Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento
Summary
Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.
Abstract
La chirurgia dell’innesto di bypass coronarico (CABG) è una procedura per rivascolarizzare il miocardio ischemico. La vena safena rimane utilizzata come condotto CABG nonostante la ridotta pervietà a lungo termine rispetto ai condotti arteriosi. Il brusco aumento dello stress emodinamico associato all’arterializzazione dell’innesto provoca danni vascolari, in particolare l’endotelio, che possono influenzare la bassa pervietà dell’innesto della vena safena (SVG). Qui, descriviamo l’isolamento, la caratterizzazione e l’espansione delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Le cellule isolate dalla digestione della collagenasi mostrano la tipica morfologia del ciottolo ed esprimono i marcatori delle cellule endoteliali CD31 e VE-caderina. Per valutare l’influenza dello stress meccanico, in questo studio sono stati utilizzati protocolli per studiare i due principali stimoli fisici, sforzo di taglio e allungamento, su SVG arterializzati. Le hSVEC sono coltivate in una camera di flusso a piastre parallele per produrre stress di taglio, mostrando allineamento nella direzione del flusso e una maggiore espressione di KLF2, KLF4 e NOS3. Le hSVEC possono anche essere coltivate in una membrana di silicio che consente l’allungamento cellulare controllato che imita l’allungamento venoso (basso) e arterioso (alto). Il pattern F-actina delle cellule endoteliali e la secrezione di ossido nitrico (NO) sono modulati di conseguenza dall’allungamento arterioso. In sintesi, presentiamo un metodo dettagliato per isolare le hSVEC per studiare l’influenza dello stress meccanico emodinamico su un fenotipo endoteliale.
Introduction
La disfunzione delle cellule endoteliali (EC) è un attore chiave nel fallimento dell’innesto di vena safena 1,2,3,4. L’aumento sostenuto dello sforzo di taglio e dello stiramento ciclico induce il fenotipo proinfiammatorio delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC)3,4,5,6. I percorsi molecolari sottostanti non sono ancora completamente compresi e protocolli standardizzati per studi in vitro possono sfruttare gli sforzi per nuove intuizioni nell’area. Qui, descriviamo un semplice protocollo per isolare, caratterizzare ed espandere le hSVEC e come esporle a livelli variabili di stress da taglio e allungamento ciclico, imitando le condizioni emodinamiche venose e arteriose.
Le hSVEC sono isolate mediante incubazione della collagenasi e possono essere utilizzate fino al passaggio 8. Questo protocollo richiede meno manipolazione del vaso rispetto agli altri protocolli disponibili7, che riduce la contaminazione con cellule muscolari lisce e fibroblasti. D’altra parte, richiede un segmento di vaso più grande di almeno 2 cm per avere un’estrazione EC efficiente. In letteratura, è stato riportato che le EC da grandi navi possono anche essere ottenute mediante rimozione meccanica 7,8. Sebbene efficace, l’approccio fisico presenta gli svantaggi di una bassa resa EC e di una maggiore contaminazione da fibroblasti. Per aumentare la purezza, sono necessari ulteriori passaggi utilizzando sfere magnetiche o smistamento cellulare, aumentando il costo del protocollo a causa dell’acquisizione di perline e anticorpi 7,8. Il metodo enzimatico ha risultati più rapidi e migliori per quanto riguarda la purezza e la vitalità CE 7,8.
Le EC più frequentemente utilizzate per studiare la disfunzione endoteliale sono le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). È noto che il fenotipo EC cambia in diversi letti vascolari, ed è essenziale sviluppare metodi che rappresentino il vaso in esame 9,10. A questo proposito, l’istituzione di un protocollo per isolare una hSVEC e coltivarla sotto stress meccanico è uno strumento prezioso per comprendere il contributo della disfunzione hSVEC nella malattia del trapianto venoso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il segmento della vena safena deve essere di almeno 2 cm per isolare con successo le hSVEC. Piccoli segmenti sono difficili da gestire e legano le estremità del vaso per mantenere la soluzione di collagenasi per isolare le cellule. La ridotta superficie luminale non produce cellule sufficienti per espandere la coltura. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione con non-EC, la manipolazione del segmento della vena safena deve essere molto delicata durante l’intera procedura. È importante prestare attenzione quan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). AAM è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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