Summary
Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR / Cas9-technologie heeft de waarde van zebravissen verhoogd voor het modelleren van menselijke genetische ziekten, het bestuderen van ziektepathogenese en medicijnscreening, maar protospacer adjacent motif (PAM) -beperkingen zijn een belangrijk obstakel voor het creëren van nauwkeurige diermodellen van menselijke genetische aandoeningen veroorzaakt door single-nucleotidevarianten (SNV's). Tot nu toe hebben sommige SpCas9-varianten met brede PAM-compatibiliteit efficiëntie getoond in zebravissen. De toepassing van de geoptimaliseerde SpRY-gemedieerde adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravissen heeft een efficiënte adenine-guanine base conversie mogelijk gemaakt zonder PAM-beperking. Hier wordt een protocol beschreven voor efficiënte adeninebasisbewerking zonder PAM-beperking in zebravissen met behulp van zSpRY-ABE8e. Door een mengsel van zSpRY-ABE8e mRNA en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravisembryo's te injecteren, werd een zebravisziektemodel geconstrueerd met een precieze mutatie die een pathogene plaats van de TSR2-ribosoomrijpingsfactor (tsr2) simuleerde. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het opzetten van nauwkeurige ziektemodellen voor het bestuderen van ziektemechanismen en behandelingen.
Introduction
Single-nucleotide varianten (SNV's) die missense of nonsense mutaties veroorzaken zijn de meest voorkomende bron van mutaties in het menselijk genoom1. Om te bepalen of een bepaalde SNV pathogeen is en om licht te werpen op de pathogenese ervan, zijn nauwkeurige diermodellen nodig2. Zebravissen zijn goede menselijke ziektemodellen, vertonen een hoge mate van fysiologische en genetische homologie met mensen, een korte ontwikkelingscyclus en een sterk voortplantingsvermogen, wat gunstig is voor onderzoek naar pathogene kenmerken en mechanismen, evenals geneesmiddelenscreening3.
Het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-systeem is op grote schaal toegepast in de genoombewerking van verschillende soorten, waaronder zebravis4. Met gRNA-begeleiding kan het CRISPR/Cas9-systeem DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) genereren op de doellocatie, die vervolgens single-base substitutie mogelijk maakt door recombinatie van de doellocatie met donor-DNA-sjablonen via de homologie-gerichte reparatie (HDR) -route. De efficiëntie van deze basevervangingsmethode is echter vrij laag omdat het cellulaire DNA-reparatieproces voornamelijk wordt uitgevoerd door de niet-homologe end-joining (NHEJ) -route, die meestal gepaard gaat met insertie- en deletiemutaties (indel)5. Gelukkig verlicht CRISPR / Cas9-gebaseerde single-base bewerkingstechnologie dit probleem aanzienlijk door basiseditors te gebruiken, die efficiëntere single-base editing mogelijk maken zonder DSB's te induceren. Twee belangrijke klassen van base editors, adenine base editors (ABE's) en cytosine base editors (CBE's), zijn ontwikkeld om base substitution editing voor A· T tot G· C en C·G t/m T· A, respectievelijk 6,7,8,9,10,11. Deze vier soorten basesubstituties dekken 30% van de humane pathogene varianten12. Van beide klassen van basiseditors, waaronder PmCDA1, BE-systeem, CBE4max, ABE7.10 en ABE8e, is gemeld dat ze werken in zebravissen, waarbij BE4max en ABE8e vooral zijn gemeld om een hoge bewerkingsactiviteit te bereiken 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-eiwitten van verschillende soorten, waaronder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes en S. canis, zijn geïmplementeerd in zebravisgenbewerking, waarbij de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) het meest wordt gebruikt20,21,22,23. SpCas9 kan echter alleen doellocaties herkennen met een NGG protospacer adjacent motif (PAM), wat het bewerkbare bereik beperkt en ertoe kan leiden dat er geen geschikte sequentie wordt gevonden in de buurt van de pathogene site van belang24. Om het doelbereik uit te breiden, zijn verschillende SpCas9-varianten ontworpen om verschillende PAM's te herkennen door middel van gerichte evolutie en structuurgestuurd ontwerp. Weinig varianten zijn echter effectief bij dieren, vooral bij zebravissen, wat de toepassing van zebravissen in SNV-gerelateerd ziekteonderzoek beperkt25,26,27,28. Onlangs zijn twee varianten van SpCas9, SpG en SpRY, met minder strenge PAM-beperkingen (NGN voor SpG en NNN voor SpRY met een hogere voorkeur voor NRN dan NYN) gemeld om een hoge bewerkingsactiviteit te vertonen in menselijke cellen en planten 29,30,31,32. Vervolgens is gemeld dat SpG en SpRY, evenals een aantal van hun gemedieerde basisredacteuren, zoals SpRY-gemedieerde CBE's en SpRY-gemedieerde ABE's, ook werken in zebravissen, wat de toepassing van zebravismodellen in de mechanistische studie en medicijnscreening van SNV-gerelateerde ziekten zal verbeteren 18,33,34,35. Bovendien werd i-Silence voorgesteld als een effectieve en nauwkeurige gen-knock-out strategie door ABE-gemedieerde start codon conversie van ATG naar GTG of ACG36. De combinatie van de i-Silence-strategie en de SpRY-gemedieerde basiseditor zSpRY-ABE8e biedt een nieuwe methode voor ziektemodellering18. Dit protocol laat zien hoe genbewerking met zSpRY-ABE8e in zebravissen kan worden uitgevoerd om een tsr2 (M1V) model te construeren met behulp van de i-Silence-strategie. De bewerkingsefficiëntie en fenotypen die voorkomen in zebravismodellen werden beoordeeld en geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Care and Use Committee van de South China Normal University.
1. Synthetisch gemodificeerd gRNA en zSpRY-ABE8e mRNA bereiden
- Ontwerp het gRNA volgens eerdere publicaties37,38.
- Selecteer bij voorkeur NRN als de PAM-reeks, omdat zSpRY-ABE8e een hogere voorkeur voor NRN PAM vertoont dan NYN PAM (waarbij R A of G is en Y C of T)18. Zorg ervoor dat het doel-adeninenucleotide zich in het zeer actieve bewerkingsvenster bevindt (derde tot negende nucleotide langs de protospacer).
- Bestel EasyEdit sgRNA (EE gRNA) gemodificeerd met 2′-O-methyl-3′-fosforothioaat (MS) aan beide uiteinden (figuur 1).
OPMERKING: Het EE-gRNA moet worden opgelost in RNase-vrij water en worden opgeslagen bij −80 °C. - Lineariseer het zSpRY-ABE8e plasmide18.
- Lineariseer 6 μg van het plasmide met het XbaI-enzym (Table of Materials) in een metalen bad bij 37 °C gedurende 3 uur.
- Zuiver het gelineariseerde plasmide met behulp van de DNA-zuiveringskit (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
- Transcribeer het mRNA met behulp van de in vitro transcriptiekit (Table of Materials).
- Transcribeer het zSpRY-ABE8e mRNA met het gelineariseerde plasmide als sjabloon volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Alle operaties met mRNA en gRNA vereisen het gebruik van RNase-vrije laboratoriumbenodigdheden.
- Transcribeer het zSpRY-ABE8e mRNA met het gelineariseerde plasmide als sjabloon volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik de RNA-zuiveringskit (Table of Materials) om het mRNA te zuiveren volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Voor het elueren moet de ethanol worden gedroogd om cytotoxiciteit te voorkomen en moet het mRNA worden opgeslagen bij −80 °C als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.
2. Voorbereiding van micro-injectie glazen haarvaten
- Stel het micropipet-trekkersysteem in en verwarm gedurende ten minste 30 minuten voor.
- Voer een hellingtest uit om de warmtewaarde te bepalen die nodig is om de haarvaten van borosilicaatglas (met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 0,58 mm) te smelten volgens de instructies van de fabrikant.
- Selecteer een programma en klik op het nummer op het toetsenbord om de parameterwaarden in te voeren. Stel de volgende parameters in om aan de glazen haarvaten te trekken: warmte = hellingtestwaarde, trekkracht = 50, snelheid = 100, tijd = 50 en druk = 30.
- Installeer de capillaire buis en zorg ervoor dat deze in de groef zit. Druk op PULL START/STOP om het programma uit te voeren.
- Bewaar de getrokken haarvaten door ze in schuim te steken dat openingen bevat, waardoor de naald blijft hangen.
3. Micro-injectie van het zSpRY-ABE8e mRNA- en EE-gRNA-mengsel in zebravisembryo's
- Zet de nacht voor de injectie kweektanks op. Plaats een scheidingswand, plaats twee vrouwtjes en een mannelijke AB-stamzebravis (3-18 maanden oud) in elke tank en dek af met het deksel. Zie eerdere publicaties voor genderonderscheid39.
OPMERKING: Om meer embryo's te verkrijgen, selecteert u vissen die minstens 1 week niet hebben gebroed. - Ontdooi de volgende ochtend voor de injectie het zSpRY-ABE8e mRNA en EE gRNA op ijs. Meng het mRNA en gRNA tot eindconcentraties van respectievelijk 400 ng/μL en 200 ng/μL.
- Voer de hele procedure uit op ijs met behulp van RNase-vrije tips en buizen en hanteer met handschoenen.
- Configureer de pneumatische micro-injector. Sluit de partiële drukklep van de luchtpomp en open eerst de hoofdklep, schroef de gasfles los en stel de druk van het partiële drukventiel in op 0,2 MPa/29 psi.
- Schakel de pneumatische micro-injector in, stel de modus in op TIMER en pas de initiële parameterdrukwaarde aan op 20,0 psi en de TIMER-waarde op 0,040 s.
- Gebruik een fijne tang om de naalden van de getrokken glazen haarvaten voorzichtig onder een stereomicroscoop te breken en zorg ervoor dat de naalden onder een hoek worden gesneden om het doorboren van het chorion en het ei te vergemakkelijken.
OPMERKING: Het breekpunt van de naald moet op de juiste plaats zijn en sterk genoeg zijn om het ei te doorboren, maar toch dun genoeg om schade aan het ei te minimaliseren. - Voeg het mengsel van zSpRY-ABE8e mRNA en gRNA toe aan de punt van een glazen capillair met behulp van een microloaderpipetpunt, waardoor bellen in het capillair worden vermeden. Bevestig de naald aan de micromanipulator en configureer de druk en timerwaarde van de injector om ervoor te zorgen dat 2 nL mengsel per injectie wordt geproduceerd met behulp van een microcap.
- Koppel de verdelers van de kweekbakken los en laat de vis 10-15 minuten broeden. Verzamel de eieren met behulp van een zeef en onderzoek het celstadium en de kwaliteit van de eieren onder een stereomicroscoop. Selecteer de eieren in de eencellige toestand voor injectie om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren.
- Bekleed de eieren op een 1,5% agarose-injectieplaat en injecteer 2 ml van het mengsel in de cel, niet de dooier, van de embryo's onder een microscoop om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren. Houd ten minste 15 eieren als controlegroep.
- Gebruik 1x E3 buffer om de eieren in petrischalen te verzamelen en plaats ze in een broedmachine bij 28 °C. Verwijder de dode eieren en vervang de kweekbuffer elke 12 uur tot 48 uur na de bevruchting (hpf).
4. Efficiëntieanalyse van basisbewerking met EditR
- Bij 48 hpf verzamelt u drie pools van zes willekeurig geselecteerde geïnjecteerde embryo's en zes willekeurig geselecteerde controle-embryo's in respectievelijk PCR-buizen. Gebruik een pipet om de resterende E3-buffer op te zuigen.
- Voeg 40 μL 50 mM NaOH toe aan de PCR-buizen. Plaats de buizen gedurende 20 minuten in een metalen bad bij 95 °C en vervolgens gedurende 15 s vortex.
- Voeg 4 μL van 1 M Tris toe. HCl (pH 8,0) in elke buis om de NaOH te neutraliseren. Centrifugeer kort op 2.000 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur om druppels van de buiswand te verwijderen. Verzamel het supernatant in nieuwe PCR-buizen en bewaar ze bij −20 °C.
- Ontwerp geschikte primers stroomopwaarts en stroomafwaarts van de gRNA-doellocaties. Gebruik 1 μL van het bovenstaande supernatant als sjabloon voor de PCR-reacties van 50 μL volume. De primers die in dit onderzoek voor de PCR zijn gebruikt, zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.
- Voer een DNA-agarosegel-elektroforese uit om correcte en specifieke banden te garanderen, gevolgd door Sanger-sequencing zoals eerder beschreven40.
- Analyseer de Sanger-sequencinggegevens met het EditR-programma (1.0.10)41.
- Upload het sequencingbestand (ab1-indeling) naar het vak "Upload .ab1-bestand".
- Voer de 20 bp gRNA-sequentie in 5′-3′-oriëntatie in het vak "Enter gRNA sequence" in.
- Open het sequencingbestand (ab1-indeling) en bevestig de basisposities waar de 20 bp gRNA-sequentie begint en eindigt. Voer de overeenkomstige basispositie in de vakken "5′ start" en "3′end" in.
- Klik op Voorspelde bewerking om de basisbewerkingsefficiëntie te verkrijgen. Controleer de kwaliteit van de sequencinggegevens in de buurt van de gRNA-doelsequentie om wanordelijke pieken of indalen te voorkomen.
OPMERKING: Over het algemeen kunnen de wanordelijke pieken effectief worden verwijderd door de PCR-gloeitemperatuur aan te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van de mutatie van TSR2 is gemeld dat deze Diamond Blackfan-anemie (DBA)42 veroorzaakt. Hier werd een DBA zebravismodel geconstrueerd met een tsr2 (M1V) mutatie met behulp van de i-Silence strategie. De adenine van het startcodon van de zebravis tsr2 werd met zSpRY-ABE8e succesvol omgezet in guanine (figuur 3).
De EditR-analyse van de Sanger-sequencingresultaten toonde aan dat er een A/G-overlap was op de adeninebasis van het tsr2-startcodon (figuur 4).
Nadat F0-oprichters waren gepaard met een eerder gegenereerde tsr2 heterozygote mutante volwassene, werden de embryofenotypen 2 dagen na de bevruchting (dpf) onder de microscoop waargenomen. Verschillende embryo's vertoonden een fenotype van kleinere ogen en een gezwollen hartzakje in vergelijking met controles (figuur 5). De embryo's werden verdoofd met 0,03% Tricaïne, gefixeerd op 4% methylcellulose en gefotografeerd.
Figuur 1: Schematisch diagram van de sequentie en secundaire structuur van EE gRNA geladen in zSpRY-ABE8e eiwit. De chemisch gemodificeerde nucleotiden zijn gelabeld met zwarte sterren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch diagram van de zSpRY-ABE8e mRNA-structuur met codon-geoptimaliseerde TadA8e (zTadA8e) en codon-geoptimaliseerde SpRYCas9 (zSpRYCas9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematisch diagram van de zebravis tsr2 (M1V) mutatie met behulp van zSpRY-ABE8e. De PAM-sequenties zijn rood gemarkeerd, de bewerkte basen zijn blauw gemarkeerd en de beoogde aminozuren zijn vetgedrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Sequencing chromatogram resultaten van de zebravis tsr2 (M1V) mutatie met behulp van zSpRY-ABE8e. De x-as vertegenwoordigt de basisreeks, de y-as vertegenwoordigt de piekhoogte en de bewerkte basis wordt aangegeven met een rode pijlpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fenotype van de tsr2 (M1V) embryo's bij 2 dpf vergeleken met controles. (A,C) Het zijaanzicht en (B,D) dorsale beeld van (A,B) wild-type AB zebravis en (C,D) tsr2 (M1V) embryo's bij 2 dpf. De rode pijlpunt in C duidt op pericardiale zwelling. Het rode frame en de diameter weerspiegelen de ooggrootte. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de constructie van een zebravisziektemodel met behulp van de basiseditor zSpRY-ABE8e. In vergelijking met de traditionele HDR-route voor basisvervanging, kan dit protocol efficiëntere basisbewerking bereiken en het optreden van indelaten verminderen. Tegelijkertijd omvat dit protocol de implementatie van de onlangs voorgestelde i-Silence gen-knock-out strategie in zebravissen. Alles bij elkaar zal zSpRY-ABE8e de toepassing van zebravismodellen in ziekteonderzoek verbeteren.
Off-target effecten zijn een veel voorkomend probleem in CRISPR/Cas9-systemen. Gezien de PAM-loze beperking kan het off-target effect van zSpRY-ABE8e hoger zijn, zelfs als er geen significante off-target werd gevonden in een eerdere studie met tsr2 targeting18. Gelukkig kan dit probleem worden vermeden door strikte gRNA-ontwerpnormen, die ervoor zorgen dat slechts één genoomsequentie het gRNA precies matcht met PAM en het totale aantal voorspelde off-target sites tot een minimum beperkt. Bovendien heeft een studie aangetoond dat de injectie van ribonucleoproteïne (RNP) en gRNA de off-target waarschijnlijkheid vermindert in vergelijking met de injectie van mRNA en gRNA43. Bovendien kan de modificatie van gRNA en Cas9 ook off-target effecten verminderen44,45. Bij zebravissen kunnen ook meerdere generaties fokken worden gescreend op de doelfenotypen om diermodellen te verkrijgen met lage off-target effecten.
Er zijn nog enkele beperkingen in dit protocol. Hoewel zSpRY-ABE8e geen PAM-beperking heeft, vertoont het nog steeds PAM-voorkeur, waarbij NRN de voorkeur heeft boven NYN in zebravissen. Bovendien kan de ABE slechts twee soorten basissubstitutie implementeren, wat betekent dat deze alleen van toepassing is op de constructie van deelmodellen. Er moeten nog meer basiseditors worden ontwikkeld om de resterende basisvervangingen in zebravissen te implementeren.
Kortom, dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor het gebruik van de zSpRY-ABE8e single base editor in zebravissen. Het biedt een haalbare en efficiënte methode om nauwkeurige zebravisziektemodellen te construeren, waardoor de toepassing van zebravismodellen in studies naar de pathogenese en behandeling van SNV-gerelateerde ziekten wordt uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We danken Barbara Garbers, PhD, van Liwen Bianji (Edanz) voor het bewerken van de Engelse tekst van een concept van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Key-Area Research and Development Program van de provincie Guangdong (2019B030335001), het National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), de National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) en het Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
