Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64977
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 4, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

Abstract

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 הגדילה את ערכם של דגי זברה למידול מחלות גנטיות אנושיות, חקר פתוגנזה של מחלות וסינון תרופות, אך מגבלות המוטיב הסמוך של פרוטוספייסר (PAM) מהוות מכשול עיקרי ליצירת מודלים מדויקים של בעלי חיים של הפרעות גנטיות אנושיות הנגרמות על ידי גרסאות של נוקלאוטידים בודדים (SNVs). עד כה, כמה גרסאות SpCas9 עם תאימות PAM רחבה הראו יעילות בדגי זברה. היישום של עורך בסיס אדנין בתיווך SpRY (ABE), zSpRY-ABE8e, ו-gRNA שעבר שינוי סינתטי בדגי זברה איפשר המרה יעילה של בסיס אדנין-גואנין ללא הגבלת PAM. מתואר כאן פרוטוקול לעריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM בדגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e. על ידי הזרקת תערובת של zSpRY-ABE8e mRNA ו-gRNA מהונדס באופן סינתטי לעוברים של דגי זברה, נבנה מודל מחלת דגי זברה עם מוטציה מדויקת המדמה אתר פתוגני של גורם ההתבגרות של הריבוזום TSR2 (tsr2). שיטה זו מספקת כלי רב ערך לביסוס מודלים מדויקים של מחלות לחקר מנגנוני מחלה וטיפולים.

Introduction

וריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) הגורמים למוטציות שגויות או שטויות הם המקור הנפוץ ביותר למוטציות בגנום האנושי1. כדי לקבוע אם SNV מסוים הוא פתוגני, ולשפוך אור על הפתוגנזה שלו, נדרשים מודלים מדויקים של בעלי חיים2. דגי זברה הם מודלים טובים למחלות אנושיות, המציגים רמה גבוהה של הומולוגיה פיזיולוגית וגנטית עם בני אדם, מחזור התפתחותי קצר ויכולת רבייה חזקה, המהווה יתרון למחקר במאפיינים ומנגנונים פתוגניים, כמו גם לבדיקת תרופות3.

מערכת CRISPR/Cas9 (ראשי תיבות של Clustered regular interspaced short palindromic repeats) מיושמת באופן נרחב בעריכת גנום של מינים שונים, כולל דגי זברה4. בעזרת הנחיית gRNA, מערכת CRISPR/Cas9 יכולה ליצור שברים דו-גדיליים של DNA (DSB) באתר המטרה, אשר לאחר מכן מאפשרים החלפה של בסיס יחיד באמצעות שילוב מחדש של אתר המטרה עם תבניות DNA של תורם באמצעות מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). עם זאת, היעילות של שיטת החלפת בסיס זו נמוכה למדי מכיוון שתהליך תיקון הדנ"א התאי מתבצע בעיקר על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ), המלווה בדרך כלל במוטציות החדרה ומחיקה (indel)5. למרבה המזל, טכנולוגיית עריכה חד-בסיסית מבוססת CRISPR/Cas9 מקלה באופן משמעותי על בעיה זו באמצעות עורכי בסיס, המאפשרים עריכה יעילה יותר בבסיס יחיד מבלי לגרום ל-DSB. שני סוגים עיקריים של עורכי בסיס, עורכי בסיס אדנין (ABEs) ועורכי בסיס ציטוזין (CBEs), פותחו כדי ליישם עריכת החלפת בסיס עבור A· T עד G· C ו- C·G עד T· A, בהתאמה 6,7,8,9,10,11. ארבעת הסוגים האלה של תחליפי בסיס מכסים 30% מהגרסאות הפתוגניות האנושיות12. שני סוגי עורכי הבסיס, כולל PmCDA1, מערכת BE, CBE4max, ABE7.10 ו-ABE8e, דווחו כעובדים בדגי זברה, כאשר BE4max ו-ABE8e דווחו במיוחד כבעלי פעילות עריכה גבוהה 13,14,15,16,17,18,19.

חלבוני Cas9 ממינים שונים, כולל Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ו- S. canis, יושמו בעריכת גנים של דגי זברה, כאשר Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) נמצא בשימוש הנרחב ביותר20,21,22,23. עם זאת, SpCas9 יכול לזהות רק אתרי מטרה עם מוטיב סמוך של פרוטוספייסר NGG (PAM), אשר מגביל את טווח העריכה שלו ויכול לגרום לכך שלא יימצא רצף מתאים ליד האתר הפתוגני המעניין24. כדי להרחיב את טווח היעד, מגוון גרסאות SpCas9 תוכננו לזהות PAMs שונים באמצעות אבולוציה מכוונת ועיצוב מונחה מבנה. עם זאת, גרסאות מעטות יעילות בבעלי חיים, במיוחד בדגי זברה, מה שמגביל את היישום של דגי זברה במחקר מחלות הקשורות ל- SNV25,26,27,28. לאחרונה, דווח על שתי גרסאות של SpCas9, SpG ו- SpRY, עם מגבלות PAM פחות מחמירות (NGN עבור SpG ו- NNN עבור SpRY עם העדפה גבוהה יותר ל- NRN מאשר NYN) כמציגות פעילות עריכה גבוהה בתאים ובצמחים אנושיים 29,30,31,32. לאחר מכן, דווח כי SpG ו- SpRY, כמו גם מספר עורכי הבסיס המתווכים שלהם, כגון CBEs בתיווך SpRY ו- ABEs בתיווך SpRY, עובדים גם בדגי זברה, אשר ישפרו את היישום של מודלים של דגי זברה במחקר המכניסטי וסינון תרופות של מחלות הקשורות ל- SNV 18,33,34,35. יתר על כן, i-Silence הוצע כאסטרטגיה יעילה ומדויקת לנוקאאוט גנטי באמצעות המרת קודון התחלה בתיווך ABE מ-ATG ל-GTG או ACG36. השילוב של אסטרטגיית i-Silence ועורך הבסיס בתיווך SpRY zSpRY-ABE8e מספק שיטה חדשה למידול מחלות18. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע עריכה גנטית באמצעות zSpRY-ABE8e בדגי זברה כדי לבנות מודל tsr2 (M1V) באמצעות אסטרטגיית i-Silence. יעילות העריכה והפנוטיפים המופיעים במודלים של דגי זברה הוערכו ונותחו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נערך תוך ציות קפדני להנחיות ועדת הטיפול והשימוש של האוניברסיטה הרגילה של דרום סין.

1. הכנת gRNA מהונדס באופן סינתטי ו-zSpRY-ABE8e mRNA

  1. תכנון ה-gRNA על פי פרסומים קודמים37,38.
    1. העדיפו לבחור NRN כרצף PAM, שכן zSpRY-ABE8e מראה העדפה גבוהה יותר ל-NRN PAM מאשר NYN PAM (כאשר R הוא A או G, ו-Y הוא C או T)18. ודא שנוקלאוטיד המטרה אדנין נמצא בחלון העריכה הפעיל ביותר (נוקלאוטיד שלישי עד תשיעי לאורך הפרוטוספייסר).
  2. סדר EasyEdit sgRNA (EE gRNA) שונה עם 2′-O-methyl-3′-phosphorothioate (MS) בשני הקצוות (איור 1).
    הערה: יש להמיס את ה-EE gRNA במים נטולי RNase ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
  3. לינארית את zSpRY-ABE8e plasmid18.
    1. לינאריות 6 מיקרוגרם של פלסמיד עם אנזים XbaI (טבלה של חומרים) באמבט מתכת ב 37 ° C במשך 3 שעות.
    2. לטהר את הפלסמיד הלינארי באמצעות ערכת טיהור הדנ"א (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  4. תמלל את ה-mRNA באמצעות ערכת השעתוק במבחנה (Table of Materials).
    1. תמלל את zSpRY-ABE8e mRNA עם פלסמיד ליניארי כתבנית בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: כל הפעולות המערבות mRNA ו-gRNA דורשות שימוש בציוד מעבדה נטול RNase.
  5. השתמש בערכת טיהור RNA (רשימת חומרים) כדי לטהר את ה- mRNA בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: לפני הפליטה, יש לייבש את האתנול כדי למנוע ציטוטוקסיות, ויש לאחסן את ה-mRNA בטמפרטורה של -80°C אם לא משתמשים בו מיד.

2. הכנת נימי זכוכית מיקרו-הזרקה

  1. הגדירו את מערכת המושך מיקרופיפטה, וחממו מראש למשך 30 דקות לפחות.
  2. הפעל בדיקת רמפה כדי לקבוע את ערך החום הדרוש להמסת נימי זכוכית בורוסיליקט (בקוטר חיצוני של 1 מ"מ וקוטר פנימי של 0.58 מ"מ) בהתאם להוראות היצרן.
  3. בחר תוכנית ולחץ על המספר במקלדת כדי להזין את ערכי הפרמטרים. הגדר את הפרמטרים הבאים למשיכת נימי הזכוכית: חום = ערך בדיקת רמפה, משיכה = 50, מהירות = 100, זמן = 50 ולחץ = 30.
  4. התקן את צינור הנימים, וודא שהוא נמצא בחריץ. לחץ על PULL START/STOP כדי להפעיל את התוכנית.
  5. שמרו על הנימים שנמשכו על ידי הכנסתם לקצף המכיל רווחים, תוך שמירה על המחט תלויה.

3. מיקרו-הזרקה של תערובת zSpRY-ABE8e mRNA ו-EE gRNA לעוברים של דגי זברה

  1. הקימו מיכלי רבייה בלילה שלפני ההזרקה. הכניסו מחיצה, הניחו שתי נקבות וזכר אחד של דג זברה מזן AB (בן 3-18 חודשים) בכל מיכל, וכסו במכסה. עיין בפרסומים קודמים להבחנות מגדריות39.
    הערה: כדי להשיג עוברים נוספים, בחר דגים שלא התרבו במשך שבוע אחד לפחות.
  2. למחרת בבוקר לפני ההזרקה, הפשירו את zSpRY-ABE8e mRNA ו-EE gRNA על קרח. ערבבו את ה-mRNA וה-gRNA לריכוזים סופיים של 400 ננוגרם/מיקרוליטר ו-200 ננוגרם/מיקרוליטר, בהתאמה.
    1. בצע את כל ההליך על קרח באמצעות טיפים וצינורות ללא RNase, ולטפל עם כפפות.
  3. הגדר את המיקרו-מזרק הפנאומטי. סגור את שסתום הלחץ החלקי של משאבת האוויר ופתח תחילה את השסתום הראשי, פתח את בלון הגז וכוונן את הלחץ של שסתום הלחץ החלקי ל- 0.2 MPa/29 psi.
    1. הפעל את המיקרו-מזרק הפנאומטי, הגדר את המצב ל-TIMER והתאם את ערך לחץ הפרמטר הראשוני ל-20.0 psi ואת ערך TIMER ל-0.040 שניות.
  4. השתמש במלקחיים עדינים כדי לשבור בזהירות את המחטים של נימי הזכוכית שנמשכו תחת סטריאומיקרוסקופ, וודא שהמחטים נחתכות בזווית כדי להקל על פירסינג של הכוריון והביצה.
    הערה: נקודת השבירה של המחט צריכה להיות במקום הנכון ולהיות חזקה מספיק כדי לנקב את הביצה, אך דקה מספיק כדי למזער את הנזק לביצה.
  5. הוסף את התערובת של zSpRY-ABE8e mRNA ו- gRNA לקצה של נימי זכוכית באמצעות קצה פיפטה microloader, הימנעות בועות נימים. חבר את המחט למיקרומניפולטור, והגדר את הלחץ ואת ערך TIMER של המזרק כדי להבטיח 2 nL של תערובת מיוצר בכל הזרקה באמצעות microcap.
  6. נתקו את מחיצות מיכלי הרבייה, ואפשרו לדגים להתרבות במשך 10-15 דקות. אספו את הביצים באמצעות מסננת, ובחנו את שלב התא ואיכות הביצים תחת סטריאומיקרוסקופ. בחר את הביציות במצב תא יחיד להזרקה כדי לשפר את יעילות העריכה.
  7. מרפדים את הביציות על צלחת הזרקת אגרוז 1.5%, ומזריקים 2 nL של התערובת לתוך התא, לא החלמון, של העוברים תחת מיקרוסקופ כדי לשפר את יעילות העריכה. לשמור לפחות 15 ביציות כקבוצת הביקורת.
  8. השתמש 1x E3 חיץ לאסוף את הביצים בצלחות פטרי, ומניחים אותם באינקובטור ב 28 ° C. הסר את הביציות המתות, ושנה את מאגר התרבית כל 12 שעות עד 48 שעות לאחר ההפריה (HPF).

4. ניתוח יעילות של עריכת בסיס עם EditR

  1. ב 48 hpf, לאסוף שלושה מאגרים של שישה עוברים מוזרקים שנבחרו באופן אקראי ושישה עוברי ביקורת שנבחרו באופן אקראי לתוך צינורות PCR בהתאמה. השתמש פיפטה כדי לשאוף את מאגר E3 השיורי.
  2. הוסף 40 μL של 50 mM NaOH לתוך צינורות PCR. שים את הצינורות באמבט מתכת ב 95 ° C במשך 20 דקות, ולאחר מכן מערבולת במשך 15 שניות.
  3. הוסף 4 μL של 1 M Tris· HCl (pH 8.0) לתוך כל צינור כדי לנטרל את NaOH. צנטריפוגה קצרה במהירות של 2,000 x גרם למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר כדי להסיר טיפות מדופן הצינור. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינורות PCR חדשים, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20°C.
  4. תכננו פריימרים מתאימים במעלה ובמורד הזרם של אתרי המטרה של gRNA. השתמש 1 μL של supernatant לעיל כתבנית עבור תגובות PCR של נפח 50 μL. הפריימרים ששימשו ל-PCR במחקר זה מפורטים בטבלה משלימה 1.
  5. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז DNA כדי להבטיח רצועות נכונות וספציפיות, ולאחר מכן ריצוף סנגר כפי שתואר קודם40.
  6. נתח את נתוני רצף Sanger עם תוכנית EditR (1.0.10)41.
    1. העלה את קובץ הרצף (פורמט ab1) לתיבה "העלה קובץ .ab1".
    2. הזן את רצף gRNA של 20 bp בכיוון 5′-3′ בתיבה "הזן רצף gRNA".
    3. פתח את קובץ הרצף (פורמט ab1), ואשר את מיקומי הבסיס שבהם רצף gRNA של 20 bp מתחיל ומסתיים. הזן את מיקום הבסיס המתאים בתיבות "5′ התחלה" ו- "3′ סוף".
    4. לחץ על עריכה חזויה כדי להשיג את יעילות העריכה הבסיסית. בדוק את איכות נתוני הריצוף ליד רצף המטרה של gRNA כדי למנוע פסגות או indels לא מסודרים.
      הערה: באופן כללי, ניתן להסיר ביעילות את הפסגות הלא מסודרות על ידי התאמת טמפרטורת החישול של PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דווח כי המוטציה של TSR2 גורמת לאנמיה של Diamond Blackfan (DBA)42. כאן, מודל דג זברה DBA נבנה עם מוטציה tsr2 (M1V) באמצעות אסטרטגיית i-Silence. האדנין של קודון ההתחלה של דג הזברה tsr2 הומר בהצלחה לגואנין באמצעות zSpRY-ABE8e (איור 3).

ניתוח EditR של תוצאות ריצוף Sanger הראה שיש חפיפה בין A/G בבסיס האדנין של קודון ההתחלה tsr2 (איור 4).

לאחר שמייסדי F0 הזדווגו עם בוגר מוטנטי הטרוזיגוטי tsr2 שנוצר בעבר, הפנוטיפים של העובר נצפו יומיים לאחר ההפריה (dpf) תחת המיקרוסקופ. כמה עוברים הציגו פנוטיפ של עיניים קטנות יותר וקרום לב נפוח בהשוואה לקבוצת ביקורת (איור 5). העוברים הורדמו עם 0.03% טריקאין, קובעו על 4% מתילצלולוז וצולמו.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של הרצף והמבנה המשני של gRNA EE המוטען בחלבון zSpRY-ABE8e. הנוקלאוטידים שעברו שינוי כימי מסומנים בכוכבים שחורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמה סכמטית של מבנה mRNA zSpRY-ABE8e המכיל TadA8e ממוטב קודון (zTadA8e) ו-SpRYCas9 ממוטב קודון (zSpRYCas9). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דיאגרמה סכמטית של מוטציית דג הזברה tsr2 (M1V) באמצעות zSpRY-ABE8e. רצפי PAM מודגשים באדום, הבסיסים הערוכים מודגשים בכחול, וחומצות האמינו הממוקדות מודגשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ריצוף תוצאות הכרומטוגרמה של מוטציית דג הזברה tsr2 (M1V) באמצעות zSpRY-ABE8e. ציר x מייצג את רצף הבסיס, ציר y מייצג את גובה השיא, והבסיס הערוך מסומן בראש חץ אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פנוטיפ של עוברי tsr2 (M1V) ב-2 dpf בהשוואה לקבוצת ביקורת. (א,ג) המבט הצידי ו-(B,D) מבט גבי של (A,B) דגי זברה מסוג בר AB ועוברים (C,D) tsr2 (M1V) ב-2 dpf. ראש החץ האדום ב-C מצביע על נפיחות קרום הלב. המסגרת והקוטר האדומים משקפים את גודל העיניים. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של מודל מחלת דגי זברה באמצעות עורך הבסיס zSpRY-ABE8e. בהשוואה למסלול HDR המסורתי להחלפת בסיס, פרוטוקול זה יכול להשיג עריכת בסיס יעילה יותר ולהפחית את התרחשות האינדלים. במקביל, פרוטוקול זה כולל יישום אסטרטגיית הנוקאאוט הגנטי i-Silence שהוצעה לאחרונה בדגי זברה. יחד, zSpRY-ABE8e ישפר את היישום של מודלים של דגי זברה בחקר מחלות.

אפקטים מחוץ למטרה הם בעיה נפוצה במערכות CRISPR/Cas9. בהתחשב בהגבלה ללא PAM, ההשפעה מחוץ למטרה של zSpRY-ABE8e עשויה להיות גבוהה יותר, גם אם לא נמצאה השפעה משמעותית מחוץ למטרה במחקר קודם כולל tsr2 מיקוד18. למרבה המזל, ניתן להימנע מבעיה זו על ידי תקני תכנון gRNA מחמירים, המבטיחים שרק רצף גנום אחד תואם את ה-gRNA ל-PAM בדיוק ושומרים על המספר הכולל של אתרים חזויים מחוץ למטרה למינימום. בנוסף, מחקר הראה כי הזרקת ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) ו-gRNA מפחיתה את ההסתברות מחוץ למטרה בהשוואה להזרקת mRNA ו-gRNA43. יתר על כן, השינוי של gRNA ו- Cas9 יכול גם להפחית השפעות מחוץ למטרה44,45. בדגי זברה, דורות רבים של רבייה יכולים גם להיבדק עבור פנוטיפים המטרה כדי לקבל מודלים של בעלי חיים עם השפעות נמוכות מחוץ למטרה.

יש עדיין כמה מגבלות בפרוטוקול זה. למרות של-zSpRY-ABE8e אין הגבלת PAM, הוא עדיין מציג העדפת PAM, כאשר NRN עדיף על NYN בדגי זברה. יתר על כן, ABE יכול ליישם רק שני סוגים של החלפת בסיס, כלומר הוא ישים רק לבניית מודלים חלקיים. עדיין יש צורך לפתח עורכי בסיס נוספים כדי ליישם את החלפות הבסיס הנותרות בדגי זברה.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורטות לשימוש בעורך הבסיס היחיד zSpRY-ABE8e בדגי זברה. הוא מספק שיטה ישימה ויעילה לבניית מודלים מדויקים של מחלות דגי זברה, ומרחיב את היישום של מודלים של דגי זברה במחקרים על הפתוגנזה והטיפול במחלות הקשורות ל- SNV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לברברה גרברס, PhD, מליוואן ביאנג'י (אדנז) על עריכת הטקסט באנגלית של טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח של אזור המפתח של מחוז גואנגדונג (2019B030335001), תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2019YFE0106700), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070819, 31970782), ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לביולוגיה פתוגנית ואפידמיולוגיה לבעלי חיים כלכליים ימיים (PBEA2020YB05).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539 1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries  Harvard Apparatus BS4 30-0016
Cell culture dishes  Falcon 351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit Vazyme C115 Kit for Infusion clone 
Codon optimization service Sangon Biotech
Drummond Microcaps Drummond Microcaps P1299-1PAK Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service GenScript
Fine Forceps Fine Scientific Instrument 11254-20 Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument P-97 Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix Genstar A033-101 Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box TENLIN PRX-1000A Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512 Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips  Eppendorf 5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 Vazyme C214-01 Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector ZGene Biotech ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9 Addgene 46757
RNeasy FFPE kit  Qiagen 73504 Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular Sangon A100173-0500 NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope Olympus  SZX10 Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope CNOPTEC SZ650
T3 mMESSAGE Ambion AM1348 Kit for in vitro transcription 
TIANprep Mini Plasmid Kit TIANGEN DP103-03 Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit TIANGEN DP203-02 Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sangon A600194-0500 Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI New England Biolabs R0145S Restriction endonuclease used for plasmid linearization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
  2. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
  3. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  4. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  7. Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
  8. Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
  9. Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
  10. Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
  11. Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
  12. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
  13. Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
  14. Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
  15. Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
  17. Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
  18. Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
  19. Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
  20. Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
  21. Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
  22. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  23. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
  24. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  25. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  26. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  27. Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
  28. Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
  29. Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
  30. Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
  31. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
  32. Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
  33. Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
  34. Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
  35. Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
  36. Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
  37. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
  38. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  39. Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
  40. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  41. Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
  42. Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
  43. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  44. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  45. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).

Tags

פסילה גיליון 192
עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y.,… More

Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y., Fei, J. F., Qin, W., Liu, Y. Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e. J. Vis. Exp. (192), e64977, doi:10.3791/64977 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter