인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출
Summary
우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.
Abstract
관상동맥우회술(CABG) 수술은 허혈성 심근을 혈관재생시키는 절차입니다. 복재 정맥은 동맥 도관에 비해 감소된 장기 개통성에도 불구하고 CABG 도관으로 계속 사용됩니다. 이식편 동맥화와 관련된 혈역학적 스트레스의 급격한 증가는 복재 정맥 이식편(SVG)의 낮은 개통성에 영향을 미칠 수 있는 혈관 손상, 특히 내피를 초래합니다. 여기에서 우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 특성화 및 확장에 대해 설명합니다. 콜라게나제 분해에 의해 분리된 세포는 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 내피 세포 마커인 CD31 및 VE-cadherin을 발현합니다. 기계적 응력 영향을 평가하기 위해 이 연구에서 동맥화된 SVG에 대한 두 가지 주요 물리적 자극인 전단 응력과 스트레치를 조사하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. hSVEC는 평행판 유동 챔버에서 배양되어 전단 응력을 생성하여 유동 방향으로의 정렬과 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현 증가를 보여줍니다. hSVEC는 또한 정맥(저) 및 동맥(고) 스트레칭을 모방하여 제어된 세포 스트레치를 허용하는 실리콘 멤브레인에서 배양될 수 있습니다. 내피 세포의 F-액틴 패턴과 산화질소(NO) 분비는 동맥 스트레칭에 의해 그에 따라 조절됩니다. 요약하면, 우리는 내피 표현형에 대한 혈역학적 기계적 스트레스의 영향을 연구하기 위해 hSVEC를 분리하는 자세한 방법을 제시합니다.
Introduction
내피 세포 (EC) 기능 장애는 복재 정맥 이식 실패 1,2,3,4에서 핵심적인 역할을 한다. 전단 응력과 주기적 스트레칭의 지속적인 증가는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 전염증 표현형을 유도합니다3,4,5,6. 기본 분자 경로는 아직 완전히 이해되지 않았으며 시험관 내 연구를 위한 표준화된 프로토콜은 해당 분야의 새로운 통찰력을 위한 노력을 활용할 수 있습니다. 여기에서는 hSVEC를 분리, 특성화 및 확장하는 간단한 프로토콜과 정맥 및 동맥 혈역학적 조건을 모방하여 다양한 수준의 전단 응력 및 주기적 스트레치에 hSVEC를 노출시키는 방법을 설명합니다.
hSVEC는 콜라게나제 배양에 의해 분리되며 계대 8까지 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이용가능한 다른 프로토콜7에 비해 혈관 조작이 덜 필요하며, 이는 평활근 세포 및 섬유아세포에 의한 오염을 감소시킨다. 반면에 효율적인 EC 추출을 위해서는 최소 2cm의 더 큰 용기 세그먼트가 필요합니다. 문헌에서, 대형 용기로부터의 EC는 또한 기계적 제거에 의해서도 얻어질 수 있다고 보고되었다 7,8. 효과적이기는 하지만, 물리적 접근법은 낮은 EC 수율 및 더 높은 섬유아세포 오염의 단점을 갖는다. 순도를 높이려면 마그네틱 비드 또는 세포 분류를 사용하는 추가 단계가 필요하며, 비드 및 항체 획득으로 인한 프로토콜 비용이 증가합니다 7,8. 효소 방법은 EC 순도 및 생존력과 관련하여 더 빠르고 더 나은 결과를 나타냅니다 7,8.
내피 기능 장애를 연구하기 위해 가장 자주 사용되는 EC는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)입니다. EC 표현형은 상이한 혈관 층에서 변화하는 것으로 알려져 있으며, 조사중인 혈관을 나타내는 방법을 개발하는 것이 필수적이다 9,10. 이와 관련하여, hSVEC를 분리하고 기계적 스트레스 하에서 배양하기 위한 프로토콜의 확립은 정맥 이식 질환에서 hSVEC 기능 장애의 기여를 이해하는 데 유용한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
복재 정맥 분절은 hSVEC를 성공적으로 분리하기 위해 최소 2cm가 되어야 합니다. 작은 세그먼트는 다루기가 어렵고 세포를 분리하기 위해 콜라게나제 용액을 유지하기 위해 혈관의 끝을 묶습니다. 감소된 내강 표면적은 배양을 확장하기에 충분한 세포를 생성하지 않습니다. 비 EC로 인한 오염 위험을 최소화하려면 복재 정맥 부분의 조작이 전체 절차 동안 매우 부드럽게해야합니다. 혈액을 제거하기…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 및 2013/17368-0] 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 및 309179/2013-0)의 보조금으로 지원됩니다. AAM은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP 2015/11139-5) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq(Universal – 407911/2021-9)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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