Summary
Hier presenteren we een protocol om amplicon metagenomic te beschrijven voor het bepalen van de bacteriële gemeenschap van Traminette-druiven, fermenterende druiven en uiteindelijke wijn.
Abstract
Vooruitgang in sequencingtechnologie en de relatief gemakkelijke toegang tot het gebruik van bio-informatica-instrumenten om microbiële gemeenschapsstructuren te profileren, hebben een beter begrip mogelijk gemaakt van zowel kweekbare als niet-kweekbare microben in druiven en wijn. Tijdens industriële fermentatie zijn microben, bekend en onbekend, vaak verantwoordelijk voor productontwikkeling en bijsmaak. Daarom kan het profileren van de bacteriën van druif tot wijn een gemakkelijk begrip van de in situ microbiële dynamiek mogelijk maken. In deze studie moeten de bacteriën van Traminette-druiven fermentatie ondergaan en werd de uiteindelijke wijn onderworpen aan DNA-extractie die 15 ng/μL tot 87 ng/μL opleverde. Het 16S-amplicon van het hypervariabele gebied van het V4-gebied werd gesequenced, relatief overvloedige bacteriën bestaande uit phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota en gevolgd door de Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota en Acidobacteriota. Een analyse van het Venn-diagram van de gedeelde unieke operationele taxonomische eenheden (OTU) onthulde dat 15 bacteriephyla gemeenschappelijk waren voor zowel druivenmost, gistingsfase als uiteindelijke wijn. Phyla die niet eerder werden gerapporteerd, werden gedetecteerd met behulp van de 16S-ampliconsequencing, evenals geslachten zoals Enterobacteriaceae en Lactobacillaceae. Variatie in het gebruik van organische voedingsstoffen in wijn en de impact ervan op bacteriën werd getest; Traminette R-tank met Fermaid O en Traminette L gestimuleerd met Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alfa-diversiteit met behulp van de Kruskal-Wallis-test bepaalde de mate van gelijkmatigheid. De bètadiversiteit duidde op een verschuiving in de bacteriën in de fermentatiefase voor de twee behandelingen, en de uiteindelijke wijnbacteriën leken op elkaar. De studie bevestigde dat 16S-ampliconsequencing kan worden gebruikt om bacterieveranderingen tijdens de wijnproductie te volgen om de kwaliteit en een beter gebruik van druivenbacteriën tijdens de wijnproductie te ondersteunen.
Introduction
Traminette-druif wordt gekenmerkt door productie van superieure wijnkwaliteit, naast een aanzienlijke opbrengst en gedeeltelijke resistentie tegen verschillende schimmelinfecties 1,2,3. De natuurlijke fermentatie van druiven is afhankelijk van bijbehorende micro-organismen, de wijnproductieomgeving en fermentatievaten 4,5. Vaak vertrouwen veel wijnmakerijen op wilde gist en bacteriën voor fermentatie, productie van alcohol, esters, aroma en smaakontwikkeling6.
Het doel van deze studie is om de bacteriële samenstelling van druiven te onderzoeken en hun dynamiek tijdens de fermentatie te volgen. Hoewel het moderne gebruik van starterculturen zoals Saccharomyces cerevisiae voor primaire gisting, waar alcohol wordt geproduceerd, gebruikelijk is voor verschillende wijnstijlen7. Bovendien verbetert de nagisting, waarbij appelzuur door Oenococcus oeni wordt gedecarboxyleerd tot melkzuur, het organoleptische en smaakprofiel van de wijn en vermindert het de zuurgraad van wijn 8,9. Met de recente vooruitgang in het gebruik van cultuuronafhankelijke methoden is het nu mogelijk om verschillende microben te bepalen die verband houden met de wijndruif en de soorten die worden overgebracht naar most en die op verschillende tijdstippen tot aan het eindproduct aan de gisting deelnemen10.
De rol en dynamiek van wilde bacteriën van verschillende druiven die tijdens de wijngisting in de most worden overgebracht, worden slecht begrepen. De taxonomie van veel van deze bacteriën is niet eens bekend, of hun fenotypische eigenschappen zijn niet gekarakteriseerd. Dit maakt hun toepassing in cocultuurfermentatie nog steeds slecht onderbenut. Er is echter gebruik gemaakt van microbiologische kweekanalyse om de bacteriepopulatie te bepalen die verband houdt met druiven en wijn10. Het is algemeen bekend dat selectieve kweekbeplating vervelend is, vatbaar voor contaminatie, een lage reproduceerbaarheid heeft en dat de output twijfelachtig kan zijn; Het mist ook bacteriesoorten waarvan de groeibehoefte onbekend is. Eerdere studies geven aan dat cultuuronafhankelijke, op 16S rRNA-genen gebaseerde methodologieën een betrouwbaardere en kosteneffectievere benadering bieden voor het karakteriseren van complexe microbiële gemeenschappen11. Het sequencen van de hypervariabele regio's van het 16S rRNA-gen is bijvoorbeeld met succes gebruikt om bacteriën in druivenbladeren, bessen en wijn te bestuderen 12,13,14. Studies hebben aangetoond dat het gebruik van 16S rRNA-metabarcoding of volledige metagenomische sequencing geschikt is voor microbioomstudies15. Er is steeds meer informatie beschikbaar over het mogelijke verband tussen bacteriële diversiteit en hun metabolische eigenschappen tijdens de wijnproductie, wat zou kunnen helpen bij het bepalen van de oenologische eigenschappen en het terroir16.
De noodzaak om de voordelen van de metagenomische instrumenten te maximaliseren met behulp van next-generation sequencing (NGS) om de microbiële ecologie van druiven en wijn te bestuderen, is benadrukt16,17. Ook het gebruik van cultuuronafhankelijke methoden op basis van high-throughput sequencing om de microbiële diversiteit van het voedsel- en fermentatie-ecosysteem te profileren, is voor veel laboratoria zeer relevant en waardevol geworden en wordt aanbevolen voor industrieel gebruik18,19. Het biedt een voordeel van detectie en taxonomische profilering van de huidige microbiële populaties en de bijdrage van omgevingsmicroben, hun relatieve abundantie en alfa- en bètadiversiteit20. De sequentiebepaling van het variabele gebied van het 16S-gebied is een belangrijk gen bij uitstek geworden en is gebruikt tijdens verschillende microbiële ecologische studies.
Hoewel veel studies zich richten op schimmels, met name gist, tijdens wijnfermentatie21, rapporteerde deze studie de 16S-ampliconsequencing en bio-informaticatools die worden gebruikt om de bacteriën te bestuderen tijdens de fermentatie van Traminette-druiven voor wijnproductie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentele wijnproductie
- Verkrijg Traminnette-druiven van Dynamis Estate-wijn in de wijngaard van Jonesville, North Carolina, ontsteel en plet om most vrij te geven in twee afzonderlijke open fermentoren van 600 liter en laat ze ongeveer 4 dagen op de schil zitten met de deksels erop.
- Pons de doppen eenmaal per dag naar beneden om de huid nat te houden en de productie van vluchtige zuren (VA) te beperken.
OPMERKING: Het idee is dat veel van de aromatische precursoren (monoterpenen) zich in de schillen bevinden en het sap in contact laten komen met de schil om het aromatische potentieel van de wijn te vergroten. - Pitch na 4 dagen Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Deze gist is geselecteerd omdat het een sterke gister is en wordt geassocieerd met het versterken van het raskarakter in de wijn van de druiven.
- Voeg in de ene tank, Traminette R, 20 g/hL Fermaid O toe wanneer de brix 17,7 is en 20 g/hL Fermaid O en 12,5 g/hL Fermaid K bij 13,1 g/hL om de gistingszekerheid te bereiken, terwijl de andere tank Traminette L, 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc toevoegt wanneer de brix 17,1 is. Voeg ook 20 g/hL Fermaid O toe wanneer de brix 13,4 is om het raskarakter van de wijn te versterken.
- Neem duplicaatmonsters van most (dag 1), toegevoegde gist (dag 4), gefermenteerde most (dag 15) en afgewerkte wijnmonsters (dag 30) en bewaar deze bij -20 °C vóór DNA-extractie en metagenomische analyse.
2. DNA-extractie voor metagenomica
- Bewaar alle hierboven verkregen duplicaatmonsters op ijs tot de eerste centrifugatie.
- Breng 20 ml van het gefermenteerde monster over in een steriele buis met schroefdop van 50 ml.
- Voeg 10 ml koud water toe en homogeniseer (vortex). Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 800 x g bij 4 °C en breng het supernatans over in een nieuw buisje van 50 ml.
NOTITIE: Bij deze stap worden de vaste stoffen van het monster verwijderd. - Herhaal stap 2.3 twee keer en doe de supernatanten samen in dezelfde buis.
- Centrifugeer supernatans bij 3.000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi de supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS, breng over naar een buis met schroefdop van 2 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten op 14.000 x g . Voer nog twee wasbeurten uit met PBS.
- Vries de pellets bij -20°C in bij -20°C of volg stap 2.8. Het is belangrijk dat alle monsters op dezelfde manier worden behandeld.
- Voeg 978 μL natriumfosfaatbuffer toe. Bereid natriumfosfaatbuffer voor, voeg 3,1 g NaH2PO4· H2O en 10,9 g Na2HPO4 (watervrij) tot gedistilleerd H2O om een volume van 1 L te maken en de pH aan te passen tot 7,4.
- Voeg 122 μL DNA-buffer (DNA-spinkit) en vortex toe.
- Laat het 45 min-1 uur in de koelkast (4 °C) staan. Draai de monsters elke 15 minuten vortex. Deze stap kan een nacht (o/n) worden gelaten of totdat u klaar bent om de DNA-spinkit te blijven gebruiken.
- Breng 1 ml monster over in een buisje met lysisoplossing 1 (DNA-spinkit) en draai de dop vast (schrijf het monsternummer op de zijkant van het buisje en niet op de dop; de reagentia van de kit verwijderen alles wat op de dop staat).
- Homogeniseer het monster driemaal in een parelklopmolen (6,5 m/s, CY: 24 x 2) gedurende 60 s. Als de kralenmolen het apparaat heeft om ijs te doen, doe dan 50 g droogijs onder de buizen. Als dit niet het geval is, bewaar de monsters dan 5 minuten op nat ijs tussen elke homogenisatiestap.
- Centrifugeer Lysing Matrix E-buisjes (DNA-spinkit) gedurende 1 minuut bij 16800 x g (of maximale snelheid).
- Breng het supernatans over in een schone microbuis. Voeg daarna 250 μL eiwitprecipitatieoplossing (PPS) reagens (DNA-spinkit) toe en meng door de buis 10 keer met de hand te schudden.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 16800 x g om het neerslag te pelleteren.
- Breng het supernatans over in een steriele buis van 15 ml. Voeg 1 ml binding matrix suspensie (DNA spin kit) toe aan de supernatant.
NOTITIE: Resuspendeer de bindingsmatrixsuspensie voor gebruik totdat deze homogeen is. - Keer de buizen 2 minuten met de hand om en laat de buizen vervolgens 3 minuten in een rek staan (om de silicamatrix te laten bezinken).
- Verwijder voorzichtig 1 ml van het supernatant. Resuspendeer de matrix in de resterende supernatant.
- Breng 600 μl van het mengsel over in een spinfilterbuis (DNA-spinkit) en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14500 x g.
- Voeg het resterende mengsel toe en centrifugeer.
- Decanteer de doorstroming en voeg 500 μL wasoplossing (DNA-spinkit) toe aan de centrifugefilterbuis en centrifugeer gedurende 1 minuut op 14500 x g (zorg ervoor dat u EtOH toevoegt aan de wasoplossing; zie het producthandboek). Decanteer de doorstroming en herhaal de was nog twee keer (3 wasbeurten in totaal).
- Decanteer de doorstroming en centrifugeer nog eens 2 minuten op 14.500 x g om de matrix van de resterende wasoplossing te drogen.
- Verwijder het spinfilter en plaats het in een nieuwe opvangbuis (DNA-spinkit). Laat het centrifugefilter 5 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur (RT).
- Verwarm het DNAse-vrije water (DNA spin kit) gedurende 5 minuten op 55 °C. Voeg 50 μL DNAse-vrij water toe en roer de matrix voorzichtig op het filtermembraan met een pipetpunt voor een efficiënte elutie van het DNA. Laat de monsters 1 minuut op RT staan en centrifugeer vervolgens 1 minuut op 14500 x g om DNA te elueren.
- Leg de monsters op ijs. Vul het monstermengsel (2 μL monster + 2 μL water + 1 μL laadbuffer) in een gel. Meet de DNA-concentratie.
- Bewaar de monsters bij -20 °C.
- Gebruik een spectrofotometer om het geëxtraheerde DNA te kwantificeren.
OPMERKING: Een volume van 1 μL DNA werd gedropt en gekwantificeerd, en de kwaliteit van het DNA werd genoteerd in een A260/A280-verhouding.
3. DNA-elektroforese
- Bereid 1% agarosegel in 0,5 Tris/Boraat/EDTA (TBE) buffer (20 ml voor een minigel, 70-100 ml voor een medium gel). Weeg agarose + buffer, kook in de magnetron om agarose te smelten, weeg opnieuw en voeg dH2O toe aan het oorspronkelijke gewicht. Koel de agarose-oplossing af tot 55-60 °C en giet in de gelvormer met kam. Laat de gel stollen.
- Voeg 1 μL 10x gellaadbuffer toe aan het monster (10 μL) en laad op de gel naast een molecuulgewichtmarker. Loop van negatief (zwart) naar positief (rood) bij 100-115 V (grote gel) of 90 V (minigel) totdat de blauwe kleurstof bijna onderaan zit.
- Vlekgel gedurende 30 minuten in 1 μL/ml ethidiumbromide of SYBR groen (nitrilhandschoenen en veiligheidsbril nodig), spoelen in water en bekijken onder een ultraviolette (UV) lichtbron. Selecteer uit de gedupliceerde monsters de hoogste opbrengst voor verdere verwerking.
4. Sequencing met hoge doorvoer
- Amplificeer het V4 hypervariabele gebied van het 16S rRNA-gen met behulp van specifieke primers 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') en 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Stel de omstandigheden van de polymerasekettingreactie (PCR) in op 94 °C gedurende 2 min, 30 cycli van 94 °C gedurende 20 s, 58 °C gedurende 20 s, 65 °C gedurende 1 minuut en 65 °C gedurende 10 min (laatste verlenging).
- Voer PCR-reacties uit met een high-fidelity PCR-mastermix (Materiaaltabel).
- Genereer bibliotheken met een DNA-bibliotheekvoorbereidingskit en sequentie vervolgens met behulp van paired-end sequencing op een sequencingplatform.
OPMERKING: Hier werden de bibliotheken die zijn gegenereerd met NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit gesequenced met behulp van paired-end Illumina-sequencing (2 × 250 bp) op het novaseq6000-platform. - Volg de stappen voor het rangschikken:
- Stap 1: Scheer het DNA af met een enzym, meestal door een methode die selecteert voor een algemene grootte.
- Voeg 3,5 μL sequentiebuffer en 1,5 μL enzymmix toe aan 25 μL DNA (ca. 1 μg), meng 10 keer met een pipet en draai snel.
- Plaats in een thermocycler met de volgende voorwaarden: verwarm het deksel voor op 75°C, (1) 30 min voor 20 °C (2) 30 min voor 65 °C (3) houd op 4°C.
- Stap 2: Adapters toevoegen via ligatie
- Voeg 15 μL ligatiemastermix, 1,25 μL adapter, 0,5 μL ligatieversterker en 30 μL endprep DNA-mix toe met een pipet.
- Incubeer bij 20 °C gedurende 15 minuten in een thermocycler en voeg vervolgens het uracil-specifieke excisiereagens (USER)-enzym (1,5 μl) toe aan het ligatiemengsel om een totaal van 48,26 μl te verkrijgen. Incubeer 37 °C gedurende 15 min.
- Voeg 43,5 μL magnetische kralen toe aan het DNA van de adapterligatie, meng 20 keer met een pipet en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Scheid de kralen met een magnetisch rek, incubeer vervolgens gedurende 5-10 minuten en gooi het supernatant weg.
- Was de pellet met 100 μL 80% ethanol, droog gedurende 30 s en was opnieuw. Eluteer korrels en pellets in 8,5 μL 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, meng met een pipet en incubeer gedurende 2 minuten bij RT.
- Incubeer in het magnetische rek en verwijder 7,5 μL geëlueerd DNA als supernatant. Plaats de elute in een nieuw buisje en voer een PCR-stap uit.
- Voeg eerst 12,5 μL mastermix, 2,5 μL indexprimer i7-primer en 2,5 μL universele PCR-primer/i5-primer toe aan 7,5 μL adapter-geligeerd DNA om 25 μL PCR-reactiemix te verkrijgen. Gebruik de volgende PCR-voorwaarde: verwarm het deksel voor op 103 °C. 98 °C gedurende 30 s, 98 °C gedurende 10 s, 65 °C gedurende 75 s, 65 °C gedurende 5 minuten en houd op 4 °C na 10 cycli.
- Reinig het 25 μL geamplificeerde DNA. Voeg 22,5 μL magneetkralen toe en meng 20 keer. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en verwijder 50 μL van het supernatant. Was de kralen met 100 μL 80% ethanol en verwijder alle ethanol door de kralen 30 s voorzichtig te drogen.
- Resuspendeer de donkerbruine kralen in 16 μL water, meng 20 keer met een pipet en plaats ze 30-60 s in het magnetische rek. Breng 15 μL over naar een nieuwe buis.
- Bepaal de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer. Meng 90 μL buffer + 1 μL kleurstof + 2 μL DNA-bibliotheekmonster en lees de concentratie af. Verdun het DNA tot 2 nM, laad 27-30 μL in de flowcel en plaats het in de sequencer.
- Stap 3: Sequentie van de adapters, hybridiseer de hierboven gegenereerde bibliotheken met de matrix van de patroonstroomcel en leg DNA vast volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik het als sjabloon voor de tweede synthese.
- Amplificeer vervolgens de tweede streng tot een klonale cluster. Lineariseer het cluster en blokkeer de actieve sites. Voeg sequencingprimer toe om een plaats te bieden voor sequencing door synthese in de sequentie volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Chemisch gezien binden de gemodificeerde nucleotiden zich aan de DNA-sjabloonstreng met behulp van natuurlijke complementariteit. Elk nucleotide heeft een fluorescerende tag en een omkeerbare terminator die de opname van de volgende base blokkeert. Daarom geeft de aanwezigheid van een fluorescerend signaal aan welk nucleotide wordt ingebracht en wordt de terminator gesplitst zodat de volgende base kan binden.
- Amplificeer vervolgens de tweede streng tot een klonale cluster. Lineariseer het cluster en blokkeer de actieve sites. Voeg sequencingprimer toe om een plaats te bieden voor sequencing door synthese in de sequentie volgens het protocol van de fabrikant.
- Stap 4: Versterk de enkelvoudig gebonden streng om clusters van sequenties te krijgen die door synthese in tandem worden gesequenced.
OPMERKING: De clusters geven een helderder signaal dan een enkele streng door bidirectioneel scannen en tweekanaals sequencing-chemie. De sequencing-software brengt automatisch basisoproepbestanden (*.cbcl) over naar de opgegeven locatie van de uitvoermap voor gegevensanalyse.
- Stap 1: Scheer het DNA af met een enzym, meestal door een methode die selecteert voor een algemene grootte.
5. Bio-informatica
- Genereer de sequentiegegevens als FASTQ-bestanden. Analyseer om de volgende onderdelen op te nemen.
- Deel I:
- Sla de FASTQ-bestanden op die zijn verkregen van de sequencer, klik om een spreadsheetbestand te openen en maak mapping-/metadatabestanden.
- Open de Nephele-website (https://nephele.niaid.nih.gov/), upload de FASTQ-bestanden, lees QC, filteren en trimmen in QIIME222. Deponeer de ruwe sequenties als sequentieleesarchief (SRA) en GenBank in NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
- Deel II: Ga naar de Nephele-website (https://nephele.niaid.nih.gov/), voer de gedemultiplexte paired-end reads, filtersubstitutie en chimaera-fouten uit en voeg samen met DADA223. Gebruik de Naive Bayes-classificator die is getraind op de Silva versie 132 99% OTU-database om bacteriële taxonomische toewijzing uit te voeren met 97% gelijkenis24.
- Deel III: Open de MicrobiomeDB-website, klik om bestanden te uploaden en genereer OTU-alfadiversiteit, bètadiversiteit, relatieve overvloed en verdunningscurven (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Deel IV: Open een spreadsheet en draag gegevens over om heatmaps, Venn-diagrammen en lineaire discriminantanalyse-effectgrootte (https://microbiomedb.org/mbio/app) te maken.
- Deel I:
6. Statistische analyse
- Open QIIME222 en bepaal de significante verschillen in alfadiversiteit tussen groepen met behulp van het alfagroep-significantiescript. Hiermee wordt ook de Kruskal-Wallis-test uitgevoerd.
- Bepaal de verschillen in bètadiversiteit tussen groepen met behulp van PERMANOVA, inclusief een paarsgewijze test25.
- Verkrijg de significante verschillen in de bacteriële gemeenschapsstructuur tussen de groepen met behulp van MicrobiomeDB. Een p-waarde ≤0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kwantiteit en kwaliteit van het DNA dat wordt geëxtraheerd uit druivenmost, gistende wijn en uiteindelijke wijn werden eerst bepaald; de hoeveelheidswaarde varieert van 15-87 ng/μL (tabel 1).
Sequencing en bio-informatica
De Illumina high throughput sequencer genereerde een FASTQ-bestand dat werd geïmporteerd in de Nephele en bekeken op QIIME 2-platform26. Ten eerste werd FastQC-software gebruikt om de sequentiekwaliteit te controleren. Vervolgens werd het aan zowel 5'- als 3'- uiteinden bijgesneden om nucleotiden van slechte kwaliteit te elimineren, ontdaan van ruis, samengevoegd en ontdaan van chimere sequenties voordat het werd geclusterd in OTU's (operationele definitie voor een soort) met behulp van de DADA2-denoiser23. Ze werden in kaart gebracht met bacteriële taxa met behulp van de SILVA v138.1-database. De sequenties werden geclusterd in OTU op basis van 99% gelijkenis met nucleotidesequenties. Figuur 1 toont de DADA2-verdunningscurven voor de OTU's; Het bereikte een plateau. Dit gaf aan dat er voldoende sequenties waren om het grootste deel van de microbiële diversiteit aan te geven. Replicatie-analyse van de sequenties leverde geen significant verschil op.
De heatmap op basis van de relatieve abundantie van de bacteriën bij verschillende regimes van druivenmost tot wijn is weergegeven in figuur 2. De meest dominante phyla die in rood worden aangegeven, bestaan uit Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota en, gevolgd door de Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota en Acidobacteriota. De minst voorkomende bacteriën werden in blauw aangegeven. Veel van deze groepen waren aanwezig in most, wanneer gist werd toegevoegd, maar afwezig tijdens de fermentatie, met name Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota en Elusimicrobiota. De relatieve abundantie werd ook bepaald op genusniveau en de resultaten wezen op belangrijke geslachten zoals Enterobacteriaceae en Lactobacillaceae, zoals weergegeven in figuur 3. Een analyse van het Venn-diagram van de gedeelde unieke OTU onthulde dat er 15 bacteriën aanwezig waren van de wijndruivenmost tot de uiteindelijke wijn (Figuur 4). De resultaten van de ampliconsequencing op basis van het V4-variabele gebied gaven ook de alfadiversiteit aan in de twee Traminette R en L. Figuur 4 toont de gelijkmatigheid van de soort als een teken van verdeling, die verschilt tussen de twee voedingsbehandelingen. De gegevens toonden aan dat de diversiteitsverschuiving in de Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O lager was dan 1 bij 13,4 brix, en gelijkmatigheid nadert nul omdat de relatieve abundanties variëren. De gegevens werden ook geanalyseerd op bètadiversiteit; Figuur 5 toont het verschil tussen de twee fermentaties Traminette R en L; De bacteriën waren vergelijkbaar in de most- en giststadia. Er was een verschuiving in de bacteriën in de fermentatiefase voor de twee behandelingen, en het ziet er vergelijkbaar uit in de uiteindelijke wijn (Figuur 6).
Figuur 1: Rarefactiegrafieken van waargenomen OTU's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Relatieve abundantie heatmap. De heatmap van de relatieve abundantie op stamniveaus R en L waren niet significant verschillend (p ≤0,05). De legendabalk geeft de toetsscore aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Relatieve abundantie van de top tien taxa. De relatieve abundantie op genusniveau van top tien taxa gerangschikt door media met Wilcoxon rank sum test (p ≤0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Venndiagram. De unieke en gedeelde bacteriën tussen de most, toegevoegde gist, fermentatie en wijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Alfa-diversiteit van Traminette R en Traminette L. Alfa-diversiteit van Shannon's H-index van de twee nutritionele Fermaid O en Stimula Sauvignon blanc en Fermaid O (Dunn > 0,05) op basis van de analyse van de Kruskal-Wallis-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Analyse van de belangrijkste componenten. Analyse van de belangrijkste component van 16S rRNA-gegevens van bètadiversiteit op basis van Bray-Curtis van de twee nutritionele Fermaid O en Stimula Sauvignon Blanc en Fermaid O in verschillende stadia van de wijnproductie. De blauwe cirkel vertegenwoordigt een cluster van most- en gistadditiestadia. De rode cirkel geeft de uiteindelijke wijn aan en de zwarte cirkel is de gistingsfase in de twee behandelingen. As 1 en 2 zijn variaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Datum van bemonstering | Monster | A260/A280 | Concentratie ng/μL Traminette R | A260/A280 | Concentratie ng/μL Traminette L |
| 8/30/21 | Druif | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Moeten | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Rusten | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Gist toegevoegd | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Gistende | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Gistende | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Laatste wijn | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Tabel 1: De hoeveelheid en kwaliteit van het DNA dat wordt geëxtraheerd uit druivenmost, gistende wijn en uiteindelijke wijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol van metagenomica begint bij de bemonstering van de druivenmost en wanneer gist aan de most werd toegevoegd, de gistende wijn en de uiteindelijke wijnmonsters. Dit werd gevolgd door dubbele DNA-extractie die met succes uit deze monsters werd geëxtraheerd. De verkregen hoeveelheden varieerden in concentratie van 15 ng/μL tot 87 ng/μL. Dit toont aan dat het DNA-extractieprotocol effectief is voor metagenomische studies van wijn. Hoewel de kwaliteit van het DNA bij A260/A280 varieert, kan dit worden toegeschreven aan verschillende parameters die de extractie kunnen beïnvloeden, zoals alcoholconcentratie en andere fermentatiemetabolieten die zich tijdens en na de fermentatie hebben ontwikkeld, evenals ander organisch plantaardig materiaal dat de genoomextractie kan remmen. Eerdere studies hebben een soortgelijke waarneming gerapporteerd op het metagenomische plantmateriaal27. Het DNA dat in het beschreven protocol werd geëxtraheerd, bereikte echter een hoeveelheid die voldoende was voor de volgende stap van de analyse. De PCR-barcodering die nodig is voor metagenomische studies, met name met behulp van het Illumina-sequencingplatform, vereist dat de minimale DNA-hoeveelheid wordt vastgesteld op 1 ng/L. Het V4-gebied werd gesequenced en de bepaling van de bacteriële diversiteit vereist het gebruik van 16S rRNA-gensequencing; dit gen heeft verschillende variabele regio's van V1-V923. Een totaal van 6.393.443 sequenties met een gemiddelde van 399590.1875 ± 138442.6148 van het DNA dat uit de verschillende monsters is geëxtraheerd. V4 wordt vaak gebruikt en wordt het hypervariabele gebied van het gen genoemd dat goed is voor bacteriële taxonomische en diversiteitsanalyse. Tijdens sequencing werden gepaarde Illumina-sequencing ca. 200-300 bp-sequenties gegenereerd. Er zijn verschillende platforms die worden gebruikt voor het sequencen van DNA dat wordt geëxtraheerd uit voedsel en gefermenteerdedranken28. De redenen voor het gebruik van het Illumina-platform zijn de volgende: (1) Illumina is een 2e sequencingplatform van de tweede generatie met uitstekende output, en de chemie geeft een laag foutenpercentage en profiel. Het is ook betaalbaar in vergelijking met beschikbare commerciële kits voor bibliotheekvoorbereiding, en de relatief korte leestijden zijn ideaal voor differentiële expressie. De laatste stap van het protocol was bio-informatica, een belangrijk onderdeel van het gebruik van amplicon 16-sequencing voor de bepaling van microbiële diversiteit. De kwaliteitscontrole van de sequenties die het FASTQ-bestand verkreeg was zeer goed, en de OTU's verkregen van QIIME resulteerden in een taxonomische analyse die werd aangetoond in de resultaten van relatieve abundantie, alfa- en bètadiversiteit.
Next-generation sequencing (NGS) is een belangrijk hulpmiddel geworden voor het profileren van de bacteriën van verschillende fermentatiemicrobiële gemeenschappen. In deze studie werd de 16S-ampliconclassificatie voor het eerst gedaan op stamniveau en werd een meer diverse groep bacteriën opgemerkt dan eerder gemeld12 tijdens de fermentatie van druivenwijn; Er werden ook 15 phyla gedeeld, zoals blijkt uit de analyse van het Venn-resultaat. Ook toonde analyse op genusniveau de aanwezigheid aan van belangrijke geslachten, zoals Enterobacteriaceae en Lactobacillaceae, die overvloediger aanwezig waren in de Traminette R-tank. We hebben onze analyse beperkt tot taxonomie op genusniveau; Er zijn studies waarbij de methode is gebruikt voor identificatie op soortniveau taxonomie door middel van hoge resolutie steekproefinferentie23. Een van de beperkingen van ampliconsequencing is dat de sequentiegegevens de taxonomie op stamniveau niet kunnen bepalen vanwege de korte lengte van de 16S rRNA-sequentie. Een andere beperking is de detectie van chloroplast en mitochondriën. Het is wenselijk als de bio-informaticaprocedure kan worden gebruikt om deze sequenties te elimineren, aangezien het verontreinigingen zijn van druivenplanten. Echter, amplificatieprotocol met behulp van PNA-DNA-klemmen om chloroplast- en mitochondriënbesmetting te maximaliseren29. De grote hoeveelheid Firmicute in druiven moet tijdens de gisting en de uiteindelijke wijn overeenstemmen met de eerdere studies over wijndruif30. De resultaten van de alfa-diversiteitsanalyse gaven de bacterie-gelijkmatigheid van elke fermentatievoedingsbehandeling aan; het lijkt erop dat de voedingsstof Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O een meer diverse bacterie heeft gegenereerd. Bovendien toonden de bèta-diversiteitsgegevens de verschuiving in de bacteriën in de fermentatiefase; Dynamische veranderingen geven aan dat de fermentatiefase een zeer belangrijke periode is waarin de voedingsveranderingen de bacteriële selectie beïnvloeden. De techniek kan worden aangepast en door industrieën worden gebruikt om de fermentatie te controleren en de kwaliteit en consistentie te verbeteren28. Er zal echter verder onderzoek nodig zijn om de impact van organische voedingsstoffen op de microbiële diversiteit tijdens de wijngisting beter te begrijpen.
Deze studie is de eerste die de bacteriediversiteit tijdens de fermentatie van Traminette-druiven en wijn onderzoekt met behulp van de 16S-amplicon-barcodesequencing om de bacterieveranderingen te bepalen. Dit bevestigde de diversiteit van bacteriën op stam- en geslachtsniveau. Proteobacteriën, gevolgd door Firmicutes, kwamen het meest voor naarmate de gisting vorderde naar de uiteindelijke wijn. Veel phyla die niet eerder waren gerapporteerd, werden gedetecteerd met behulp van de 16S-ampliconsequencing, en dit bevestigde dat de methode kan worden gebruikt om de wijnproductie te volgen. Alfa-diversiteit toonde de rol van voedingsverandering; Het had invloed op de fermentatiebacteriën, terwijl bètadiversiteit de veranderingen tijdens de fermentatiefase aangeeft. Verdere studies zijn nodig om de functionele rol te onderzoeken die veel van de beschreven phyla en genera spelen bij de fermentatie van wijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Financiering van de Appalachian State University Research Council (URC) subsidie en CAPES Print Travel fellowship die het bezoek van de FAO aan de Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brazilië, ondersteunden, worden dankbaar erkend. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. ECPDM is dankbaar voor de CAPES Print Travel-beurs die haar bezoek aan de Appalachian State University ondersteunde. ECPDM is een research fellow 2 van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazilië (CNPq).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
- Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
- Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
- Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
- Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
- Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
- Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
- Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
- Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
- Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
- Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
- Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
- Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
- Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
- Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
- Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
- Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
- Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
- Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
- Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
- Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
- Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
- van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
- Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
- Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).
