Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento
Summary
Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.
Abstract
La cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG, por sus siglas en inglés) es un procedimiento para revascularizar el miocardio isquémico. La vena safena sigue siendo utilizada como conducto de la CABG a pesar de la reducción de la permeabilidad a largo plazo en comparación con los conductos arteriales. El aumento abrupto del estrés hemodinámico asociado con la arterialización del injerto resulta en daño vascular, especialmente el endotelio, que puede influir en la baja permeabilidad del injerto de vena safena (SVG). Aquí, describimos el aislamiento, caracterización y expansión de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVEC). Las células aisladas por digestión de colagenasa muestran la morfología típica de adoquines y expresan marcadores celulares endoteliales CD31 y VE-cadherina. Para evaluar la influencia del estrés mecánico, se utilizaron protocolos en este estudio para investigar los dos estímulos físicos principales, el esfuerzo cortante y el estiramiento, en SVG arterializados. Los hSVEC se cultivan en una cámara de flujo de placa paralela para producir esfuerzo cortante, mostrando alineación en la dirección del flujo y mayor expresión de KLF2, KLF4 y NOS3. Los hSVEC también se pueden cultivar en una membrana de silicio que permite un estiramiento celular controlado que imita el estiramiento venoso (bajo) y arterial (alto). El patrón de actina F de las células endoteliales y la secreción de óxido nítrico (NO) se modulan en consecuencia por el estiramiento arterial. En resumen, presentamos un método detallado para aislar hSVECs para estudiar la influencia del estrés mecánico hemodinámico en un fenotipo endotelial.
Introduction
La disfunción de las células endoteliales (CE) es un actor clave en el fracaso del injerto de vena safena 1,2,3,4. El aumento sostenido del esfuerzo cortante y el estiramiento cíclico induce el fenotipo proinflamatorio de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVECs)3,4,5,6. Las vías moleculares subyacentes aún no se comprenden completamente, y los protocolos estandarizados para estudios in vitro pueden aprovechar los esfuerzos para obtener nuevos conocimientos en el área. Aquí, describimos un protocolo simple para aislar, caracterizar y expandir los hSVEC y cómo exponerlos a niveles variables de esfuerzo cortante y estiramiento cíclico, imitando las condiciones hemodinámicas venosas y arteriales.
Los hSVEC se aíslan por incubación de colagenasa y se pueden utilizar hasta el paso 8. Este protocolo requiere menos manipulación del vaso en comparación con los otros protocolos disponibles7, lo que reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. Por otro lado, requiere un segmento de recipiente más grande de al menos 2 cm para tener una extracción eficiente de la CE. En la literatura, se ha relatado que las CE de grandes vasos también pueden obtenerse por eliminación mecánica 7,8. Aunque eficaz, el enfoque físico tiene las desventajas de un bajo rendimiento de EC y una mayor contaminación por fibroblastos. Para aumentar la pureza, se necesitan pasos adicionales utilizando perlas magnéticas o clasificación celular, aumentando el costo del protocolo debido a la adquisición de perlas y anticuerpos 7,8. El método enzimático tiene resultados más rápidos y mejores en cuanto a la pureza y viabilidad de la CE 7,8.
Las CE más utilizadas para estudiar la disfunción endotelial son las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Se sabe que el fenotipo CE cambia en diferentes lechos vasculares, y es esencial desarrollar métodos que representen el vaso investigado 9,10. En este sentido, el establecimiento de un protocolo para aislar un hSVEC y cultivarlo bajo estrés mecánico es una herramienta valiosa para comprender la contribución de la disfunción hSVEC en la enfermedad del injerto venoso.
Protocol
Representative Results
Discussion
El segmento de la vena safena debe tener al menos 2 cm para aislar con éxito los hSVEC. Los segmentos pequeños son difíciles de manejar y atan los extremos del vaso para mantener la solución de colagenasa para aislar las células. La superficie luminal reducida no produce suficientes células para expandir el cultivo. Para minimizar el riesgo de contaminación con no CE, la manipulación del segmento de la vena safena debe ser muy suave durante todo el procedimiento. Es importante tener cuidado al introducir las punt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK cuenta con el apoyo de donaciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 y 2013/17368-0] y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 y 309179/2013-0). La AAM cuenta con el apoyo de donaciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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