан протокол для эффективного редактирования адениновых оснований без ограничения PAM у рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e. Путем введения смеси мРНК zSpRY-ABE8e и синтетически модифицированной гРНК эмбрионам рыбок данио-рерио была построена модель болезни рыбок данио-рерио с точной мутацией, которая имитировала патогенный сайт фактора созревания рибосомы TSR2 (tsr2). Этот метод является ценным инструментом для создания точных моделей заболеваний для изучения механизмов и методов лечения заболеваний.
Introduction
Однонуклеотидные варианты (SNV), вызывающие миссенсовые или нонсенсовые мутации, являются наиболее распространенным источником мутаций в геноме человека1. Чтобы определить, является ли конкретная SNV патогенной, и пролить свет на ее патогенез, требуются точные модели на животных2. Рыбки данио-рерио являются хорошими моделями болезней человека, демонстрируя высокую степень физиологической и генетической гомологии с людьми, короткий цикл развития и сильную репродуктивную способность, что выгодно для исследования патогенных характеристик и механизмов, а также скрининга лекарств3.
Кластерная система коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas9 с регулярным интервалом широко применяется при редактировании генома различных видов, включая рыбок данио-рерио4. Под руководством гРНК система CRISPR/Cas9 может генерировать двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) на целевом участке, что затем позволяет заменять одно основание путем рекомбинации целевого сайта с донорскими матрицами ДНК через путь репарации, направленной на гомологию (HDR). Однако эффективность этого метода замещения оснований довольно низкая, поскольку процесс репарации клеточной ДНК в основном осуществляется путем негомологичного соединения концов (NHEJ), который обычно сопровождается мутациями вставки и делеции (индел)5. К счастью, технология редактирования одной базы на основе CRISPR/Cas9 значительно облегчает эту проблему за счет использования базовых редакторов, которые обеспечивают более эффективное редактирование одной базы без индуцирования DSB. Два основных класса редакторов оснований, редакторы адениновых оснований (ABE) и редакторы цитозиновых оснований (CBE), были разработаны для реализации редактирования с заменой оснований для A· T в G· C и C·G в T· А, соответственно 6,7,8,9,10,11. Эти четыре типа замещения оснований охватывают 30% патогенных вариантов человека12. Сообщалось, что оба класса базовых редакторов, включая PmCDA1, систему BE, CBE4max, ABE7.10 и ABE8e, работают с рыбками данио, причем особенно сообщается, что BE4max и ABE8e достигают высокой активности редактирования 13,14,15,16,17,18,19.
Белки Cas9 различных видов, включая Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и S. canis, были реализованы при редактировании генов рыбок данио, при этом наиболее широко используется Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)20,21,22,23. Тем не менее, SpCas9 может распознавать целевые сайты только с примыкающим к NGG протоспейсером мотивом (PAM), что ограничивает его редактируемый диапазон и может привести к тому, что подходящая последовательность не будет найдена вблизи патогенного сайта, представляющегоинтерес 24. Чтобы расширить целевой диапазон, было разработано множество вариантов SpCas9 для распознавания различных PAM посредством направленной эволюции и структурно-ориентированного проектирования. Тем не менее, немногие варианты эффективны для животных, особенно для рыбок данио, что ограничивает применение рыбок данио-рерио в исследованиях заболеваний, связанных с SNV 25,26,27,28. В последнее время сообщалось, что два варианта SpCas9, SpG и SpRY с менее строгими ограничениями PAM (NGN для SpG и NNN для SpRY с более высоким предпочтением NRN, чем NYN), проявляют высокую активность редактирования в клетках и растениях человека 29,30,31,32. Впоследствии сообщалось, что SpG и SpRY, а также ряд их опосредованных базовых редакторов, таких как SpRY-опосредованные CBE и SpRY-опосредованные ABE, также работают с рыбками данио, что расширит применение моделей рыбок данио-рерио в механистическом исследовании и скрининге лекарств заболеваний, связанных с SNV 18,33,34,35. Кроме того, i-Silence был предложен в качестве эффективной и точной стратегии нокаута генов посредством ABE-опосредованного преобразования стартового кодона из ATG в GTG или ACG36. Комбинация стратегии i-Silence и SpRY-опосредованного базового редактора zSpRY-ABE8e обеспечивает новый метод моделирования заболеваний18. Этот протокол демонстрирует, как выполнять редактирование генов с использованием zSpRY-ABE8e у рыбок данио-рерио для построения модели tsr2 (M1V) с использованием стратегии i-Silence. Была оценена и проанализирована эффективность редактирования и фенотипы, которые появляются в моделях рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию Южно-Китайского педагогического университета.
1. Получение синтетически модифицированной гРНК и мРНК zSpRY-ABE8e
- Дизайн гРНК в соответствии с предыдущими публикациями37,38.
- Предпочтительно выберите NRN в качестве последовательности PAM, так как zSpRY-ABE8e показывает более высокое предпочтение NRN PAM, чем NYN PAM (где R — A или G, а Y — C или T)18. Убедитесь, что целевой адениновый нуклеотид находится в высокоактивном окне редактирования (с третьего по девятый нуклеотид вдоль протоспейсера).
- Закажите сгРНК EasyEdit (EE гРНК), модифицированную 2′-O-метил-3′-фосфоротиоатом (MS) на обоих концах (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭЭ гРНК следует растворять в воде, не содержащей РНКазы, и хранить при температуре -80 °C. - Линеаризируйте плазмиду zSpRY-ABE8e18.
- Линеаризируют 6 мкг плазмиды ферментом XbaI (таблица материалов) в металлической ванне при 37 °C в течение 3 ч.
- Очистите линеаризованную плазмиду с помощью набора для очистки ДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
- Транскрибируйте мРНК с помощью набора для транскрипции in vitro (Таблица материалов).
- Транскрибируйте мРНК zSpRY-ABE8e с линеаризованной плазмидой в качестве шаблона в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции, связанные с мРНК и гРНК, требуют использования лабораторных принадлежностей, не содержащих РНКазы.
- Транскрибируйте мРНК zSpRY-ABE8e с линеаризованной плазмидой в качестве шаблона в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте набор для очистки РНК (таблица материалов) для очистки мРНК в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед элюированием этанол необходимо высушить, чтобы избежать цитотоксичности, а мРНК следует хранить при -80 ° C, если она не используется немедленно.
2. Подготовка стеклянных капилляров для микроинъекций
- Настройте систему съемников микропипеток и разогрейте ее не менее 30 минут.
- Запустите испытание на рампе, чтобы определить теплотворную способность, необходимую для плавления капилляров боросиликатного стекла (с наружным диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,58 мм) в соответствии с инструкциями производителя.
- Выберите программу и нажмите на цифру на клавиатуре, чтобы ввести значения параметров. Установите следующие параметры для вытягивания стеклянных капилляров: тепло = испытательное значение рампы, тяговое напряжение = 50, скорость = 100, время = 50 и давление = 30.
- Установите капиллярную трубку, убедившись, что она находится в канавке. Нажмите PULL START/STOP, чтобы запустить программу.
- Сохраните вытянутые капилляры, вставив их в пену, содержащую зазоры, удерживая иглу во взвешенном состоянии.
3. Микроинъекция смеси мРНК zSpRY-ABE8e и гРНК EE в эмбрионы рыбок данио-рерио
- Установите резервуары для разведения в ночь перед инъекцией. Вставьте разделитель, поместите двух самок и одного самца рыбок данио-рерио (3-18 месяцев) в каждый резервуар и накройте крышкой. Сведения о гендерных различиях см. в предыдущих публикациях39.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить больше эмбрионов, выберите рыбу, которая не размножалась в течение как минимум 1 недели. - На следующее утро перед инъекцией разморозьте мРНК zSpRY-ABE8e и гРНК EE на льду. Смешайте мРНК и гРНК до конечных концентраций 400 нг/мкл и 200 нг/мкл соответственно.
- Выполняйте всю процедуру на льду, используя наконечники и трубки, не содержащие РНКазы, и обрабатывайте в перчатках.
- Настройте пневматический микроинжектор. Закройте клапан парциального давления воздушного насоса и сначала откройте главный клапан, открутите газовый баллон и отрегулируйте давление клапана парциального давления до 0.2 МПа / 29 фунтов на квадратный дюйм.
- Включите пневматический микроинжектор, установите режим на ТАЙМЕР и отрегулируйте начальное значение давления параметра на 20.0 фунтов на квадратный дюйм и значение ТАЙМЕРА на 0.040 с.
- Используйте тонкие щипцы, чтобы осторожно сломать иглы вытянутых стеклянных капилляров под стереомикроскопом, убедившись, что иглы разрезаны под углом, чтобы облегчить прокалывание хориона и яйцеклетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точка разрыва иглы должна находиться в нужном месте и быть достаточно прочной, чтобы проткнуть яйцо, но при этом достаточно тонкой, чтобы свести к минимуму повреждение яйца. - Добавьте смесь мРНК и гРНК zSpRY-ABE8e к кончику стеклянного капилляра с помощью наконечника пипетки микрозагрузчика, избегая пузырьков в капилляре. Прикрепите иглу к микроманипулятору и настройте давление и значение таймера инжектора, чтобы обеспечить производство 2 нл смеси за инъекцию с использованием микроколпачка.
- Отключите разделители резервуаров для разведения и дайте рыбе размножиться в течение 10-15 минут. Соберите яйца с помощью ситечка и исследуйте стадию и качество клеток под стереомикроскопом. Выберите яйцеклетки в одноклеточном состоянии для инъекции, чтобы повысить эффективность редактирования.
- Выложите яйца на 1,5% пластину для инъекций агарозы и введите 2 нл смеси в клетку, а не в желток, эмбрионов под микроскопом, чтобы повысить эффективность редактирования. Сохранить не менее 15 яиц в качестве контрольной группы.
- Используйте 1x буфер E3 для сбора яиц в чашки Петри и поместите их в инкубатор при температуре 28 ° C. Удалите мертвые яйца и меняйте культуральный буфер каждые 12 часов до 48 часов после оплодотворения (hpf).
4. Анализ эффективности редактирования базы с помощью EditR
- При 48 hpf соберите три пула из шести случайно выбранных инъецированных эмбрионов и шести случайно выбранных контрольных эмбрионов в ПЦР-пробирки соответственно. Используйте пипетку для аспирации остаточного буфера E3.
- Добавьте 40 мкл 50 мМ NaOH в пробирки для ПЦР. Поместите трубки в металлическую ванну при температуре 95 °C на 20 мин, а затем встряхните в течение 15 с.
- Добавьте 4 мкл 1 М Трис· HCl (рН 8,0) в каждую пробирку для нейтрализации NaOH. Кратковременно центрифугу при 2000 x g в течение 10 с при комнатной температуре, чтобы удалить капли со стенки пробирки. Соберите надосадочную жидкость в новые пробирки для ПЦР и храните их при температуре -20 °C.
- Разработайте соответствующие праймеры выше и ниже по течению от целевых участков гРНК. Используйте 1 мкл вышеуказанного надосадочного продукта в качестве матрицы для реакций ПЦР объемом 50 мкл. Праймеры, используемые для ПЦР в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 1.
- Проведите электрофорез в ДНК-агарозном геле, чтобы обеспечить правильные и специфические полосы, с последующим секвенированием по Сэнгеру, как описано ранее40.
- Проанализируйте данные секвенирования Сэнгера с помощью программы EditR (1.0.10)41.
- Загрузите файл виртуализации (формат ab1) в поле «Загрузить файл .ab1».
- Введите последовательность гРНК 20.н. в ориентации 5′-3′ в поле «Введите последовательность гРНК».
- Откройте файл секвенирования (формат ab1) и подтвердите базовые позиции, где начинается и заканчивается последовательность гРНК 20.н. Введите соответствующее базовое положение в поля «5′ начало» и «3′ конец».
- Нажмите « Прогнозируемое редактирование », чтобы получить базовую эффективность редактирования. Проверьте качество данных секвенирования вблизи последовательности мишени гРНК, чтобы избежать беспорядочных пиков или инделов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, беспорядочные пики можно эффективно удалить, отрегулировав температуру отжига ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сообщалось, что мутация TSR2 вызывает анемию Даймонда Блэкфана (DBA)42. Здесь была построена модель рыбок данио-рерио DBA с мутацией tsr2 (M1V) с использованием стратегии i-Silence. Аденин стартового кодона рыбок данио-рерио tsr2 был успешно преобразован в гуанин с помощью zSpRY-ABE8e (рис. 3).
Анализ EditR результатов секвенирования Сэнгера показал, что в адениновом основании стартового кодона tsr2 было перекрытие A/G (рис. 4).
После того, как основатели F0 были спарены с ранее сгенерированным гетерозиготным мутантным взрослым человеком tsr2 , фенотипы эмбриона наблюдались через 2 дня после оплодотворения (DPF) под микроскопом. Несколько эмбрионов показали фенотип меньших глаз и опухший перикард по сравнению с контрольной группой (рис. 5). Эмбрионы обезболивали 0,03% трикаина, фиксировали на 4% метилцеллюлозе и фотографировали.
Рисунок 1: Принципиальная схема последовательности и вторичной структуры гРНК EE, загруженной в белок zSpRY-ABE8e. Химически модифицированные нуклеотиды помечены черными звездами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Принципиальная схема структуры мРНК zSpRY-ABE8e, содержащей кодон-оптимизированный TadA8e (zTadA8e) и кодон-оптимизированный SpRYCas9 (zSpRYCas9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Принципиальная схема мутации рыбок данио-рерио tsr2 (M1V) с использованием zSpRY-ABE8e. Последовательности PAM выделены красным цветом, отредактированные основания выделены синим, а целевые аминокислоты выделены жирным шрифтом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Результаты секвенирования хроматограммы мутации tsr2 (M1V) рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e. Ось X представляет собой базовую последовательность, ось Y представляет пиковую высоту, а отредактированная база обозначена красной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Фенотип эмбрионов tsr2 (M1V) при 2 dpf по сравнению с контрольной группой. (А,С) Вид сбоку и (B,D) дорсальный вид (A,B) рыбок данио-рерио дикого типа и эмбрионов (C,D) tsr2 (M1V) при 2 dpf. Красный наконечник стрелки в C указывает на отек перикарда. Красная рамка и диаметр отражают размер глаза. Масштабная линейка: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описано построение модели болезни рыбок данио-рерио с использованием базового редактора zSpRY-ABE8e. По сравнению с традиционным путем HDR для замены базы, этот протокол может обеспечить более эффективное редактирование базы и уменьшить количество инделов. В то же время этот протокол включает в себя реализацию недавно предложенной стратегии нокаута гена i-Silence у рыбок данио. Взятые вместе, zSpRY-ABE8e расширит применение моделей рыбок данио-рерио в исследованиях заболеваний.
Нецелевые эффекты являются распространенной проблемой в системах CRISPR/Cas9. Учитывая ограничение без PAM, нецелевой эффект zSpRY-ABE8e может быть выше, даже если в предыдущем исследовании, включая tsr2, нацеленный на18, не было обнаружено значительного нецелевого эффекта. К счастью, этой проблемы можно избежать с помощью строгих стандартов проектирования гРНК, которые гарантируют, что только одна последовательность генома точно соответствует гРНК с PAM, и сводят к минимуму общее количество прогнозируемых нецелевых сайтов. Кроме того, исследование показало, что инъекция рибонуклеопротеина (РНП) и гРНК снижает вероятность нецелевого выброса по сравнению с инъекцией мРНК и гРНК43. Кроме того, модификация гРНК и Cas9 также может уменьшить нецелевые эффекты44,45. У рыбок данио-рерио несколько поколений размножения также могут быть проверены на целевые фенотипы, чтобы получить модели животных с низкими нецелевыми эффектами.
В этом протоколе все еще есть некоторые ограничения. Хотя zSpRY-ABE8e не имеет ограничений PAM, он по-прежнему демонстрирует предпочтение PAM, при этом NRN предпочтительнее NYN у рыбок данио. Кроме того, ABE может реализовать только два типа подстановки базы, что означает, что он применим только к построению частичных моделей. Еще предстоит разработать дополнительные базовые редакторы для реализации оставшихся базовых замен в рыбках данио.
В заключение, этот протокол содержит подробное руководство по использованию однобазового редактора zSpRY-ABE8e у рыбок данио. Он обеспечивает осуществимый и эффективный метод построения точных моделей болезней рыбок данио, расширяя применение моделей рыбок данио-рерио в исследованиях патогенеза и лечения заболеваний, связанных с SNV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Барбару Гарберс, доктора философии из Liwen Bianji (Edanz), за редактирование английского текста черновика этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой исследований и разработок в ключевых областях провинции Гуандун (2019B030335001), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2019YFE0106700), Национальным фондом естественных наук Китая (32070819, 31970782) и Программой исследовательского фонда Ключевой лаборатории патогенной биологии и эпидемиологии водных экономических животных провинции Гуандун (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
