Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64977
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 4, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير فعال لقاعدة الأدينين دون قيود PAM لبناء نموذج دقيق لمرض الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e.

Abstract

زادت تقنية CRISPR / Cas9 من قيمة أسماك الزرد لنمذجة الأمراض الوراثية البشرية ، ودراسة التسبب في الأمراض ، وفحص الأدوية ، لكن قيود الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) تشكل عقبة رئيسية أمام إنشاء نماذج حيوانية دقيقة للاضطرابات الوراثية البشرية الناجمة عن متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs). حتى الآن ، أظهرت بعض متغيرات SpCas9 ذات التوافق الواسع مع PAM كفاءة في الزرد. أتاح تطبيق محرر قاعدة الأدينين المحسن بوساطة SpRY (ABE) ، zSpRY-ABE8e ، و gRNA المعدل صناعيا في الزرد تحويل قاعدة الأدينين والجوانين بكفاءة دون قيود PAM. الموصوف هنا هو بروتوكول لتحرير قاعدة الأدينين بكفاءة دون قيود PAM في الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e. عن طريق حقن خليط من zSpRY-ABE8e mRNA و gRNA المعدل صناعيا في أجنة الزرد ، تم بناء نموذج مرض الزرد مع طفرة دقيقة تحاكي موقعا مسببا للأمراض لعامل نضج الريبوسوم TSR2 (tsr2). توفر هذه الطريقة أداة قيمة لإنشاء نماذج دقيقة للأمراض لدراسة آليات المرض والعلاجات.

Introduction

المتغيرات أحادية النوكليوتيدات (SNVs) التي تسبب طفرات خاطئة أو هراء هي المصدر الأكثر شيوعا للطفرات في الجينوم البشري1. لتحديد ما إذا كان SNV معين مسببا للأمراض ، ولإلقاء الضوء على التسبب فيه ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية دقيقة2. الزرد هي نماذج جيدة للأمراض البشرية ، وتظهر درجة عالية من التماثل الفسيولوجي والجيني مع البشر ، ودورة نمو قصيرة ، وقدرة إنجابية قوية ، وهو أمر مفيد للبحث في الخصائص والآليات المسببة للأمراض ، وكذلك فحص الأدوية3.

تم تطبيق نظام التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas9 على نطاق واسع في تحرير الجينوم لمختلف الأنواع ، بما في ذلك الزرد4. مع توجيه gRNA ، يمكن لنظام CRISPR / Cas9 توليد فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل (DSBs) في الموقع المستهدف ، والتي تسمح بعد ذلك باستبدال قاعدة واحدة من خلال إعادة تركيب الموقع المستهدف مع قوالب الحمض النووي للمتبرع عبر مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). ومع ذلك ، فإن كفاءة طريقة استبدال القاعدة هذه منخفضة جدا حيث يتم تنفيذ عملية إصلاح الحمض النووي الخلوي بشكل أساسي من خلال مسار الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والذي عادة ما يكون مصحوبا بطفرات الإدراج والحذف (indel)5. لحسن الحظ ، تعمل تقنية التحرير أحادية القاعدة المستندة إلى CRISPR / Cas9 على تخفيف هذه المشكلة بشكل كبير باستخدام برامج التحرير الأساسية ، والتي تتيح تحريرا أكثر كفاءة لقاعدة واحدة دون حث DSBs. تم تطوير فئتين رئيسيتين من المحررين الأساسيين ، محرري قاعدة الأدينين (ABEs) ومحرري قاعدة السيتوزين (CBEs) ، لتنفيذ تحرير استبدال القاعدة ل A · تي إلى ز· C و C · G إلى T · أ ، على التوالي6،7،8،9،10،11. تغطي هذه الأنواع الأربعة من بدائل القاعدة 30٪ من المتغيرات المسببة للأمراض البشرية12. تم الإبلاغ عن أن كلا الفئتين من المحررين الأساسيين ، بما في ذلك PmCDA1 ونظام BE و CBE4max و ABE7.10 و ABE8e ، يعملان في الزرد ، مع الإبلاغ عن BE4max و ABE8e بشكل خاص لتحقيق نشاط تحرير مرتفع 13،14،15،16،17،18،19.

تم تنفيذ بروتينات Cas9 من أنواع مختلفة ، بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية ، والمكورات العقدية المقيحة ، و S. canis ، في تحرير جينات الزرد ، مع استخدام العقدية المقيحة Cas9 (SpCas9) على نطاق واسع20،21،22،23. ومع ذلك ، يمكن ل SpCas9 التعرف فقط على المواقع المستهدفة ذات الشكل المجاور ل NGG protospacer (PAM) ، مما يحد من نطاقه القابل للتحرير ويمكن أن يؤدي إلى عدم العثور على تسلسل مناسب بالقرب من الموقع الممرض محل الاهتمام24. لتوسيع النطاق المستهدف ، تم تصميم مجموعة متنوعة من متغيرات SpCas9 للتعرف على PAMs المختلفة من خلال التطور الموجه والتصميم الموجه بالهيكل. ومع ذلك ، فإن القليل من المتغيرات فعالة في الحيوانات ، وخاصة في الزرد ، مما يحد من تطبيق الزرد في أبحاث الأمراض المرتبطة ب SNV25،26،27،28. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن نوعين مختلفين من SpCas9 و SpG و SpRY ، مع قيود PAM أقل صرامة (NGN ل SpG و NNN ل SpRY مع تفضيل أعلى ل NRN من NYN) لإظهار نشاط تحرير عالي في الخلايا البشرية والنباتات29،30،31،32. بعد ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن SpG و SpRY ، بالإضافة إلى عدد من محرري القاعدة بوساطة ، مثل CBEs بوساطة SpRY و ABEs بوساطة SpRY ، للعمل في الزرد ، مما سيعزز تطبيق نماذج الزرد في الدراسة الميكانيكية وفحص الأدوية للأمراض المرتبطة ب SNV18،33،34،35. علاوة على ذلك ، تم اقتراح i-Silence كاستراتيجية فعالة ودقيقة للضربة القاضية الجينية من خلال تحويل كودون البدء بوساطة ABE من ATG إلى GTG أو ACG36. يوفر الجمع بين استراتيجية i-Silence والمحرر الأساسي بوساطة SpRY zSpRY-ABE8e طريقة جديدة لنمذجة الأمراض18. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير الجينات باستخدام zSpRY-ABE8e في الزرد لبناء نموذج tsr2 (M1V) باستخدام استراتيجية i-Silence. تم تقييم وتحليل كفاءة التحرير والأنماط الظاهرية التي تظهر في نماذج الزرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة في الامتثال الصارم للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام بجامعة جنوب الصين للمعلمين.

1. تحضير gRNA المعدل صناعيا و zSpRY-ABE8e mRNA

  1. تصميم gRNA وفقا للمنشورات السابقة37,38.
    1. حدد NRN بشكل تفضيلي كتسلسل PAM ، حيث يظهر zSpRY-ABE8e تفضيلا أعلى ل NRN PAM من NYN PAM (حيث R هي A أو G ، و Y هي C أو T)18. تأكد من أن نيوكليوتيد الأدينين المستهدف موجود في نافذة التحرير النشطة للغاية (النوكليوتيدات الثالثة إلى التاسعة على طول الفاصل الأولي).
  2. اطلب EasyEdit sgRNA (EE gRNA) المعدل ب 2′-O-methyl-3′-phosphorothioate (MS) في كلا الطرفين (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب إذابة EE gRNA في ماء خال من RNase وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
  3. خطي zSpRY-ABE8e البلازميد18.
    1. خطي 6 ميكروغرام من البلازميد مع إنزيم XbaI (جدول المواد) في حمام معدني عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    2. تنقية البلازميد الخطي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بنسخ mRNA باستخدام مجموعة النسخ في المختبر (جدول المواد).
    1. قم بنسخ zSpRY-ABE8e mRNA باستخدام البلازميد الخطي كقالب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تتطلب جميع العمليات التي تنطوي على mRNA و gRNA استخدام لوازم مختبرية خالية من RNase.
  5. استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي (جدول المواد) لتنقية الحمض النووي الريبي المرسال وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قبل الاستخلاص ، يجب تجفيف الإيثانول لتجنب السمية الخلوية ، ويجب تخزين mRNA عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم استخدامه على الفور.

2. تحضير الشعيرات الدموية الزجاجية المجهرية

  1. قم بإعداد نظام مجتذب الماصة الدقيقة ، وقم بالتسخين المسبق لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  2. قم بإجراء اختبار منحدر لتحديد قيمة الحرارة اللازمة لإذابة الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (بقطر خارجي 1 مم وقطر داخلي 0.58 مم) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. حدد برنامجا ، وانقر فوق الرقم الموجود على لوحة المفاتيح لإدخال قيم المعلمات. اضبط المعلمات التالية لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية: الحرارة = قيمة اختبار المنحدر ، والسحب = 50 ، والسرعة = 100 ، والوقت = 50 ، والضغط = 30.
  4. تثبيت الأنبوب الشعري ، والتأكد من أنه في الأخدود. اضغط على PULL START / STOP لتشغيل البرنامج.
  5. الحفاظ على الشعيرات الدموية المسحوبة عن طريق إدخالها في رغوة تحتوي على فجوات ، مع إبقاء الإبرة معلقة.

3. الحقن المجهري لخليط zSpRY-ABE8e mRNA و EE gRNA في أجنة الزرد

  1. قم بإعداد خزانات تربية في الليلة السابقة للحقن. أدخل حاجزا ، ضع إناث وذكرا واحدا من سلالة الزرد AB (من 3 إلى 18 شهرا) في كل خزان ، وقم بتغطيته بالغطاء. يرجى الرجوع إلى المنشورات السابقة للاطلاع على الفروق بين الجنسين39.
    ملاحظة: للحصول على المزيد من الأجنة ، حدد الأسماك التي لم تتكاثر لمدة 1 أسبوع على الأقل.
  2. في صباح اليوم التالي قبل الحقن ، قم بإذابة zSpRY-ABE8e mRNA و EE gRNA على الجليد. امزج mRNA و gRNA إلى تركيزات نهائية تبلغ 400 نانوغرام / ميكرولتر و 200 نانوغرام / ميكرولتر ، على التوالي.
    1. نفذ الإجراء بأكمله على الجليد باستخدام أطراف وأنابيب خالية من RNase ، وتعامل مع القفازات.
  3. تكوين حاقن دقيق هوائي. أغلق صمام الضغط الجزئي لمضخة الهواء وافتح الصمام الرئيسي أولا ، وقم بفك أسطوانة الغاز ، واضبط ضغط صمام الضغط الجزئي على 0.2 ميجا باسكال / 29 رطل / بوصة مربعة.
    1. قم بتشغيل الحاقن الدقيق الهوائي ، واضبط الوضع على TIMER ، واضبط قيمة ضغط المعلمة الأولية على 20.0 رطل لكل بوصة مربعة وقيمة المؤقت على 0.040 ثانية.
  4. استخدم ملقط ناعم لكسر إبر الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة بعناية تحت المجهر المجسم ، مع التأكد من قطع الإبر بزاوية لتسهيل ثقب المشيم والبيضة.
    ملاحظة: يجب أن تكون نقطة كسر الإبرة في المكان المناسب وأن تكون قوية بما يكفي لاختراق البيضة ولكنها رقيقة بما يكفي لتقليل الضرر الذي يلحق بالبيضة.
  5. أضف خليط zSpRY-ABE8e mRNA و gRNA إلى طرف الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام طرف ماصة microloader ، وتجنب الفقاعات في الشعيرات الدموية. قم بتوصيل الإبرة بالمعالج الدقيق ، وقم بتكوين الضغط وقيمة TIMER للحاقن لضمان إنتاج 2 نانولتر من الخليط لكل حقنة باستخدام microcap.
  6. افصل فواصل أحواض التكاثر ، واترك الأسماك تتكاثر لمدة 10-15 دقيقة. اجمع البويضات باستخدام مصفاة ، وافحص مرحلة الخلية وجودة البويضات تحت المجهر المجسم. حدد البيض في حالة الخلية الواحدة للحقن لتحسين كفاءة التحرير.
  7. قم بتبطين البيض على طبق حقن الأغاروز بنسبة 1.5٪ ، وقم بحقن 2 نانولتر من الخليط في الخلية ، وليس صفار الأجنة ، تحت المجهر لتحسين كفاءة التحرير. احتفظ بما لا يقل عن 15 بيضة كمجموعة ضابطة.
  8. استخدم 1x E3 buffer لجمع البيض في أطباق بتري ، ووضعها في حاضنة عند 28 درجة مئوية. قم بإزالة البيض الميت ، وقم بتغيير مخزن المزارع كل 12 ساعة حتى 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF).

4. تحليل كفاءة التحرير الأساسي باستخدام EditR

  1. عند 48 hpf ، اجمع ثلاث مجموعات من ستة أجنة محقونة تم اختيارها عشوائيا وستة أجنة تحكم تم اختيارها عشوائيا في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل على التوالي. استخدم ماصة لشفط المخزن المؤقت E3 المتبقي.
  2. أضف 40 ميكرولتر من 50 mM NaOH في أنابيب PCR. ضع الأنابيب في حمام معدني على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم دوامة لمدة 15 ثانية.
  3. أضف 4 ميكرولتر من 1 متر تريس · حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) في كل أنبوب لتحييد هيدروكسيد الصوديوم. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 2000 × جم لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة لإزالة القطرات من جدار الأنبوب. اجمع المادة الطافية في أنابيب PCR جديدة ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. تصميم الاشعال المناسبة المنبع والمصب للمواقع المستهدفة gRNA. استخدم 1 ميكرولتر من المادة الطافية أعلاه كقالب لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم 50 ميكرولتر. يتم سرد البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1.
  5. قم بإجراء رحلان كهربائي لهلام الأغاروز DNA لضمان نطاقات صحيحة ومحددة ، متبوعا بتسلسل سانجر كما هو موضح سابقا40.
  6. قم بتحليل بيانات تسلسل Sanger باستخدام برنامج EditR (1.0.10)41.
    1. قم بتحميل ملف التسلسل (تنسيق ab1) في مربع "تحميل ملف .ab1".
    2. أدخل تسلسل gRNA 20 bp في اتجاه 5′-3 في مربع "إدخال تسلسل gRNA".
    3. افتح ملف التسلسل (تنسيق ab1) ، وقم بتأكيد المواضع الأساسية حيث يبدأ تسلسل gRNA 20 bp وينتهي. أدخل الموضع الأساسي المقابل في مربعي "5 ′ start" و "3 ′ end".
    4. انقر فوق التحرير المتوقع للحصول على كفاءة التحرير الأساسية. تحقق من جودة بيانات التسلسل بالقرب من تسلسل هدف gRNA لتجنب القمم أو الإندل غير المنضبط.
      ملاحظة: بشكل عام ، يمكن إزالة القمم غير المنظمة بشكل فعال عن طريق ضبط درجة حرارة التلدين PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الإبلاغ عن طفرة TSR2 لتسبب فقر الدم الماسي Blackfan (DBA) 42. هنا ، تم إنشاء نموذج DBA الزرد مع طفرة tsr2 (M1V) باستخدام استراتيجية i-Silence. تم تحويل الأدينين من كودون البداية من الزرد tsr2 بنجاح إلى الجوانين باستخدام zSpRY-ABE8e (الشكل 3).

أظهر تحليل EditR لنتائج تسلسل سانجر أن هناك تداخلا في A / G في قاعدة الأدينين لكودون بدء tsr2 (الشكل 4).

بعد تزاوج مؤسسي F0 مع شخص بالغ متحور متغير متجانس تم إنشاؤه سابقا من TSR2 ، لوحظت الأنماط الظاهرية للجنين في يومين بعد الإخصاب (dpf) تحت المجهر. أظهرت العديد من الأجنة نمطا ظاهريا للعيون الأصغر وتورم التامور مقارنة بالضوابط (الشكل 5). تم تخدير الأجنة بنسبة 0.03٪ تريكايين ، مثبتة على 4٪ ميثيل سلولوز ، وتصويرها.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للتسلسل والبنية الثانوية ل EE gRNA المحملة في بروتين zSpRY-ABE8e. يتم تمييز النيوكليوتيدات المعدلة كيميائيا بنجوم سوداء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لهيكل mRNA zSpRY-ABE8e الذي يحتوي على TadA8e المحسن للكودون (zTadA8e) و SpRYCas9 المحسن للكودون (zSpRYCas9). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: رسم تخطيطي لطفرة الزرد tsr2 (M1V) باستخدام zSpRY-ABE8e. يتم تمييز تسلسلات PAM باللون الأحمر ، ويتم تمييز القواعد المحررة باللون الأزرق ، والأحماض الأمينية المستهدفة بالخط العريض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تسلسل نتائج الكروماتوجرام لطفرة الزرد tsr2 (M1V) باستخدام zSpRY-ABE8e. يمثل المحور x تسلسل القاعدة ، ويمثل المحور y ارتفاع الذروة ، ويشار إلى القاعدة المحررة برأس سهم أحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: النمط الظاهري لأجنة tsr2 (M1V) عند 2 dpf مقارنة بالضوابط. (أ، ج) المنظر الجانبي و (B,D) المنظر الظهري ل (A,B) الزرد من النوع البري AB و (C,D) tsr2 (M1V) الأجنة عند 2 dpf. يشير رأس السهم الأحمر في C إلى تورم التامور. يعكس الإطار الأحمر والقطر حجم العين. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول بناء نموذج مرض الزرد باستخدام المحرر الأساسي zSpRY-ABE8e. بالمقارنة مع مسار HDR التقليدي لاستبدال القاعدة ، يمكن لهذا البروتوكول تحقيق تحرير أساسي أكثر كفاءة وتقليل حدوث indels. في الوقت نفسه ، يتضمن هذا البروتوكول تنفيذ استراتيجية الضربة القاضية الجينية i-Silence المقترحة مؤخرا في الزرد. مجتمعة ، سيعزز zSpRY-ABE8e تطبيق نماذج الزرد في أبحاث الأمراض.

تعد التأثيرات خارج الهدف مشكلة شائعة في أنظمة CRISPR / Cas9. بالنظر إلى التقييد الأقل ل PAM ، قد يكون التأثير خارج الهدف ل zSpRY-ABE8e أعلى ، حتى لو لم يتم العثور على هدف كبير خارج الهدف في دراسة سابقة بما في ذلك استهداف tsr2 18. لحسن الحظ ، يمكن تجنب هذه المشكلة من خلال معايير تصميم gRNA الصارمة ، والتي تضمن أن تسلسل جينوم واحد فقط يطابق gRNA مع PAM تماما ويحافظ على العدد الإجمالي للمواقع المتوقعة خارج الهدف إلى الحد الأدنى. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة أن حقن البروتين النووي الريبي (RNP) و gRNA يقلل من الاحتمال خارج الهدف مقارنة بحقن mRNA و gRNA43. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تعديل gRNA و Cas9 أيضا إلى تقليل التأثيرات خارج الهدف44,45. في الزرد ، يمكن أيضا فحص أجيال متعددة من التربية بحثا عن الأنماط الظاهرية المستهدفة للحصول على نماذج حيوانية ذات تأثيرات منخفضة خارج الهدف.

لا تزال هناك بعض القيود في هذا البروتوكول. على الرغم من أن zSpRY-ABE8e ليس له قيود PAM ، إلا أنه لا يزال يظهر تفضيل PAM ، مع تفضيل NRN على NYN في الزرد. علاوة على ذلك ، يمكن ل ABE تنفيذ نوعين فقط من استبدال القاعدة ، مما يعني أنه ينطبق فقط على بناء النماذج الجزئية. لا تزال هناك حاجة إلى تطوير المزيد من المحررين الأساسيين لتنفيذ البدائل الأساسية المتبقية في الزرد.

في الختام ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة لاستخدام محرر zSpRY-ABE8e أحادي القاعدة في الزرد. يوفر طريقة مجدية وفعالة لبناء نماذج دقيقة لمرض الزرد ، وتوسيع تطبيق نماذج الزرد في دراسات التسبب في الأمراض المرتبطة ب SNV وعلاجها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر باربرا جاربرز ، دكتوراه ، من Liwen Bianji (Edanz) لتحرير النص الإنجليزي لمسودة هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والتطوير في المنطقة الرئيسية لمقاطعة قوانغدونغ (2019B030335001) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFE0106700) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070819 ، 31970782) ، وبرنامج صندوق البحوث في مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للبيولوجيا المسببة للأمراض وعلم الأوبئة للحيوانات الاقتصادية المائية (PBEA2020YB05).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539 1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries  Harvard Apparatus BS4 30-0016
Cell culture dishes  Falcon 351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit Vazyme C115 Kit for Infusion clone 
Codon optimization service Sangon Biotech
Drummond Microcaps Drummond Microcaps P1299-1PAK Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service GenScript
Fine Forceps Fine Scientific Instrument 11254-20 Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument P-97 Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix Genstar A033-101 Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box TENLIN PRX-1000A Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512 Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips  Eppendorf 5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 Vazyme C214-01 Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector ZGene Biotech ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9 Addgene 46757
RNeasy FFPE kit  Qiagen 73504 Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular Sangon A100173-0500 NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope Olympus  SZX10 Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope CNOPTEC SZ650
T3 mMESSAGE Ambion AM1348 Kit for in vitro transcription 
TIANprep Mini Plasmid Kit TIANGEN DP103-03 Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit TIANGEN DP203-02 Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sangon A600194-0500 Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI New England Biolabs R0145S Restriction endonuclease used for plasmid linearization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
  2. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
  3. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  4. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  7. Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
  8. Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
  9. Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
  10. Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
  11. Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
  12. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
  13. Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
  14. Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
  15. Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
  17. Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
  18. Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
  19. Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
  20. Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
  21. Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
  22. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  23. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
  24. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  25. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  26. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  27. Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
  28. Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
  29. Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
  30. Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
  31. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
  32. Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
  33. Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
  34. Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
  35. Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
  36. Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
  37. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
  38. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  39. Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
  40. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  41. Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
  42. Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
  43. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  44. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  45. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).

Tags

التراجع، العدد 192،
تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y.,… More

Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y., Fei, J. F., Qin, W., Liu, Y. Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e. J. Vis. Exp. (192), e64977, doi:10.3791/64977 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter