Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung humaner Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Wir stellen auch detaillierte Methoden zur Erzeugung von Scherspannung und Dehnung zur Verfügung, um mechanische Spannungen in hSVECs zu untersuchen.
Abstract
Die Koronararterien-Bypass-Transplantation (CABG) ist ein Verfahren zur Revaskularisierung des ischämischen Myokards. Die Vena saphena wird trotz der im Vergleich zu arteriellen Conduits reduzierten Langzeitdurchgängigkeit weiterhin als CABG-Conduit verwendet. Der abrupte Anstieg des hämodynamischen Stresses, der mit der Arterialisierung des Transplantats einhergeht, führt zu einer Schädigung der Gefäße, insbesondere des Endothels, die die geringe Durchgängigkeit des Venentransplantats saphena (SVG) beeinflussen kann. Hier beschreiben wir die Isolierung, Charakterisierung und Expansion von humanen Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Zellen, die durch Kollagenaseverdau isoliert wurden, weisen die typische Kopfsteinpflastermorphologie auf und exprimieren die Endothelzellmarker CD31 und VE-Cadherin. Um den Einfluss der mechanischen Beanspruchung zu beurteilen, wurden in dieser Studie Protokolle verwendet, um die beiden wichtigsten physikalischen Stimuli, Scherspannung und Dehnung, auf arteriale SVGs zu untersuchen. hSVECs werden in einer parallelen Plattenströmungskammer kultiviert, um Scherspannungen zu erzeugen, die eine Ausrichtung in Strömungsrichtung und eine erhöhte Expression von KLF2, KLF4 und NOS3 zeigen. hSVECs können auch in einer Siliziummembran kultiviert werden, die eine kontrollierte Zelldehnung ermöglicht, die venöse (niedrige) und arterielle (hohe) Dehnung nachahmt. Das F-Aktin-Muster der Endothelzellen und die Stickstoffmonoxid (NO)-Sekretion werden entsprechend durch die arterielle Dehnung moduliert. Zusammenfassend stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung von hSVECs vor, um den Einfluss von hämodynamischem mechanischem Stress auf einen endothelialen Phänotyp zu untersuchen.
Introduction
Die Dysfunktion der Endothelzellen (EC) ist ein wichtiger Faktor beim Versagen des Venentransplantatssaphena 1,2,3,4. Die anhaltende Zunahme der Scherspannung und der zyklischen Dehnung induziert den proinflammatorischen Phänotyp der humanen Saphena-Endothelzellen (hSVECs)3,4,5,6. Die zugrunde liegenden molekularen Signalwege sind noch nicht vollständig verstanden, und standardisierte Protokolle für In-vitro-Studien könnten die Bemühungen um neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet unterstützen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Expansion von hSVECs und wie sie unterschiedlichen Scherbelastungen und zyklischen Dehnungen ausgesetzt werden können, um die venösen und arteriellen hämodynamischen Bedingungen nachzuahmen.
hSVECs werden durch Kollagenase-Inkubation isoliert und können bis zur Passage 8 verwendet werden. Dieses Protokoll erfordert im Vergleich zu den anderen verfügbaren Protokollen weniger Manipulation des Gefäßes7, was die Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten reduziert. Andererseits ist ein größeres Gefäßsegment von mindestens 2 cm erforderlich, um eine effiziente EC-Extraktion zu erreichen. In der Literatur wurde berichtet, dass ECs aus großen Gefäßen auch durch mechanische Entfernung gewonnen werden können 7,8. Obwohl der physikalische Ansatz effektiv ist, hat er die Nachteile einer niedrigen EC-Ausbeute und einer höheren Fibroblastenkontamination. Um die Reinheit zu erhöhen, sind zusätzliche Schritte mit magnetischen Beads oder Zellsortierung erforderlich, was die Kosten des Protokolls aufgrund des Erwerbs von Beads und Antikörpern erhöht 7,8. Die enzymatische Methode führt zu schnelleren und besseren Ergebnissen in Bezug auf EC-Reinheit und Lebensfähigkeit 7,8.
Die am häufigsten verwendeten ECs zur Untersuchung der endothelialen Dysfunktion sind humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs). Es ist bekannt, dass sich der EC-Phänotyp in verschiedenen Gefäßbetten ändert, und es ist wichtig, Methoden zu entwickeln, die das untersuchte Gefäß darstellen 9,10. In dieser Hinsicht ist die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung eines hSVEC und seiner Kultivierung unter mechanischer Belastung ein wertvolles Werkzeug, um den Beitrag der hSVEC-Dysfunktion bei Venentransplantaterkrankungen zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Venensegment saphena sollte mindestens 2 cm groß sein, um hSVECs erfolgreich zu isolieren. Kleine Segmente sind schwer zu handhaben und binden die Enden des Gefäßes zusammen, um die Kollagenaselösung zu erhalten und die Zellen zu isolieren. Die reduzierte luminale Oberfläche liefert nicht genügend Zellen, um die Kultur zu erweitern. Um das Risiko einer Kontamination mit Nicht-ECs zu minimieren, muss die Manipulation des Venenabschnitts saphena während des gesamten Eingriffs sehr schonend erfolgen. Es ist wicht…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK wird durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 und 2013/17368-0] und des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 und 309179/2013-0) unterstützt. AAM wird durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) und des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9) unterstützt.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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