Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement
Summary
Nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de veine saphène humaine (hSVEC). Nous fournissons également des méthodes détaillées pour produire une contrainte de cisaillement et un étirement pour étudier la contrainte mécanique dans les hSVEC.
Abstract
Le pontage aortocoronarien (PAC) est une procédure de revascularisation du myocarde ischémique. La veine saphène reste utilisée comme conduit de pontage coronarien malgré la perméabilité réduite à long terme par rapport aux conduits artériels. L’augmentation brutale du stress hémodynamique associé à l’artérialisation du greffon entraîne des lésions vasculaires, en particulier de l’endothélium, qui peuvent influencer la faible perméabilité de la greffe de la veine saphène (SVG). Ici, nous décrivons l’isolement, la caractérisation et l’expansion des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC). Les cellules isolées par digestion de la collagénase présentent la morphologie typique des pavés et expriment les marqueurs cellulaires endothéliaux CD31 et VE-cadhérine. Pour évaluer l’influence des contraintes mécaniques, des protocoles ont été utilisés dans cette étude pour étudier les deux principaux stimuli physiques, la contrainte de cisaillement et l’étirement, sur les SVG artérialisés. Les hSVEC sont cultivés dans une chambre d’écoulement à plaques parallèles pour produire une contrainte de cisaillement, montrant un alignement dans la direction de l’écoulement et une expression accrue de KLF2, KLF4 et NOS3. Les hSVEC peuvent également être cultivés dans une membrane de silicium qui permet un étirement cellulaire contrôlé imitant l’étirement veineux (bas) et artériel (haut). Le diagramme F-actine des cellules endothéliales et la sécrétion d’oxyde nitrique (NO) sont modulés en conséquence par l’étirement artériel. En résumé, nous présentons une méthode détaillée pour isoler les hSVEC afin d’étudier l’influence du stress mécanique hémodynamique sur un phénotype endothélial.
Introduction
Le dysfonctionnement des cellules endothéliales (CE) est un acteur clé de l’échec de la greffe de veine saphène 1,2,3,4. L’augmentation soutenue de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique induit le phénotype pro-inflammatoire des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC)3,4,5,6. Les voies moléculaires sous-jacentes ne sont pas encore entièrement comprises, et les protocoles normalisés pour les études in vitro peuvent tirer parti des efforts pour de nouvelles connaissances dans le domaine. Ici, nous décrivons un protocole simple pour isoler, caractériser et étendre les hSVEC et comment les exposer à des niveaux variables de contrainte de cisaillement et d’étirement cyclique, imitant les conditions hémodynamiques veineuses et artérielles.
Les hSVEC sont isolés par incubation de collagénase et peuvent être utilisés jusqu’au passage 8. Ce protocole nécessite moins de manipulation du vaisseau par rapport aux autres protocoles disponibles7, ce qui réduit la contamination par les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. D’autre part, il faut un segment de récipient plus grand d’au moins 2 cm pour avoir une extraction EC efficace. Dans la littérature, il a été rapporté que les CEs des grands navires peuvent également être obtenues par enlèvement mécanique 7,8. Bien qu’efficace, l’approche physique présente les inconvénients d’un faible rendement EC et d’une contamination plus élevée par les fibroblastes. Pour augmenter la pureté, des étapes supplémentaires sont nécessaires en utilisant des billes magnétiques ou le tri cellulaire, ce qui augmente le coût du protocole en raison de l’acquisition de billes et d’anticorps 7,8. La méthode enzymatique donne des résultats plus rapides et meilleurs en ce qui concerne la pureté et la viabilité de la CE 7,8.
Les CE les plus fréquemment utilisées pour étudier le dysfonctionnement endothélial sont les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). On sait que le phénotype EC change dans différents lits vasculaires, et il est essentiel de développer des méthodes qui représentent le vaisseau étudié 9,10. À cet égard, la mise en place d’un protocole permettant d’isoler une hSVEC et de la cultiver sous contrainte mécanique est un outil précieux pour comprendre l’apport du dysfonctionnement de l’hSVEC dans la maladie du greffon veineux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le segment de la veine saphène doit avoir été d’au moins 2 cm pour isoler avec succès les hSVEC. Les petits segments sont difficiles à manipuler et attachent les extrémités du vaisseau pour maintenir la solution de collagénase pour isoler les cellules. La surface luminale réduite ne produit pas suffisamment de cellules pour étendre la culture. Pour minimiser le risque de contamination par des non-CE, la manipulation du segment de la veine saphène doit être très douce pendant toute la procédure. Il est imp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK est soutenu par des subventions de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 et 2013/17368-0] et Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 et 309179/2013-0). AAM est soutenu par des subventions de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) et du Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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