Summary
Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.
Abstract
La tecnologia CRISPR / Cas9 ha aumentato il valore del pesce zebra per modellare le malattie genetiche umane, studiare la patogenesi delle malattie e lo screening dei farmaci, ma le limitazioni del motivo adiacente protospaziatore (PAM) sono un ostacolo importante alla creazione di modelli animali accurati di malattie genetiche umane causate da varianti a singolo nucleotide (SNV). Fino ad ora, alcune varianti di SpCas9 con ampia compatibilità PAM hanno mostrato efficienza nel pesce zebra. L'applicazione dell'editor di base adenina (ABE) ottimizzato mediato da SpRY, zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificato nel pesce zebra ha consentito un'efficiente conversione della base adenina-guanina senza restrizioni PAM. Qui è descritto un protocollo per l'editing efficiente della base adenina senza limitazioni PAM nel pesce zebra usando zSpRY-ABE8e. Iniettando una miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificato in embrioni di zebrafish, è stato costruito un modello di malattia zebrafish con una mutazione precisa che simulava un sito patogeno del fattore di maturazione del ribosoma TSR2 (tsr2). Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per la creazione di modelli di malattia accurati per lo studio dei meccanismi e dei trattamenti della malattia.
Introduction
Le varianti a singolo nucleotide (SNV) che causano mutazioni missenso o nonsenso sono la fonte più comune di mutazioni nel genoma umano1. Per determinare se un particolare SNV è patogeno e per far luce sulla sua patogenesi, sono necessari modelli animali precisi2. I pesci zebra sono buoni modelli di malattia umana, che presentano un alto grado di omologia fisiologica e genetica con gli esseri umani, un breve ciclo di sviluppo e una forte capacità riproduttiva, che è vantaggiosa per la ricerca sulle caratteristiche e sui meccanismi patogeni, nonché per lo screening dei farmaci3.
Il sistema CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 è stato ampiamente applicato nell'editing del genoma di varie specie, tra cui il pesce zebra4. Con la guida del gRNA, il sistema CRISPR / Cas9 può generare rotture a doppio filamento del DNA (DSB) nel sito bersaglio, che consente quindi la sostituzione a base singola attraverso la ricombinazione del sito bersaglio con modelli di DNA del donatore tramite il percorso di riparazione diretta dall'omologia (HDR). Tuttavia, l'efficienza di questo metodo di sostituzione della base è piuttosto bassa in quanto il processo di riparazione del DNA cellulare viene effettuato principalmente dalla via di giunzione finale non omologa (NHEJ), che di solito è accompagnata da mutazioni di inserzione e delezione (indel)5. Fortunatamente, la tecnologia di editing a base singola basata su CRISPR / Cas9 allevia significativamente questo problema utilizzando editor di base, che consentono un editing a base singola più efficiente senza indurre DSB. Due classi principali di editor di base, gli editor di base adenina (ABE) e gli editor di base di citosina (CBE), sono stati sviluppati per implementare l'editing di sostituzione di base per A· Da T a G· C e C·G a T· A, rispettivamente 6,7,8,9,10,11. Questi quattro tipi di sostituzioni di base coprono il 30% delle varianti patogene umane12. Entrambe le classi di editor di base, tra cui PmCDA1, sistema BE, CBE4max, ABE7.10 e ABE8e, sono state segnalate per funzionare nel pesce zebra, con BE4max e ABE8e in particolare segnalati per raggiungere un'elevata attività di editing 13,14,15,16,17,18,19.
Le proteine Cas9 di diverse specie, tra cui Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e S. canis, sono state implementate nell'editing genetico del pesce zebra, con lo Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) utilizzato più ampiamente20,21,22,23. Tuttavia, SpCas9 può riconoscere solo siti bersaglio con un motivo adiacente protospacer NGG (PAM), che limita il suo intervallo modificabile e può comportare che non venga trovata alcuna sequenza adatta vicino al sito patogeno di interesse24. Per ampliare la gamma target, una varietà di varianti di SpCas9 sono state progettate per riconoscere diversi PAM attraverso l'evoluzione diretta e la progettazione guidata dalla struttura. Tuttavia, poche varianti sono efficaci negli animali, specialmente nel pesce zebra, il che limita l'applicazione del pesce zebra nella ricerca sulle malattie correlate al SNV25,26,27,28. Recentemente, due varianti di SpCas9, SpG e SpRY, con restrizioni PAM meno rigorose (NGN per SpG e NNN per SpRY con una preferenza più elevata per NRN rispetto a NYN) sono state segnalate per mostrare un'elevata attività di editing in cellule e piante umane 29,30,31,32. Successivamente, SpG e SpRY, così come un certo numero dei loro editor di base mediati, come CBE mediati da SpRY e ABE mediati da SpRY, sono stati segnalati per lavorare nel pesce zebra, che migliorerà l'applicazione di modelli di zebrafish nello studio meccanicistico e nello screening farmacologico delle malattie correlate a SNV 18,33,34,35. Inoltre, i-Silence è stato proposto come una strategia di knockout genico efficace e accurata attraverso la conversione del codone iniziale mediata da ABE da ATG a GTG o ACG36. La combinazione della strategia i-Silence e dell'editor di base mediato da SpRY zSpRY-ABE8e fornisce un nuovo metodo per la modellazione della malattia18. Questo protocollo dimostra come eseguire l'editing genetico utilizzando zSpRY-ABE8e nel pesce zebra per costruire un modello tsr2 (M1V) utilizzando la strategia i-Silence. L'efficienza di editing e i fenotipi che appaiono nei modelli di zebrafish sono stati valutati e analizzati.
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Protocol
Questo studio è stato condotto nel rigoroso rispetto delle linee guida del Comitato per la cura e l'uso della South China Normal University.
1. Preparazione di gRNA sinteticamente modificati e mRNA zSpRY-ABE8e
- Progettare il gRNA secondo le pubblicazioni precedenti37,38.
- Selezionare preferenzialmente NRN come sequenza PAM, poiché zSpRY-ABE8e mostra una preferenza maggiore per NRN PAM rispetto a NYN PAM (dove R è A o G e Y è C o T)18. Assicurarsi che il nucleotide adenina target si trovi nella finestra di modifica altamente attiva (dal terzo al nono nucleotide lungo il protospaziatore).
- Ordinare EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificato con 2′-O-metil-3′-fosforotioato (MS) ad entrambe le estremità (Figura 1).
NOTA: Il gRNA EE deve essere sciolto in acqua priva di RNasi e conservato a -80 °C. - Linearizzare il plasmide zSpRY-ABE8e18.
- Linearizzare 6 μg del plasmide con l'enzima XbaI (Table of Materials) in un bagno metallico a 37 °C per 3 ore.
- Purificare il plasmide linearizzato utilizzando il kit di purificazione del DNA (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Trascrivere l'mRNA utilizzando il kit di trascrizione in vitro (Table of Materials).
- Trascrivere l'mRNA zSpRY-ABE8e con il plasmide linearizzato come modello secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Tutte le operazioni che coinvolgono mRNA e gRNA richiedono l'uso di forniture di laboratorio prive di RNasi.
- Trascrivere l'mRNA zSpRY-ABE8e con il plasmide linearizzato come modello secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare il kit di purificazione dell'RNA (Table of Materials) per purificare l'mRNA secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Prima di eluire, l'etanolo deve essere essiccato per evitare citotossicità e l'mRNA deve essere conservato a -80 °C se non utilizzato immediatamente.
2. Preparazione dei capillari di vetro a microiniezione
- Impostare il sistema di estrazione a micropipette e preriscaldare per almeno 30 minuti.
- Eseguire un test di rampa per determinare il valore termico necessario per fondere i capillari di vetro borosilicato (con diametro esterno di 1 mm e diametro interno di 0,58 mm) secondo le istruzioni del produttore.
- Selezionare un programma e fare clic sul numero sulla tastiera per inserire i valori dei parametri. Impostare i seguenti parametri per tirare i capillari di vetro: calore = valore del test di rampa, trazione = 50, velocità = 100, tempo = 50 e pressione = 30.
- Installare il tubo capillare, assicurandosi che sia nella scanalatura. Premere PULL START/STOP per eseguire il programma.
- Preservare i capillari tirati inserendoli in schiuma che contiene spazi vuoti, mantenendo l'ago sospeso.
3. Microiniezione della miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA EE in embrioni di zebrafish
- Allestire vasche di allevamento la notte prima dell'iniezione. Inserire un divisorio, posizionare due femmine e un maschio di zebrafish ceppo AB (3-18 mesi) in ogni vasca e coprire con il coperchio. Fare riferimento alle pubblicazioni precedenti per le distinzioni di genere39.
NOTA: Per ottenere più embrioni, selezionare pesci che non si riproducono da almeno 1 settimana. - La mattina successiva prima dell'iniezione, scongelare l'mRNA zSpRY-ABE8e e il gRNA EE sul ghiaccio. Mescolare l'mRNA e il gRNA a concentrazioni finali di 400 ng / μL e 200 ng / μL, rispettivamente.
- Eseguire l'intera procedura sul ghiaccio utilizzando punte e tubi privi di RNasi e maneggiare con i guanti.
- Configurare il microiniettore pneumatico. Chiudere la valvola di pressione parziale della pompa dell'aria e aprire prima la valvola principale, svitare la bombola del gas e regolare la pressione della valvola di pressione parziale a 0,2 MPa / 29 psi.
- Accendere il microiniettore pneumatico, impostare la modalità su TIMER e regolare il valore di pressione del parametro iniziale su 20,0 psi e il valore TIMER su 0,040 s.
- Utilizzare una pinza fine per rompere con cura gli aghi dei capillari di vetro tirati sotto uno stereomicroscopio, assicurandosi che gli aghi siano tagliati ad angolo per facilitare il piercing del corion e dell'uovo.
NOTA: Il punto di rottura dell'ago deve essere nel posto giusto ed essere abbastanza forte da perforare l'uovo ma abbastanza sottile da ridurre al minimo i danni all'uovo. - Aggiungere la miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sulla punta di un capillare di vetro utilizzando una punta di pipetta microloader, evitando bolle nel capillare. Collegare l'ago al micromanipolatore e configurare la pressione e il valore TIMER dell'iniettore per garantire che vengano prodotti 2 nL di miscela per iniezione utilizzando un microcap.
- Scollegare i divisori delle vasche di riproduzione e consentire al pesce di riprodursi per 10-15 minuti. Raccogliere le uova usando un colino ed esaminare lo stadio cellulare e la qualità delle uova sotto uno stereomicroscopio. Selezionare le uova nello stato a cella singola per l'iniezione per migliorare l'efficienza di editing.
- Foderare le uova su una piastra di iniezione di agarosio all'1,5% e iniettare 2 nL della miscela nella cellula, non nel tuorlo, degli embrioni al microscopio per migliorare l'efficienza di editing. Conservare almeno 15 uova come gruppo di controllo.
- Utilizzare 1x tampone E3 per raccogliere le uova in piastre di Petri e metterle in un'incubatrice a 28 °C. Rimuovere le uova morte e cambiare il tampone di coltura ogni 12 ore fino a 48 ore dopo la fecondazione (hpf).
4. Analisi dell'efficienza dell'editing di base con EditR
- A 48 hpf, raccogliere tre pool di sei embrioni iniettati selezionati casualmente e sei embrioni di controllo selezionati casualmente in provette PCR rispettivamente. Utilizzare una pipetta per aspirare il buffer E3 residuo.
- Aggiungere 40 μL di 50 mM NaOH nelle provette PCR. Mettere i tubi in un bagno di metallo a 95 °C per 20 minuti, quindi vortice per 15 s.
- Aggiungere 4 μL di 1 M Tris· HCl (pH 8.0) in ogni tubo per neutralizzare il NaOH. Centrifugare brevemente a 2.000 x g per 10 s a temperatura ambiente per rimuovere le goccioline dalla parete del tubo. Raccogliere il surnatante in nuove provette per PCR e conservarle a -20 °C.
- Progettare primer appropriati a monte e a valle dei siti bersaglio del gRNA. Utilizzare 1 μL del surnatante di cui sopra come modello per le reazioni PCR di volume 50 μL. I primer utilizzati per la PCR in questo studio sono elencati nella Tabella supplementare 1.
- Eseguire un'elettroforesi su gel di agarosio del DNA per garantire bande corrette e specifiche, seguita dal sequenziamento Sanger come descritto in precedenza40.
- Analizzare i dati di sequenziamento Sanger con il programma EditR (1.0.10)41.
- Carica il file di sequenziazione (formato ab1) nella casella "Carica file .ab1".
- Inserisci la sequenza di gRNA di 20 bp con orientamento 5′-3′ nella casella "Enter gRNA sequence".
- Aprire il file di sequenziamento (formato ab1) e confermare le posizioni di base in cui inizia e finisce la sequenza di gRNA a 20 bp. Inserisci la posizione di base corrispondente nelle caselle "5′ start" e "3′ end".
- Fare clic su Modifica prevista per ottenere l'efficienza di modifica di base. Controllare la qualità dei dati di sequenziamento vicino alla sequenza bersaglio del gRNA per evitare picchi disordinati o indel.
NOTA: In generale, i picchi disordinati possono essere efficacemente rimossi regolando la temperatura di ricottura della PCR.
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Representative Results
È stato riportato che la mutazione di TSR2 causa anemia di Diamond Blackfan (DBA)42. Qui, è stato costruito un modello DBA zebrafish con una mutazione tsr2 (M1V) utilizzando la strategia i-Silence. L'adenina del codone iniziale del pesce zebra tsr2 è stata convertita con successo in guanina utilizzando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
L'analisi EditR dei risultati del sequenziamento Sanger ha mostrato che c'era una sovrapposizione A/G alla base adenina del codone di partenza tsr2 (Figura 4).
Dopo che i fondatori di F0 sono stati accoppiati con un adulto mutante eterozigote tsr2 precedentemente generato, i fenotipi embrionali sono stati osservati al microscopio 2 giorni dopo la fecondazione (dpf). Diversi embrioni hanno mostrato un fenotipo di occhi più piccoli e un pericardio gonfio rispetto ai controlli (Figura 5). Gli embrioni sono stati anestetizzati con tricaina allo 0,03%, fissati su metilcellulosa al 4% e fotografati.
Figura 1: Diagramma schematico della sequenza e della struttura secondaria del gRNA EE caricato nella proteina zSpRY-ABE8e. I nucleotidi chimicamente modificati sono etichettati con stelle nere. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Diagramma schematico della struttura dell'mRNA zSpRY-ABE8e contenente TadA8e ottimizzato per codone (zTadA8e) e SpRYCas9 ottimizzato per il codone (zSpRYCas9). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Diagramma schematico della mutazione tsr2 (M1V) del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e. Le sequenze PAM sono evidenziate in rosso, le basi modificate sono evidenziate in blu e gli amminoacidi mirati sono in grassetto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati del sequenziamento del cromatogramma della mutazione tsr2 (M1V) del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e. L'asse x rappresenta la sequenza di base, l'asse y rappresenta l'altezza del picco e la base modificata è indicata con una punta di freccia rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Fenotipo degli embrioni tsr2 (M1V) a 2 dpf rispetto ai controlli. (A,C) La vista laterale e la vista dorsale (B,D) degli embrioni selvatici di pesce zebra AB (A,B) e (C,D) tsr2 (M1V) a 2 dpf. La punta della freccia rossa in C indica gonfiore pericardico. La cornice e il diametro rossi riflettono la dimensione degli occhi. Barra scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella supplementare 1: Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo protocollo descrive la costruzione di un modello di malattia del pesce zebra utilizzando l'editor di base zSpRY-ABE8e. Rispetto al tradizionale percorso HDR per la sostituzione delle basi, questo protocollo può ottenere un editing di base più efficiente e ridurre il verificarsi di indel. Allo stesso tempo, questo protocollo prevede l'implementazione della strategia di knockout del gene i-Silence recentemente proposta nel pesce zebra. Nel suo insieme, zSpRY-ABE8e migliorerà l'applicazione di modelli di zebrafish nella ricerca sulle malattie.
Gli effetti fuori bersaglio sono un problema comune nei sistemi CRISPR / Cas9. Considerando la restrizione senza PAM, l'effetto off-target di zSpRY-ABE8e potrebbe essere più elevato, anche se in uno studio precedente non è stato trovato alcun significativo off-target che includeva tsr2 targeting18. Fortunatamente, questo problema può essere evitato da rigorosi standard di progettazione del gRNA, che assicurano che solo una sequenza del genoma corrisponda esattamente al gRNA con PAM e mantengano al minimo il numero totale di siti off-target previsti. Inoltre, uno studio ha dimostrato che l'iniezione di ribonucleoproteina (RNP) e gRNA riduce la probabilità off-target rispetto all'iniezione di mRNA e gRNA43. Inoltre, la modifica di gRNA e Cas9 può anche ridurre gli effetti off-target44,45. Nel pesce zebra, più generazioni di allevamento possono anche essere sottoposte a screening per i fenotipi bersaglio per ottenere modelli animali con bassi effetti fuori bersaglio.
Ci sono ancora alcune limitazioni in questo protocollo. Sebbene zSpRY-ABE8e non abbia restrizioni PAM, mostra ancora la preferenza PAM, con NRN preferito a NYN nel pesce zebra. Inoltre, l'ABE può implementare solo due tipi di sostituzione di base, il che significa che è applicabile solo alla costruzione di modelli parziali. Altri editor di base devono ancora essere sviluppati per implementare le rimanenti sostituzioni di base in zebrafish.
In conclusione, questo protocollo fornisce una guida dettagliata per l'uso dell'editor a base singola zSpRY-ABE8e nel pesce zebra. Fornisce un metodo fattibile ed efficiente per costruire precisi modelli di malattia del pesce zebra, ampliando l'applicazione di modelli di zebrafish negli studi sulla patogenesi e sul trattamento delle malattie correlate al SNV.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Barbara Garbers, PhD, di Liwen Bianji (Edanz) per aver curato il testo inglese di una bozza di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di ricerca e sviluppo dell'area chiave della provincia del Guangdong (2019B030335001), dal Programma nazionale chiave di ricerca e sviluppo della Cina (2019YFE0106700), dalla National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) e dal Programma del fondo di ricerca del Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
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