Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man utfører effektiv adeninbaseredigering uten PAM-begrensning for å konstruere en presis sebrafisksykdomsmodell ved bruk av zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR / Cas9-teknologi har økt verdien av sebrafisk for modellering av humane genetiske sykdommer, studier av sykdomspatogenese og legemiddelscreening, men begrensninger i protospacer tilstøtende motiv (PAM) er et stort hinder for å skape nøyaktige dyremodeller av humane genetiske lidelser forårsaket av enkeltnukleotidvarianter (SNV). Til nå har noen SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet vist effektivitet i sebrafisk. Anvendelsen av den optimaliserte SpRY-medierte adeninbaseeditoren (ABE), zSpRY-ABE8e og syntetisk modifisert gRNA i sebrafisk har muliggjort effektiv adenin-guaninbasekonvertering uten PAM-begrensning. Beskrevet her er en protokoll for effektiv adeninbaseredigering uten PAM-begrensning i sebrafisk ved bruk av zSpRY-ABE8e. Ved å injisere en blanding av zSpRY-ABE8e mRNA og syntetisk modifisert gRNA i sebrafiskembryoer, ble en sebrafisksykdomsmodell konstruert med en presis mutasjon som simulerte et patogent sted for TSR2-ribosommodningsfaktoren (tsr2). Denne metoden gir et verdifullt verktøy for etablering av nøyaktige sykdomsmodeller for å studere sykdomsmekanismer og behandlinger.
Introduction
Enkeltnukleotidvarianter (SNV) som forårsaker missense eller nonsensemutasjoner er den vanligste kilden til mutasjoner i det menneskelige genom1. For å avgjøre om en bestemt SNV er patogen, og for å kaste lys over patogenesen, kreves presise dyremodeller2. Sebrafisk er gode sykdomsmodeller for mennesker, med høy grad av fysiologisk og genetisk homologi hos mennesker, kort utviklingssyklus og sterk reproduksjonsevne, noe som er fordelaktig for forskning på sykdomsfremkallende egenskaper og mekanismer, samt medikamentscreening3.
Det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-systemet har blitt mye brukt i genomredigering av forskjellige arter, inkludert sebrafisk4. Med gRNA-veiledning kan CRISPR/Cas9-systemet generere DNA-dobbeltstrengede brudd (DSB) på målstedet, som deretter tillater enkeltbasesubstitusjon gjennom rekombinasjon av målstedet med donor-DNA-maler via HDR-banen (homology-directed repair). Imidlertid er effektiviteten til denne baseerstatningsmetoden ganske lav, da den cellulære DNA-reparasjonsprosessen hovedsakelig utføres av den ikke-homologe endekoblingsveien (NHEJ), som vanligvis ledsages av innsetting og sletting (indel) mutasjoner5. Heldigvis lindrer CRISPR/Cas9-basert enkeltbaseredigeringsteknologi dette problemet betydelig ved å bruke basisredigerere, som muliggjør mer effektiv enkeltbaseredigering uten å indusere DSB-er. To hovedklasser av basisredaktører, adeninbaseredaktører (ABE) og cytosinbaseredaktører (CBE), er utviklet for å implementere redigering av basesubstitusjon for A· T til G · C og C·G til T· A, henholdsvis 6,7,8,9,10,11. Disse fire typene basesubstitusjoner dekker 30% av humanpatogene varianter12. Begge klasser av baseredaktører, inkludert PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 og ABE8e, har blitt rapportert å fungere i sebrafisk, med BE4max og ABE8e spesielt rapportert å oppnå høy redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner fra forskjellige arter, inkludert Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes og S. canis, har blitt implementert i sebrafiskgenredigering, med Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) som brukes mest20,21,22,23. SpCas9 kan imidlertid bare gjenkjenne målsteder med et NGG-protospacer tilstøtende motiv (PAM), noe som begrenser det redigerbare området og kan føre til at ingen passende sekvens blir funnet nær det patogene stedet av interesse24. For å utvide målområdet har en rekke SpCas9-varianter blitt konstruert for å gjenkjenne forskjellige PAM-er gjennom rettet evolusjon og strukturstyrt design. Imidlertid er få varianter effektive hos dyr, spesielt i sebrafisk, noe som begrenser anvendelsen av sebrafisk i SNV-relatert sykdomsforskning25,26,27,28. Nylig har to varianter av SpCas9, SpG og SpRY, med mindre strenge PAM-restriksjoner (NGN for SpG og NNN for SpRY med høyere preferanse for NRN enn NYN) blitt rapportert å vise høy redigeringsaktivitet i humane celler og planter 29,30,31,32. Deretter har SpG og SpRY, samt en rekke av deres medierte baseredaktører, som SpRY-medierte CBEer og SpRY-medierte ABEer, også blitt rapportert å fungere i sebrafisk, noe som vil forbedre anvendelsen av sebrafiskmodeller i den mekanistiske studien og legemiddelscreening av SNV-relaterte sykdommer 18,33,34,35. Videre ble i-Silence foreslått som en effektiv og nøyaktig gen-knockout-strategi gjennom ABE-mediert startkodonkonvertering fra ATG til GTG eller ACG36. Kombinasjonen av i-Silence-strategien og den SpRY-medierte baseeditoren zSpRY-ABE8e gir en ny metode for sykdomsmodellering18. Denne protokollen demonstrerer hvordan man utfører genredigering ved hjelp av zSpRY-ABE8e i sebrafisk for å konstruere en tsr2 (M1V) modell ved hjelp av i-Silence-strategien. Redigeringseffektiviteten og fenotypene som vises i sebrafiskmodeller ble vurdert og analysert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i strengt samsvar med retningslinjene fra Care and Use Committee ved South China Normal University.
1. Klargjøring av syntetisk modifisert gRNA og zSpRY-ABE8e mRNA
- Design gRNA i henhold til tidligere publikasjoner37,38.
- Velg fortrinnsvis NRN som PAM-sekvens, da zSpRY-ABE8e viser en høyere preferanse for NRN PAM enn NYN PAM (der R er A eller G, og Y er C eller T)18. Sørg for at målet adenin nukleotid er i det svært aktive redigeringsvinduet (tredje til niende nukleotid langs protospaceren).
- Bestill EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modifisert med 2'-O-metyl-3'-fosforotioat (MS) i begge ender (figur 1).
MERK: EE gRNA skal oppløses i RNase-fritt vann og lagres ved -80 ° C. - Linearisere zSpRY-ABE8e plasmid18.
- Lineariser 6 μg av plasmidet med XbaI-enzymet (materialfortegnelse) i et metallbad ved 37 °C i 3 timer.
- Rens det lineariserte plasmidet ved hjelp av DNA-rensesettet (se materialtabellen) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Transkriber mRNA ved hjelp av in vitro transkripsjonssettet (materialfortegnelse).
- Transkriber zSpRY-ABE8e mRNA med det lineariserte plasmidet som mal i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Alle operasjoner som involverer mRNA og gRNA krever bruk av RNase-frie laboratorieforsyninger.
- Transkriber zSpRY-ABE8e mRNA med det lineariserte plasmidet som mal i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk RNA-rensesettet (materialfortegnelse) for å rense mRNA i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Før eluering må etanolen tørkes for å unngå cytotoksisitet, og mRNA skal oppbevares ved -80 °C hvis det ikke brukes umiddelbart.
2. Klargjøring av mikroinjeksjonsglasskapillærer
- Sett opp mikropipettavtrekkersystemet og forvarm i minst 30 minutter.
- Kjør en rampetest for å bestemme varmeverdien som trengs for å smelte borosilikatglasskapillærene (med 1 mm ytre diameter og 0,58 mm indre diameter) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Velg et program, og klikk på tallet på tastaturet for å angi parameterverdiene. Sett følgende parametere for å trekke glasskapillærene: varme = rampetestverdi, trekk = 50, hastighet = 100, tid = 50 og trykk = 30.
- Monter kapillærrøret, slik at det er i sporet. Trykk på PULL START/STOP for å kjøre programmet.
- Bevar de trukne kapillærene ved å sette dem inn i skum som inneholder hull, og hold nålen suspendert.
3. Mikroinjeksjon av zSpRY-ABE8e mRNA og EE gRNA blandingen i sebrafisk embryoer
- Sett opp avlstanker kvelden før injeksjonen. Sett inn en skillelinje, plasser to hunner og en hann AB-stammesebrafisk (3-18 måneder gammel) i hver tank, og dekk til med lokket. Se tidligere publikasjoner for kjønnsforskjeller39.
MERK: For å få flere embryoer, velg fisk som ikke har avlet på minst 1 uke. - Neste morgen før injeksjonen, tine zSpRY-ABE8e mRNA og EE gRNA på is. Bland mRNA og gRNA til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 400 ng / μL og 200 ng / μL.
- Utfør hele prosedyren på is ved hjelp av RNase-frie tips og rør, og håndter med hansker.
- Konfigurer den pneumatiske mikroinjektoren. Lukk deltrykksventilen til luftpumpen og åpne hovedventilen først, skru av gasssylinderen og juster trykket på deltrykksventilen til 0,2 MPa / 29 psi.
- Slå på den pneumatiske mikroinjektoren, sett modusen til TIMER, og juster den opprinnelige parametertrykkverdien til 20,0 psi og TIMER-verdien til 0,040 s.
- Bruk fin tang for å forsiktig bryte nålene til de trakk glasskapillærene under et stereomikroskop, og sørg for at nålene er kuttet i en vinkel for å lette piercingen av korionen og egget.
MERK: Nålens bruddpunkt må være på rett sted og være sterkt nok til å stikke hull på egget, men likevel tynt nok til å minimere skade på egget. - Tilsett blandingen av zSpRY-ABE8e mRNA og gRNA til spissen av en glasskapillær ved hjelp av en mikroloaderpipettespiss, unngå bobler i kapillæren. Fest kanylen til mikromanipulatoren, og konfigurer trykket og TIMER-verdien til injektoren for å sikre at det produseres 2 nL blanding per injeksjon ved bruk av en mikrohette.
- Trekk ut skilleveggene i avlstankene, og la fisken formere seg i 10-15 min. Samle eggene ved hjelp av en sil, og undersøk cellestadiet og kvaliteten på eggene under et stereomikroskop. Velg eggene i enkeltcelletilstand for injeksjon for å forbedre redigeringseffektiviteten.
- Linje eggene på en 1,5% agarose injeksjonsplate, og injiser 2 nL av blandingen inn i cellen, ikke eggeplommen, av embryoene under et mikroskop for å forbedre redigeringseffektiviteten. Behold minst 15 egg som kontrollgruppe.
- Bruk 1x E3 buffer til å samle eggene i petriskåler, og legg dem i en inkubator ved 28 °C. Fjern de døde eggene, og endre dyrkningsbufferen hver 12. time til 48 timer etter befruktning (hpf).
4. Effektivitetsanalyse av baseredigering med EditR
- Ved 48 hpf, samle tre bassenger med seks tilfeldig utvalgte injiserte embryoer og seks tilfeldig utvalgte kontrollembryoer i PCR-rør henholdsvis. Bruk en pipette til å aspirere den gjenværende E3-bufferen.
- Tilsett 40 μL 50 mM NaOH i PCR-rørene. Legg rørene i et metallbad ved 95 °C i 20 minutter, og virvel deretter i 15 s.
- Tilsett 4 μL med 1 m tris· HCl (pH 8,0) i hvert rør for å nøytralisere NaOH. Sentrifuge kort ved 2000 x g i 10 s ved romtemperatur for å fjerne dråper fra rørveggen. Samle supernatanten opp i nye PCR-rør, og oppbevar dem ved −20 °C.
- Design passende primere oppstrøms og nedstrøms for gRNA-målstedene. Bruk 1 μL av ovennevnte supernatant som mal for PCR-reaksjonene på 50 μL volum. Primerne som ble brukt for PCR i denne studien er listet opp i tilleggstabell 1.
- Utfør en DNA-agarosegelelektroforese for å sikre korrekte og spesifikke bånd, etterfulgt av Sanger-sekvensering som tidligere beskrevet40.
- Analyser Sanger-sekvenseringsdataene med EditR (1.0.10) -programmet41.
- Last opp sekvensfilen (ab1-format) til "Last opp .ab1-fil" -boksen.
- Skriv inn 20 bp gRNA-sekvensen i 5'-3' orientering i boksen "Enter gRNA-sekvens".
- Åpne sekvensfilen (ab1-format), og bekreft basisposisjonene der 20 bp gRNA-sekvensen starter og slutter. Skriv inn tilsvarende baseposisjon i boksene "5" start og "3" slutt.
- Klikk på Predicted Editing for å oppnå grunnleggende redigeringseffektivitet. Kontroller kvaliteten på sekvenseringsdataene nær gRNA-målsekvensen for å unngå uordnede topper eller indels.
MERK: Generelt kan de uordnede toppene effektivt fjernes ved å justere PCR-glødetemperaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutasjonen av TSR2 har blitt rapportert å forårsake Diamond Blackfan anemi (DBA) 42. Her ble en DBA sebrafiskmodell konstruert med en tsr2 (M1V) mutasjon ved hjelp av i-Silence-strategien. Adenin av startkodonet til sebrafisken tsr2 ble vellykket konvertert til guanin ved bruk av zSpRY-ABE8e (figur 3).
EditR-analysen av Sanger-sekvenseringsresultatene viste at det var en A/G-overlapping ved adeninbasen i tsr2-startkodonet (figur 4).
Etter at F0-grunnleggerne ble parret med en tidligere generert tsr2 heterozygot mutant voksen, ble embryofenotypene observert 2 dager etter befruktning (dpf) under mikroskopet. Flere embryoer hadde en fenotype av mindre øyne og hovent perikard sammenliknet med kontroller (figur 5). Embryoene ble bedøvet med 0,03% trikain, festet på 4% metylcellulose og fotografert.
Figur 1: Skjematisk diagram over sekvensen og sekundærstrukturen til EE gRNA lastet inn i zSpRY-ABE8e-protein. De kjemisk modifiserte nukleotidene er merket med svarte stjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk diagram over zSpRY-ABE8e mRNA-strukturen som inneholder kodonoptimalisert TadA8e (zTadA8e) og kodonoptimalisert SpRYCas9 (zSpRYCas9). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk diagram over sebrafiskmutasjonen tsr2 (M1V) ved bruk av zSpRY-ABE8e. PAM-sekvensene er uthevet i rødt, de redigerte basene er uthevet i blått, og de målrettede aminosyrene er i fet skrift. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sekvenseringskromatogramresultater av sebrafiskmutasjonen tsr2 (M1V) ved bruk av zSpRY-ABE8e. X-aksen representerer basissekvensen, y-aksen representerer topphøyden, og den redigerte basen er indikert med en rød pilspiss. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fenotype av tsr2 (M1V) embryoer ved 2 dpf sammenlignet med kontroller. (A,C) Lateralt bilde og (B,D) ryggbilde av (A,B) villtype AB sebrafisk og (C,D) tsr2 (M1V) embryoer ved 2 dpf. Den røde pilspissen i C indikerer perikardial hevelse. Den røde rammen og diameteren reflekterer øyestørrelsen. Skala bar: 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver konstruksjonen av en sebrafisksykdomsmodell ved hjelp av baseeditoren zSpRY-ABE8e. Sammenlignet med den tradisjonelle HDR-banen for basesubstitusjon, kan denne protokollen oppnå mer effektiv baseredigering og redusere forekomsten av indels. Samtidig innebærer denne protokollen å implementere den nylig foreslåtte i-Silence gen-knockout-strategien i sebrafisk. Til sammen vil zSpRY-ABE8e forbedre anvendelsen av sebrafiskmodeller i sykdomsforskning.
Off-target-effekter er et vanlig problem i CRISPR/Cas9-systemer. Tatt i betraktning den PAM-mindre begrensningen, kan off-target-effekten av zSpRY-ABE8e være høyere, selv om det ikke ble funnet noen signifikant off-target i en tidligere studie som inkluderte tsr2 rettet mot18. Heldigvis kan dette problemet unngås ved strenge gRNA-designstandarder, som sikrer at bare en genomsekvens samsvarer med gRNA med PAM nøyaktig og holder det totale antallet forventede off-target-steder til et minimum. I tillegg har en studie vist at injeksjon av ribonukleoprotein (RNP) og gRNA reduserer sannsynligheten utenfor målet sammenlignet med injeksjon av mRNA og gRNA43. Videre kan modifikasjonen av gRNA og Cas9 også redusere off-target effekter44,45. I sebrafisk kan flere generasjoner av avl også screenes for målfenotyper for å oppnå dyremodeller med lave off-target effekter.
Det er fortsatt noen begrensninger i denne protokollen. Selv om zSpRY-ABE8e ikke har noen PAM-begrensning, viser den fortsatt PAM-preferanse, med NRN foretrukket fremfor NYN i sebrafisk. Videre kan ABE bare implementere to typer basesubstitusjon, noe som betyr at den bare gjelder for konstruksjon av partielle modeller. Flere baseredaktører må fortsatt utvikles for å implementere de gjenværende basesubstitusjonene i sebrafisk.
Avslutningsvis gir denne protokollen detaljert veiledning for bruk av zSpRY-ABE8e single base editor i sebrafisk. Det gir en gjennomførbar og effektiv metode for å konstruere presise sebrafisksykdomsmodeller, utvide anvendelsen av sebrafiskmodeller i studier av patogenesen og behandling av SNV-relaterte sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Barbara Garbers, PhD, fra Liwen Bianji (Edanz) for å redigere den engelske teksten til et utkast til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province (2019B030335001), National Key R &D Program of China (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782), og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
