Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Profilering af bakteriesamfundet af fermenterende traminettedruer under vinproduktion ved hjælp af metagenomisk amplicon sekventering

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65598
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Summary

Her præsenterer vi en protokol til beskrivelse af amplicon metagenomisk til bestemmelse af bakteriesamfundet af Traminette-druer, gærende druer og endelig vin.

Abstract

Fremskridt inden for sekventeringsteknologi og den relativt lette adgang til brugen af bioinformatikværktøjer til at profilere mikrobielle samfundsstrukturer har lettet en bedre forståelse af både dyrkelige og ikke-dyrkelige mikrober i druer og vin. Under industriel gæring er mikrober, kendte og ukendte, ofte ansvarlige for produktudvikling og off-flavor. Derfor kan profilering af bakterierne fra drue til vin muliggøre en nem forståelse af in situ mikrobiel dynamik. I denne undersøgelse skal bakterierne i Traminette-druer gennemgå gæring, og den endelige vin blev udsat for DNA-ekstraktion, der gav 15 ng / μL til 87 ng / μL. 16S-amplikonen i den hypervariable region i V4-regionen blev sekventeret, relativt rigelige bakterier bestående af phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota og efterfulgt af Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota og Acidobacteriota. En Venn-diagramanalyse af de delte unikke operationelle taksonomiske enheder (OTU) afslørede, at 15 bakteriefyla var fælles for både druemost, gæringsstadium og endelig vin. Phyla, der ikke tidligere blev rapporteret, blev påvist ved anvendelse af 16S amplicon sekventering, såvel som slægter såsom Enterobacteriaceae og Lactobacillaceae. Variation i det organiske næringsstofforbrug i vin og dets indvirkning på bakterier blev testet; Traminette R-tank indeholdende Fermaid O og Traminette L stimuleret med Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alpha-mangfoldighed ved hjælp af Kruskal-Wallis-testen bestemte graden af jævnhed. Betadiversiteten indikerede et skift i bakterierne på gæringsstadiet for de to behandlinger, og de endelige vinbakterier lignede hinanden. Undersøgelsen bekræftede, at 16S amplicon sekventering kan bruges til at overvåge bakterieændringer under vinproduktion for at understøtte kvalitet og bedre udnyttelse af druebakterier under vinproduktion.

Introduction

Traminette drue er kendetegnet ved produktion af overlegen vinkvalitet, ud over mærkbart udbytte og delvis resistens over for flere svampeinfektioner 1,2,3. Den naturlige gæring af druer er afhængig af tilknyttede mikroorganismer, vinproduktionsmiljø og gæringsbeholdere 4,5. Ofte er mange vingårde afhængige af vildgær og bakterier til gæring, produktion af alkohol, estere, aroma og smagsudvikling6.

Målet med denne undersøgelse er at undersøge druernes bakteriesammensætning og overvåge deres dynamik under gæringen. Selvom den moderne brug af starterkulturer som Saccharomyces cerevisiae til primær gæring, hvor alkohol produceres, er fælles for forskellige vinstilarter7. Desuden forbedrer sekundær gæring, hvor æblesyre decarboxyleres af Oenococcus oeni til mælkesyre, vinens organoleptiske profil og smagsprofil og reducerer vinens surhedsgrad 8,9. Med de seneste fremskridt inden for brugen af dyrkningsuafhængige metoder er det nu muligt at bestemme forskellige mikrober forbundet med vindruen og de arter, der overføres til most, og deltage i gæringen på forskellige tidspunkter op til slutproduktet10.

Rollerne og dynamikken i vilde bakterier fra forskellige druer, der overføres til mosten under vingæring, er dårligt forstået. Taksonomien for mange af disse bakterier er ikke engang kendt, eller deres fænotypiske egenskaber er ukarakteriserede. Dette gør deres anvendelse i samkulturfermentering stadig dårligt underudnyttet. Imidlertid er mikrobiologisk kulturbaseret analyse blevet brugt til at bestemme bakteriepopulationen forbundet med druer og vin10. Det er almindeligt kendt, at selektiv kulturplettering er kedelig, tilbøjelig til forurening, har en lav reproducerbarhed, og output kan være tvivlsomt; Det savner også bakteriearter, hvis vækstbehov er ukendte. Tidligere undersøgelser tyder på, at kulturuafhængige, 16S rRNA-genbaserede metoder tilbyder en mere pålidelig og omkostningseffektiv tilgang til karakterisering af komplekse mikrobielle samfund11. For eksempel er sekventering af de hypervariable regioner af 16S rRNA-genet med succes blevet anvendt til at studere bakterier i druer, blade, bær og vin 12,13,14. Undersøgelser har vist, at brugen af enten 16S rRNA-metabarkodning eller hel metagenomisk sekventering er egnet til mikrobiomundersøgelser15. Der er nye oplysninger om den mulige forbindelse mellem bakteriel mangfoldighed og deres metaboliske egenskaber under vinproduktion, hvilket kan hjælpe med at bestemme ønologiske egenskaber og terroir16.

Behovet for at maksimere fordelene ved de metagenomiske værktøjer ved hjælp af næste generations sekventering (NGS) til at studere drue- og vinmikrobiel økologi er blevet understreget16,17. Brugen af dyrkningsuafhængige metoder baseret på sekventering med høj kapacitet til at profilere mikrobiel mangfoldighed i fødevare- og fermenteringsøkosystemet er også blevet meget relevant og værdifuld for mange laboratorier og anbefales til industriel brug18,19. Det giver en fordel ved detektion og taksonomisk profilering af de nuværende mikrobielle populationer og bidraget fra miljømikrober, deres relative overflod og alfa- og betadiversitet20. Sekventering af den variable region i 16S-regionen er blevet et vigtigt genvalg og er blevet brugt under forskellige mikrobielle økologiske undersøgelser.

Mens mange undersøgelser fokuserer på svampe, især gær, under vingæring21, rapporterede denne undersøgelse 16S amplicon sekventering og bioinformatiske værktøjer, der blev brugt til at studere bakterierne under Traminette druer gæring til vinproduktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentel vinproduktion

  1. Få Traminnette druer fra Dynamis Estate vin i Jonesville, North Carolina vingård, destem og knus for at frigive most i to separate 600 L åbne fermentorer og lad dem stå på skind i ca. 4 dage med lågene på.
  2. Slå hætterne ned en gang om dagen for at holde skindene våde og begrænse produktionen af flygtig syre (VA).
    BEMÆRK: Ideen er, at mange af de aromatiske forstadier (monoterpener) sidder i skindene og efterlader saften i kontakt med huden for at øge vinens aromatiske potentiale.
  3. Efter 4 dage, pitch Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Denne gær blev valgt, da det er en stærk fermentor og er forbundet med at forbedre sortens karakter i vinen fra druerne.
  4. I den ene tank, Traminette R, tilsættes 20 g/hl Fermaid O, når brixen er på 17,7 og 20 g/hl Fermaid O og 12,5 g/hl Fermaid K ved 13,1 g/hl for at opnå gæringssikkerhed, mens den anden tank Traminette L tilsættes 40 g/hl Stimula Sauvignon blanc, når brixen er på 17,1. Tilsæt også 20 g/hl fermaid O, når brixen er på 13,4 for at fremhæve vinens sortskarakter.
  5. Der udtages dobbeltprøver af most (dag 1), tilsat gær (dag 4), gæret most (dag 15) og færdige vinprøver (dag 30), og opbevares ved -20 °C før DNA-ekstraktion og metagenomanalyse.

2. DNA-ekstraktion til metagenomforskning

  1. Opbevar alle ovennævnte dobbeltprøver på is indtil den første centrifugering.
  2. Overfør 20 ml af den fermenterede prøve til et sterilt 50 ml skruelågsrør.
  3. Tilsæt 10 ml koldt vand og homogeniser (hvirvel). Der centrifugeres i 1 min ved 800 x g ved 4 °C og overfør supernatanten til et nyt 50 ml glas.
    BEMÆRK: Dette trin fjerner prøvens faste stoffer.
  4. Trin 2.3 gentages to gange, og supernatanterne samles i samme glas.
  5. Supernatanten centrifugeres ved 3 000 x g ved 4 °C i 20 minutter for at pelletere cellerne. Supernatanten kasseres.
  6. Opslæmp pillen igen i 1 ml PBS, overfør den til et 2 ml skruelågsrør, og centrifuger ved 14.000 x g i 2 min. Udfør yderligere to vaske ved hjælp af PBS.
  7. På dette trin fryses pellets ved -20 ° C eller følg trin 2.8. Det er vigtigt, at alle prøverne behandles på samme måde.
  8. Der tilsættes 978 μL natriumphosphatbuffer. Der fremstilles natriumphosphatbuffer, tilsættes 3,1 g NaH2PO4· H2O og 10,9 gNa2HPO4 (vandfrit) til destilleret H2O for at give et volumen på 1 liter og justere pH til 7,4.
  9. Tilsæt 122 μL DNA-buffer (DNA-spinsæt) og hvirvelstrøm.
  10. Lad det stå i køleskabet (4 °C) i 45 min-1 time. Vortex prøverne hvert 15. minut. Dette trin kan efterlades natten over (o/n) eller indtil det er klar til at fortsætte med at bruge DNA-spinsættet.
  11. Overfør 1 ml prøve til et Lysis opløsning 1-rør (DNA-spin-kit) og stram hætten (skriv prøvenummeret på siden af røret og ikke på hætten; kit-reagenserne fjerner alt, hvad der er skrevet på hætten).
  12. Homogeniser prøven i en perlebankesliber (6,5 m / s, CY: 24 x 2) i 60 s tre gange. Hvis perlekværnen har enheden til at lægge is, skal du lægge 50 g tøris under rørene. Hvis ikke, opbevares prøverne på våd is i 5 minutter mellem hvert homogeniseringstrin.
  13. Centrifuge Lysing Matrix E-rør (DNA-spin-sæt) i 1 min ved 16800 x g (eller maksimal hastighed).
  14. Supernatanten overføres til et rent mikroglas. Derefter tilsættes 250 μL proteinudfældningsopløsning (PPS) reagens (DNA-spinsæt) og blandes ved at ryste røret manuelt 10 gange.
  15. Centrifuger i 5 min ved 16800 x g for at pelletere bundfaldet.
  16. Supernatanten overføres til et sterilt 15 ml glas. Der tilsættes 1 ml bindingsmatrixsuspension (DNA-spinsæt) til supernatanten.
    BEMÆRK: Resuspender bindingsmatrixsuspensionen før brug, indtil den er homogen.
  17. Vend rørene i hånden i 2 minutter, og lad derefter rørene stå i et stativ i 3 minutter (for at tillade bundfældning af silicamatrix).
  18. Fjern forsigtigt 1 ml supernatant. Matricen i den resterende supernatant resuspenderes.
  19. 600 μL af blandingen overføres til et centrifugeringsfilterrør (DNA-spinsæt) og centrifugeres i 1 min ved 14500 x g.
  20. Tilsæt den resterende blanding og centrifuger.
  21. Dekanter gennemstrømning og tilsæt 500 μL vaskeopløsning (DNA-centrifugeringssæt) i centrifugeringsfilterrøret og centrifuger i 1 min ved 14500 x g (sørg for at tilføje EtOH til vaskeopløsningen; se produkthåndbogen). Dekanter gennemstrømningen, og gentag vasken to gange mere (3 vaske i alt).
  22. Gennemstrømningen dekanteres, og centrifugeres i yderligere 2 minutter ved 14.500 x g for at tørre matrixen af restvaskeopløsningen.
  23. Fjern centrifugeringsfilteret, og læg det i et frisk opsamlingsrør (DNA-spinsæt). Lufttør centrifugeringsfilteret i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
  24. Opvarm det DNA-frie vand (DNA-centrifugeringssæt) ved 55 °C i 5 min. Tilsæt 50 μL DNAse-frit vand og rør forsigtigt matricen på filtermembranen med en pipettespids for effektiv eluering af DNA'et. Lad prøverne stå ved RT i 1 min, centrifuger derefter i 1 min ved 14500 x g for at eluere DNA.
  25. Anbring prøverne på is. Hæld prøveblandingen (2 μL prøve + 2 μL vand + 1 μL påfyldningsbuffer) i en gel. Mål DNA-koncentrationen.
  26. Prøverne opbevares ved -20 °C.
  27. Brug et spektrofotometer til at kvantificere det ekstraherede DNA.
    BEMÆRK: Et 1 μL volumen DNA blev droppet og kvantificeret, og kvaliteten af DNA blev noteret i et A260/A280-forhold.

3. DNA-elektroforese

  1. Forbered 1% agarosegel i 0,5 Tris/Borat/EDTA (TBE) buffer (20 ml for en minigel, 70-100 ml for en medium gel). Vejen agarose + buffer, kog i mikrobølgeovn for at smelte agarose, vej igen, og tilsæt dH2O til den oprindelige vægt. Agaroseopløsningen afkøles til 55-60 °C og hældes i gelformeren med kamsamling. Lad gelen størkne.
  2. Der tilsættes 1 μL 10x gelpåfyldningsbuffer til prøven (10 μL) og lægges på gelen ved siden af en molekylvægtsmarkør. Kør fra negativ (sort) til positiv (rød) ved 100-115 V (stor gel) eller 90 V (mini gel), indtil det blå farvestof er nær bunden.
  3. Plettegel i 30 min i 1 μL/ml ethidiumbromid eller SYBR-grøn (nitrilhandsker og beskyttelsesbriller er nødvendige), skyl i vand og se under en ultraviolet (UV) lyskilde. Fra duplikatprøverne skal du vælge det højeste udbytte til videre behandling.

4. Sekvensering med høj kapacitet

  1. Forstærk V4 hypervariabel region af 16S rRNA-genet ved hjælp af specifikke primere 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') og 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Polymerasekædereaktionsbetingelserne (PCR) indstilles til 94 °C i 2 minutter, 30 cyklusser med 94 °C i 20 s, 58 °C i 20 sekunder, 65 °C i 1 minutter og 65 °C i 10 minutter (endelig forlængelse).
  2. Udfør PCR-reaktioner med en high-fidelity PCR-masterblanding (Table of Materials).
  3. Generer biblioteker med DNA-biblioteksforberedelsessæt, og sekvenser derefter ved hjælp af parret sekvensering på en sekventeringsplatform.
    BEMÆRK: Her blev bibliotekerne genereret med NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit sekventeret ved hjælp af parret Illumina-sekventering (2 × 250 bp) på novaseq6000-platformen.
  4. Følg sekventeringstrinnene:
    1. Trin 1: Skær DNA'et med et enzym, normalt ved en metode, der vælger en generel størrelse.
      1. Tilsæt 3,5 μL sekventeringsbuffer og 1,5 μL enzymblanding til 25 μL DNA (ca. 1 μg,), bland 10 gange med en pipette og drej hurtigt.
      2. Anbring i en termocyklist med følgende betingelser: forvarm låget ved 75 °C, (1) 30 min i 20 °C (2) 30 min til 65 °C (3) hold ved 4 °C.
    2. Trin 2: Tilføj adaptere via ligering
      1. Tilsæt 15 μL ligeringsmasterblanding, 1,25 μL adapter, 0,5 μL ligeringsforstærker og 30 μL endprep DNA-blanding med en pipette.
      2. Der inkuberes ved 20 °C i 15 minutter i en termocyklist, og der tilsættes derefter 1,5 μL uracilspecifikt excisionsreagens (USER) enzym til ligeringsblandingen for at opnå i alt 48,26 μL. Der inkuberes 37 °C i 15 minutter.
      3. Tilsæt 43,5 μL magnetiske perler til adapterens ligerings-DNA, bland 20 gange med en pipette og inkuber i 5 minutter ved RT. Adskil perlerne med et magnetstativ, inkuber derefter i 5-10 minutter, og kassér supernatanten.
      4. Pellet vaskes med 100 μL 80% ethanol, tørres i 30 sek. og vaskes igen. Eluerperler og pellet i 8,5 μL 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLCH 20, blandes med en pipette og inkuberes ved RT i 2 min.
      5. Der inkuberes i magnetstativet, og 7,5 μL elueret DNA fjernes som supernatant. Placer eluen i et nyt rør og udfør et PCR-trin.
      6. Først tilsættes 12,5 μL masterblanding, 2,5 μL indeksprimer i7-primer og 2,5 μL universal PCR-primer/i5-primer til 7,5 μL adapterligeret DNA for at opnå 25 μL PCR-reaktionsblanding. Brug følgende PCR-betingelse: Forvarm låget til 103 °C. 98 °C i 30 s, 98 °C i 10 s, 65 °C i 75 s, 65 °C i 5 minutter og hold det ved 4 °C efter 10 cyklusser.
      7. Rens det 25 μL amplificerede DNA. Tilsæt 22,5 μL magnetiske perler og bland 20 gange. Der inkuberes ved RT i 5 minutter og fjernes 50 μL supernatant. Vask perlerne med 100 μL 80% ethanol, og fjern al ethanol ved at tørre perlerne forsigtigt i 30 sekunder.
      8. Resuspender de mørkebrune perler i 16 μL vand, bland 20 gange med en pipette og læg dem i magnetstativet i 30-60 sekunder. Overfør 15 μL til et nyt rør.
      9. Bestem DNA-koncentrationen ved hjælp af et fluorometer. Bland 90 μL buffer + 1 μL farvestof + 2 μL DNA-biblioteksprøve, og aflæs koncentrationen. Fortynd DNA'et til 2 nM, læg 27-30 μL i flowcellen, og læg det i sequenceren.
    3. Trin 3: Sekvenser adapterne, hybridiser bibliotekerne genereret ovenfor til matrixen i den mønstrede flowcelle, og fang DNA i henhold til producentens instruktioner. Brug den som skabelon for den anden syntese.
      1. Forstærk derefter den anden streng til en klonal klynge. Lineariser klyngen og bloker de aktive websteder. Tilsæt sekventeringsprimer for at tilvejebringe et sted til sekventering ved syntese i sekvensen i henhold til producentens protokol.
        BEMÆRK: Kemisk binder de modificerede nukleotider til DNA-skabelonstrengen ved hjælp af naturlig komplementaritet. Hvert nukleotid har et fluorescerende mærke og en reversibel terminator, der blokerer inkluderingen af den næste base. Derfor indikerer tilstedeværelsen af et fluorescerende signal, hvilket nukleotid der indsættes, og terminatoren spaltes for den næste base at binde.
    4. Trin 4: Forstærk den enkeltbundne streng for at give klynger af sekvenser, der sekventeres i tandem ved syntese.
      BEMÆRK: Klyngerne giver et lysere signal end en enkelt streng gennem tovejsscanning og tokanals sekventeringskemi. Sekventeringssoftwaren overfører automatisk basisopkaldsfiler (*.cbcl) til den angivne outputmappeplacering til dataanalyse.

5. Bioinformatik

  1. Generer sekvensdataene som FASTQ-filer. Analysér for at medtage følgende dele.
    1. Del I:
      1. Gem FASTQ-filerne, der er hentet fra sequenceren, klik for at åbne en regnearksfil, og opret kortlægnings- / metadatafiler.
      2. Åbn Nephele-webstedet (https://nephele.niaid.nih.gov/), upload FASTQ-filerne, læs QC, filtrering og trimning i QIIME222. Deponere de rå sekvenser som sekvenslæsningsarkiv (SRA) og GenBank i NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. Del II: Gå til Nephele-webstedet (https://nephele.niaid.nih.gov/), foretag de demultipleksede parrede endelæsninger, filterudskiftning og kimærfejl, og flet ved hjælp af DADA223. Brug Naive Bayes-klassifikatoren, der er trænet på Silva version 132 99% OTU-databasen, til at udføre bakteriel taksonomisk tildeling ved 97% lighed24.
    3. Del III: Åbn MicrobiomeDB-webstedet, klik for at uploade filer, og generer OTU-alfadiversitet, beta-mangfoldighed, relativ overflod og sjældenhedskurver (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. Del IV: Åbn et regneark, og overfør data for at lave varmekort, Venn-diagrammer og lineær diskriminantanalyseeffektstørrelse (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Statistisk analyse

  1. Åbn QIIME222, og bestem de signifikante forskelle i alfadiversitet mellem grupper ved hjælp af alfagruppesignifikansscriptet. Dette vil også udføre Kruskal-Wallis-testen.
  2. Bestem forskellene i betadiversitet mellem grupper ved hjælp af PERMANOVA, herunder en parvis test25.
  3. Få de betydelige forskelle i bakteriesamfundsstrukturen blandt grupperne, der bruger MicrobiomeDB. En p-værdi ≤0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mængden og kvaliteten af DNA ekstraheret fra druemost, gæringsvin og endelig vin blev først bestemt; mængdeværdien varierer fra 15-87 ng/μL (tabel 1).

Sekventering og bioinformatik
Illumina high throughput sequencer genererede en FASTQ-fil, der blev importeret til Nephele og set på QIIME 2 platform26. For det første blev FastQC-software brugt til at kontrollere sekvenskvaliteten. Derefter blev den trimmet i både 5'- og 3'-ender for at eliminere nukleotider af dårlig kvalitet, denoised, fusioneret og udtømt af kimære sekvenser, før den klyngede sig til OTU'er (operationel definition for en art) ved hjælp af DADA2 denoiser23. De blev kortlagt til bakterietaxa ved hjælp af SILVA v138.1-databasen. Sekvenserne blev grupperet i OTU baseret på 99% nukleotidsekvenslighed. Figur 1 viser DADA2-sjældenhedskurverne for OTU'erne; Det nåede et plateau. Dette indikerede, at nok sekvenser var dækket til at indikere størstedelen af den mikrobielle mangfoldighed. Replikat analyse af sekvenserne genererede ingen signifikant forskel.

Varmekortet baseret på den relative forekomst af bakterier ved forskellige regimer fra druemost til vin er vist i figur 2. Den mest dominerende phyla angivet i rødt består af proteobakterier, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota og efterfulgt af Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota og Acidobacteriota. De mindst rigelige bakterier blev angivet med blåt. Mange af disse grupper var til stede i most, når gær blev tilsat, men fraværende under gæring, især Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota og Elusimicrobiota. Den relative forekomst blev også bestemt på slægtsniveau, og resultaterne indikerede vigtige slægter som Enterobacteriaceae og Lactobacillaceae, som vist i figur 3. En Venn-diagramanalyse af den delte unikke OTU afslørede, at 15 bakterier var til stede fra vindruemosten til den endelige vin (figur 4). Resultaterne af amplicon sekventering baseret på V4 variabel region indikerede også alfa mangfoldighed i de to Traminette R og L. Figur 4 viser artens ensartethed som et tegn på fordeling, hvilket er forskelligt mellem de to ernæringsbehandlinger. Dataene viste, at mangfoldighedsskiftet i Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O var lavere end 1 ved 13,4 brix, og jævnheden nærmer sig nul, da den relative overflod varierer. Dataene blev også analyseret for beta-mangfoldighed; Figur 5 viser forskellen mellem de to fermenteringstraminetter R og L; Bakterierne var ens på most- og gærtilsatte stadier. Der var et skift i bakterierne på gæringsstadiet for de to behandlinger, og det ser ens ud i den endelige vin (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Rarefaktionsdiagrammer for observerede OTU'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Relativ overflod varmekort. Varmekortet over den relative tæthed på phylumniveauer R og L var ikke signifikant forskellige (p ≤0,05). Forklaringslinjen angiver nøglescoren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Relativ tæthed af de ti bedste taxa. Den relative forekomst på slægtsniveau af top ti taxa rangeret af medier med Wilcoxon rangsumstest (p ≤0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Venn-diagram. De unikke og delte bakterier blandt mosten, gær tilsat, gæring og vin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Alfadiversitet af Traminette R og Traminette L. Alfadiversitet af Shannons H-indeks for de to ernæringsmæssige Fermaid O og Stimula Sauvignon blanc og Fermaid O (Dunn > 0,05) baseret på analysen af Kruskal-Wallis test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Analyse af hovedkomponenter. Hovedkomponentanalyse af 16S rRNA-data for betadiversitet baseret på Bray-Curtis af de to ernæringsmæssige Fermaid O og Stimula Sauvignon Blanc og Fermaid O på forskellige stadier af vinproduktionen. Den blå cirkel repræsenterer en klynge af most- og gærtilsætningstrin. Den røde cirkel angiver den endelige vin, og den sorte cirkel er gæringstrinnet i de to behandlinger. Akse 1 og 2 er variationer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Dato for prøveudtagning Prøve A260/A280 Koncentration ng/μL Traminette R A260/A280 Koncentration ng/μL Traminette L
8/30/21 Drue 1.762 37 1.75 28
8/31/31 Måtte 1.769 23 1.818 20
09-02-2021 Hvile 1.667 15 -1 1
09-04-2021 Gær tilsat 2.185 59 1.968 61
09-06-2021 Gæring 2.023 87 2.048 43
09-09-2021 Gæring 3.4 17 2.048 43
9/14/21 Endelig vin 2.143 30 2.042 49

Tabel 1: Mængden og kvaliteten af DNA udvundet af druemost, gæringsvin og slutvin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen for metagenomik starter fra prøveudtagningen af druemosten, og når gær blev tilsat mosten, gæringsvinen og de endelige vinprøver. Dette blev efterfulgt af duplikeret DNA-ekstraktion, der med succes blev ekstraheret fra disse prøver. De fremstillede mængder varierede i koncentration fra 15 ng / μL til 87 ng / μL. Dette viser, at DNA-ekstraktionsprotokollen er effektiv til metagenomiske undersøgelser af vin. Selvom kvaliteten af DNA'et ved A260/A280 varierer, kan dette tilskrives forskellige parametre, der kan påvirke ekstraktion, såsom alkoholkoncentration og andre fermenteringsmetabolitter, der udviklede sig under og efter gæring, samt andre organiske plantematerialer, der kan hæmme genomekstraktion. Tidligere undersøgelser har rapporteret en lignende observation af det metagenomiske plantemateriale27. DNA'et ekstraheret i den beskrevne protokol opnåede imidlertid en mængde, der var tilstrækkelig til det næste trin i analysen. PCR-stregkoden, der er nødvendig til metagenomiske undersøgelser, især ved hjælp af Illumina-sekventeringsplatformen, kræver, at minimums-DNA-mængden indstilles til 1 ng / L. V4-regionen blev sekventeret, og bestemmelsen af bakteriediversiteten kræver anvendelse af 16S rRNA-gensekventering; dette gen har forskellige variable regioner fra V1-V923. I alt 6.393.443 parrede sekvenser med et gennemsnit på 399590.1875 ± 138442.6148 fra DNA ekstraheret fra de forskellige prøver. V4 har været almindeligt anvendt, og det kaldes den hypervariable region af genet, der er godt til bakteriel taksonomisk og mangfoldighedsanalyse. Under sekventering blev parret Illumina-sekventering ca. 200-300 bp sekvenser genereret. Der er forskellige platforme, der anvendes til sekventering af DNA ekstraheret fra fødevarer og gærede drikkevarer28. Årsagerne til at bruge Illumina-platformen er følgende: (1) Illumina er en 2. anden generations sekventeringsplatform med fremragende output, og dens kemi giver en lav fejlrate og profil. Det er også overkommeligt sammenlignet med tilgængelige kommercielle sæt til biblioteksforberedelse, og dets relativt korte læsninger er ideelle til differentieret udtryk. Det sidste trin i protokollen var bioinformatik, en vigtig komponent i brugen af amplicon 16-sekventering til bestemmelse af mikrobiel mangfoldighed. Kvalitetskontrollen af sekvenserne FASTQ-fil opnået var meget god, og OTU'erne opnået fra QIIME resulterede i en taksonomisk analyse vist i resultaterne af relativ overflod, alfa og beta mangfoldighed.

Næste generations sekventering (NGS) er blevet et vigtigt redskab til profilering af bakterierne i forskellige fermenteringsmikrobielle samfund. I denne undersøgelse blev 16S amplicon klassifikationen først udført på phylum niveau, og en mere forskelligartet gruppe bakterier blev bemærket end tidligere rapporteret12 under drue vin gæring; 15 phyla blev også delt, som det fremgår af analysen af Venn-resultatet. Analyse på slægtsniveau viste også tilstedeværelsen af vigtige slægter, såsom Enterobacteriaceae og Lactobacillaceae, der var mere rigelige i Traminette R-tanken. Vi begrænsede vores analyse til taksonomi på slægtsniveau; Der er undersøgelser, hvor metoden er blevet anvendt til identifikation på artsniveau taksonomi gennem højopløsningsprøveslutning23. En af begrænsningerne ved amplicon sekventering er, at sekvensdataene ikke kan bestemme stammeniveau taksonomi på grund af den korte længde af 16S rRNA-sekvensen. En anden begrænsning er påvisning af chloroplast og mitokondrier. Det vil være ønskeligt, hvis den bioinformatiske procedure kan anvendes til at eliminere disse sekvenser, da de er forurenende stoffer af drueplanter. Imidlertid amplifikationsprotokol, der anvender PNA-DNA-klemmer til at maksimere kloroplast- og mitokondrieforurening29. Den høje forekomst af Firmicute i druer må under gæringen og den endelige vin stemme overens med de tidligere undersøgelser af druer30. Resultaterne af alfadiversitetsanalysen indikerede bakteriernes ensartethed af hver fermenteringsernæringsbehandling; det ser ud til, at Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O-næringsstoffet genererede en mere forskelligartet bakterie. Derudover viste betadiversitetsdataene skiftet i bakterierne på fermenteringsstadiet; Dynamiske ændringer indikerer, at fermenteringstrinnet er en meget vigtig periode, hvor de ernæringsmæssige ændringer påvirker bakteriel selektion. Teknikken kan tilpasses og anvendes af industrier til at overvåge fermentering og forbedre kvalitet og konsistens28. Der vil dog være behov for yderligere undersøgelser for bedre at forstå virkningen af organiske næringsstoffer på mikrobiel mangfoldighed under vingæring.

Denne undersøgelse er den første til at undersøge bakteriediversiteten under gæringen af Traminette druer og vin ved hjælp af 16S amplicon stregkodesekventering for at bestemme bakterieændringerne. Dette bekræftede mangfoldigheden af bakterier på phylum og slægtsniveau. Proteobakterier, efterfulgt af Firmicutes, var de mest rigelige, da gæringen skred frem til den endelige vin. Mange phyla, der ikke tidligere blev rapporteret, blev påvist ved hjælp af 16S amplicon sekventering, og dette bekræftede, at metoden kan bruges til at overvåge vinproduktionen. Alfadiversitet viste betydningen af ernæringsændringer; Det påvirkede fermenteringsbakterierne, mens beta-diversitet indikerer ændringerne under fermenteringsfasen. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge de funktionelle roller, som mange af de beskrevne phyla og slægter spiller i vingæring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Finansiering fra Appalachian State University Research Council (URC) tilskud og CAPES Print Travel stipendium, der støttede FAO's besøg på Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasilien, anerkendes taknemmeligt. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. ECPDM er taknemmelig for CAPES Print Travel-stipendiet, der støttede hendes besøg på Appalachian State University. ECPDM er forsker 2 fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasilien (CNPq).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).

Tags

Biologi udgave 202
Profilering af bakteriesamfundet af fermenterende traminettedruer under vinproduktion ved hjælp af metagenomisk amplicon sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goppold, A., Conradie, L., Almeida,… More

Goppold, A., Conradie, L., Almeida, O. G. G. d., De Martinis, E. C. P., Oguntoyinbo, F. A. Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (202), e65598, doi:10.3791/65598 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter