Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek
Summary
We beschrijven een protocol om menselijke venaeuze veneuze endotheelcellen (hSVECs) te isoleren en te kweken. We bieden ook gedetailleerde methoden om schuifspanning en rek te produceren om mechanische spanning in hSVECs te bestuderen.
Abstract
Coronaire bypass graft (CABG) chirurgie is een procedure om ischemisch myocardium te revasculariseren. Saphenous ader blijft gebruikt als een CABG-kanaal ondanks de verminderde doorgankelijkheid op lange termijn in vergelijking met arteriële leidingen. De abrupte toename van hemodynamische stress geassocieerd met de graft arterialisatie resulteert in vasculaire schade, vooral het endotheel, die de lage doorgankelijkheid van het saphenous vein graft (SVG) kan beïnvloeden. Hier beschrijven we de isolatie, karakterisering en uitbreiding van menselijke vena-endotheelcellen (hSVECs). Cellen geïsoleerd door collagenasevertering vertonen de typische kasseimorfologie en drukken endotheelcelmarkers CD31 en VE-cadherine uit. Om de mechanische spanningsinvloed te beoordelen, werden in deze studie protocollen gebruikt om de twee belangrijkste fysieke stimuli, schuifspanning en stretch, op gearterialiseerde SVG’s te onderzoeken. hSVECs worden gekweekt in een parallelle plaatstroomkamer om schuifspanning te produceren, met uitlijning in de richting van de stroom en verhoogde expressie van KLF2, KLF4 en NOS3. hSVECs kunnen ook worden gekweekt in een siliciummembraan dat gecontroleerde cellulaire stretch mogelijk maakt die veneuze (lage) en arteriële (hoge) rek nabootst. Het F-actinepatroon van endotheelcellen en de secretie van stikstofmonoxide (NO) worden dienovereenkomstig gemoduleerd door de arteriële rek. Samenvattend presenteren we een gedetailleerde methode om hSVECs te isoleren om de invloed van hemodynamische mechanische stress op een endotheelfenotype te bestuderen.
Introduction
Endotheliale cel (EC) disfunctie is een belangrijke speler in saphenous vein graft failure 1,2,3,4. De aanhoudende toename van schuifspanning en cyclische rek induceert het pro-inflammatoire fenotype van menselijke veneuze veneuze endotheelcellen (hSVECs)3,4,5,6. De onderliggende moleculaire routes zijn nog steeds niet volledig begrepen en gestandaardiseerde protocollen voor in vitro studies kunnen de inspanningen voor nieuwe inzichten in het gebied benutten. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om hSVECs te isoleren, te karakteriseren en uit te breiden en hoe ze bloot te stellen aan variabele niveaus van schuifspanning en cyclische rek, waarbij de veneuze en arteriële hemodynamische omstandigheden worden nagebootst.
hSVECs worden geïsoleerd door collagenase-incubatie en kunnen worden gebruikt tot passage 8. Dit protocol vereist minder manipulatie van het vat in vergelijking met de andere beschikbare protocollen7, die besmetting met gladde spiercellen en fibroblasten vermindert. Aan de andere kant vereist het een groter vaatsegment van ten minste 2 cm om een efficiënte EC-extractie te hebben. In de literatuur is gemeld dat EC’s uit grote vaten ook kunnen worden verkregen door mechanische verwijdering 7,8. Hoewel effectief, heeft de fysieke aanpak de nadelen van een lage EC-opbrengst en een hogere fibroblastbesmetting. Om de zuiverheid te verhogen, zijn extra stappen nodig met behulp van magnetische kralen of celsortering, waardoor de kosten van het protocol toenemen als gevolg van de verwerving van kralen en antilichamen 7,8. De enzymatische methode heeft snellere en betere resultaten met betrekking tot eg-zuiverheid en levensvatbaarheid 7,8.
De meest gebruikte EC’s om endotheeldisfunctie te bestuderen zijn menselijke navelstreng endotheliale cellen (HUVECs). Het is bekend dat het EC-fenotype verandert in verschillende vaatbedden en het is essentieel om methoden te ontwikkelen die het onderzochte vat vertegenwoordigen 9,10. In dit opzicht is de vaststelling van een protocol om een hSVEC te isoleren en te kweken onder mechanische stress een waardevol hulpmiddel om de bijdrage van hSVEC-disfunctie bij adertransplantaatziekte te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het venadelensegment van de saphena moet minstens 2 cm zijn om hSVECs met succes te isoleren. Kleine segmenten zijn moeilijk te hanteren en binden de uiteinden van het vat om de collagenase-oplossing te behouden om de cellen te isoleren. Het verminderde luminale oppervlak levert niet voldoende cellen op om de cultuur uit te breiden. Om het risico op besmetting met niet-EC’s te minimaliseren, moet de manipulatie van het venadelensegment van het saphenous tijdens de hele procedure zeer voorzichtig zijn. Het is belangrijk o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK wordt ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 en 2013/17368-0] en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 en 309179/2013-0). AAM wordt ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
