Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Profilering av bakteriesamfunnet av gjærende traminettedruer under vinproduksjon ved bruk av metagenomisk amplikonsekvensering

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65598
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å beskrive amplikonmetagenomisk for å bestemme bakteriesamfunnet av Traminette-druer, gjærende druer og sluttvin.

Abstract

Fremskritt innen sekvenseringsteknologi og relativt enkel tilgang til bruk av bioinformatikkverktøy for å profilere mikrobielle samfunnsstrukturer har muliggjort en bedre forståelse av både dyrkbare og ikke-dyrkbare mikrober i druer og vin. Under industriell gjæring er mikrober, kjente og ukjente, ofte ansvarlige for produktutvikling og off-smak. Derfor kan profilering av bakteriene fra drue til vin muliggjøre en enkel forståelse av in situ mikrobiell dynamikk. I denne studien må bakteriene i Traminette-druer gjennomgå gjæring, og den endelige vinen ble utsatt for DNA-ekstraksjon som ga 15 ng / μL til 87 ng / μL. 16S-amplikonen i den hypervariable regionen i V4-regionen ble sekvensert, relativt rikelig med bakterier bestående av phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota og etterfulgt av Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota og Acidobacteriota. En Venn-diagramanalyse av de delte unike operasjonelle taksonomiske enhetene (OTU) viste at 15 bakteriefyler var felles for både druemost, gjæringsstadium og sluttvin. Phyla som ikke tidligere var rapportert ble påvist ved hjelp av 16S amplikonsekvensering, samt slekter som Enterobacteriaceae og Lactobacillaceae. Variasjon i bruk av organiske næringsstoffer i vin og dens innvirkning på bakterier ble testet; Traminette R-tank inneholdende Fermaid O og Traminette L stimulert med Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alpha-mangfold ved hjelp av Kruskal-Wallis-testen bestemte graden av jevnhet. Beta-mangfoldet indikerte et skifte i bakteriene på gjæringsstadiet for de to behandlingene, og de endelige vinbakteriene så like ut. Studien bekreftet at 16S amplikonsekvensering kan brukes til å overvåke bakterieendringer under vinproduksjon for å støtte kvalitet og bedre utnyttelse av druebakterier under vinproduksjon.

Introduction

Traminettedrue kjennetegnes ved produksjon av overlegen vinkvalitet, i tillegg til betydelig utbytte og delvis motstand mot flere soppinfeksjoner 1,2,3. Den naturlige gjæringen av druer er avhengig av tilhørende mikroorganismer, vinproduksjonsmiljø og gjæringsbeholdere 4,5. Ofte er mange vinprodusenter avhengige av villgjær og bakterier for gjæring, produksjon av alkohol, estere, aroma og smaksutvikling6.

Målet med denne studien er å undersøke bakteriesammensetningen av druer og overvåke deres dynamikk under gjæring. Selv om moderne bruk av startkulturer som Saccharomyces cerevisiae for primærgjæring, hvor alkohol produseres, er felles for forskjellige vinstiler7. I tillegg forbedrer sekundærgjæring, hvor eplesyre dekarboksyleres av Oenococcus oeni til melkesyre, vinens organoleptiske og smaksprofil og reduserer surheten i vin 8,9. Med de siste fremskrittene i bruken av kulturuavhengige metoder, er det nå mulig å bestemme forskjellige mikrober knyttet til vindruen og artene som overføres til must og delta i gjæringen på forskjellige tidspunkter frem til sluttproduktet10.

Rollene og dynamikken til ville bakterier fra forskjellige druer overført til mosten under vingjæring er dårlig forstått. Taksonomien til mange av disse bakteriene er ikke engang kjent, eller deres fenotypiske egenskaper er ukarakteriserte. Dette gjør deres anvendelse i kokulturfermentering fortsatt dårlig underutnyttet. Imidlertid har mikrobiologisk kulturbasert analyse blitt brukt til å bestemme bakteriepopulasjonen forbundet med druer og vin10. Det er allment kjent at selektiv kulturplating er kjedelig, utsatt for forurensning, har lav reproduserbarhet, og produksjonen kan være tvilsom; Den savner også bakteriearter hvis vekstbehov er ukjente. Tidligere studier indikerer at kulturuavhengige, 16S rRNA-genbaserte metoder gir en mer pålitelig og kostnadseffektiv tilnærming til karakterisering av komplekse mikrobielle samfunn11. For eksempel har sekvensering av hypervariable regioner av 16S rRNA-genet blitt vellykket brukt til å studere bakterier i drueblader, bær og vin 12,13,14. Studier har vist at bruk av enten 16S rRNA-metastrekkoding eller helmetagenomisk sekvensering er egnet for mikrobiomstudier15. Det er fremvoksende informasjon om mulig kobling av bakterielt mangfold til deres metabolske egenskaper under vinproduksjon, noe som kan bidra til bestemmelse av ønologiske egenskaper og terroir16.

Behovet for å maksimere fordelene ved de metagenomiske verktøyene ved hjelp av neste generasjons sekvensering (NGS) for å studere drue- og vinmikrobiell økologi har blitt understreket16,17. Også bruken av kulturuavhengige metoder basert på høy gjennomstrømningssekvensering for å profilere mikrobielt mangfold i mat- og fermenteringsøkosystemet har blitt svært relevant og verdifullt for mange laboratorier og anbefales for industriell bruk18,19. Det gir en fordel ved deteksjon og taksonomisk profilering av de nåværende mikrobielle populasjonene og bidraget fra miljømikrober, deres relative overflod og alfa- og betadiversitet20. Sekvenseringen av den variable regionen i 16S-regionen har blitt et viktig valg av gen og har blitt brukt under ulike mikrobielle økologiske studier.

Mens mange studier fokuserer på sopp, spesielt gjær, under vingjæring21, rapporterte denne studien 16S amplicon-sekvensering og bioinformatiske verktøy som ble brukt til å studere bakteriene under Traminette-druegjæring for vinproduksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentell vinproduksjon

  1. Få tak i Traminnette-druer fra Dynamis Estate-vin i Jonesville, North Carolina vingård, destem og knus for å frigjøre må i to separate 600 L åpne fermentorer og la stå på skinn i ca 4 dager med lokkene på.
  2. Punch hettene ned en gang om dagen for å holde skinnene våte og begrense produksjonen av flyktige syrer (VA).
    MERK: Tanken er at mange av de aromatiske forløperne (monoterpener) ligger i skallet og lar saften være i kontakt med skallet for å øke vinens aromatiske potensial.
  3. Etter 4 dager, pitch Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Denne gjæren ble valgt fordi den er en sterk gjærer og er forbundet med å styrke sortskarakteren i vinen fra druene.
  4. I den ene tanken, Traminette R, tilsett 20 g/hL Fermaid O når brixen er på 17,7 og 20 g/hL Fermaid O og 12,5 g/hL Fermaid K ved 13,1 g/hL for å oppnå gjæringssikkerhet, mens den andre tanken Traminette L, tilsett 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc når brixen er på 17,1. Tilsett også 20 g/hL Fermaid O når brixen er på 13,4 for å fremheve vinens sortskarakter.
  5. Ta dupliserte prøver av must (dag 1), tilsatt gjær (dag 4), fermentert most (dag 15) og ferdige vinprøver (dag 30) og hold ved -20 °C før DNA-ekstraksjon og metagenomisk analyse.

2. DNA-ekstraksjon for metagenomikk

  1. Oppbevar alle dupliserte prøver oppnådd ovenfor på is til første sentrifugering.
  2. Overfør 20 ml av den gjærede prøven til et sterilt 50 ml skrukorkrør.
  3. Tilsett 10 ml kaldt vann og homogeniser (vortex). Sentrifuge i 1 min ved 800 x g ved 4 °C og overfør supernatanten til et nytt 50 ml rør.
    MERK: Dette trinnet vil fjerne faste stoffer i prøven.
  4. Gjenta trinn 2.3 to ganger og slå sammen supernatantene i samme rør.
  5. Sentrifuge supernatant ved 3000 x g ved 4 °C i 20 minutter for å pelletere cellene. Kast supernatanten.
  6. Resuspender pelleten i 1 ml PBS, overfør til et 2 ml skrukorkrør og sentrifuge ved 14 000 x g i 2 minutter. Utfør to vasker til med PBS.
  7. På dette trinnet, frys pellets ved -20 ° C eller følg trinn 2.8. Det er viktig at alle prøvene behandles på samme måte.
  8. Tilsett 978 μL natriumfosfatbuffer. Forbered natriumfosfatbuffer, tilsett 3,1 g NaH2PO4 · H2Oog 10,9 g Na2HPO4 (vannfri) til destillert H2O for å lage et volum på 1 L, og juster pH til 7,4.
  9. Tilsett 122 μL DNA-buffer (DNA-spinnsett) og virvel.
  10. La den stå i kjøleskapet (4 °C) i 45 min-1 time. Vortex prøvene hvert 15. Dette trinnet kan stå over natten (o/n) eller til det er klart til å fortsette å bruke DNA-spinnsettet.
  11. Overfør 1 ml prøve til en lysisløsning 1-rør (DNA-spinnsett) og stram hetten (skriv prøvenummeret på siden av røret og ikke på hetten; settreagensene vil fjerne alt som er skrevet på hetten).
  12. Homogeniser prøven i en perleslående kvern (6,5 m / s, CY: 24 x 2) i 60 s tre ganger. Hvis perle-slå-kvernen har enheten til å sette is, legg 50 g tørris under rørene. Hvis ikke, hold prøvene på våt is i 5 min mellom hvert homogeniseringstrinn.
  13. Sentrifuge Lysing Matrix E-rør (DNA-spinnsett) i 1 min ved 16800 x g (eller maks hastighet).
  14. Overfør supernatanten til et rent mikrorør. Deretter tilsettes 250 μL proteinutfellingsløsning (PPS) reagens (DNA-spinnsett) og blandes ved å riste røret for hånd 10 ganger.
  15. Sentrifuge i 5 min ved 16800 x g for å pelletere bunnfallet.
  16. Overfør supernatanten til et sterilt 15 ml rør. Tilsett 1 ml bindende matrikssuspensjon (DNA-spinnsett) til supernatanten.
    MERK: Heng sammen den bindende matrikssuspensjonen før bruk til den er homogen.
  17. Snu rørene for hånd i 2 minutter, og la rørene stå i et stativ i 3 minutter (for å tillate sedimentering av silikamatrise).
  18. Fjern forsiktig 1 ml av supernatanten. Suspender matrisen i den gjenværende supernatanten.
  19. Overfør 600 μL av blandingen til et spinnfilterrør (DNA-spinnsett) og sentrifuge i 1 min ved 14500 x g.
  20. Tilsett den resterende blandingen og sentrifugen.
  21. Dekanter gjennomstrømning og tilsett 500 μL vaskeoppløsning (DNA-spinnsett) i sentrifugeringsrøret og sentrifugen i 1 min ved 14500 x g (sørg for å tilsette EtOH i vaskeoppløsningen; se produkthåndboken). Dekanter gjennomstrømningen og gjenta vasken to ganger til (3 vasker totalt).
  22. Dekanter gjennomstrømningen og sentrifugen i ytterligere 2 minutter ved 14 500 x g for å tørke matrisen av gjenværende vaskeoppløsning.
  23. Fjern sentrifugeringsfilteret og legg det i et nytt fangstrør (DNA-spinnsett). Lufttørk sentrifugeringsfilteret i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
  24. Varm det DNAse-frie vannet (DNA-spinnsett) ved 55 °C i 5 minutter. Tilsett 50 μL DNAse-fritt vann og rør matriksen forsiktig på filtermembranen med en pipettespiss for effektiv eluering av DNA. La prøvene stå ved RT i 1 min, deretter sentrifuge i 1 min ved 14500 x g for å eluere DNA.
  25. Legg prøvene på is. Legg prøveblandingen (2 μL prøve + 2 μL vann + 1 μL lastbuffer) i en gel. Mål DNA-konsentrasjonen.
  26. Oppbevar prøvene ved -20 °C.
  27. Bruk et spektrofotometer for å kvantifisere DNA ekstrahert.
    MERK: Et volum på 1 μL DNA ble droppet og kvantifisert, og kvaliteten på DNA ble notert ved et A260 / A280-forhold.

3. DNA-elektroforese

  1. Forbered 1% agarosegel i 0,5 Tris / Borate / EDTA (TBE) buffer (20 ml for en mini gel, 70-100 ml for et medium gel). Vei agarose + buffer, kok i mikrobølgeovn for å smelte agarose, vei på nytt og tilsett dH2O til den opprinnelige vekten. Avkjøl agaroseoppløsningen til 55-60 °C og hell i gelførstnevnte med kammontering. La gelen stivne.
  2. Tilsett 1 μL 10x gellastbuffer til prøven (10 μL) og legg på gelen ved siden av en molekylvektmarkør. Kjør fra negativ (svart) til positiv (rød) ved 100-115 V (stor gel) eller 90 V (mini gel) til det blå fargestoffet er nær bunnen.
  3. Beisgel i 30 minutter i 1 μL / ml ethidiumbromid eller SYBR grønn (nitrilhansker og vernebriller nødvendig), skyll i vann og se under en ultrafiolett (UV) lyskilde. Fra de dupliserte eksemplene velger du høyeste kapasitet for videre behandling.

4. Sekvensering av høy gjennomstrømning

  1. Forsterk V4 hypervariabel region av 16S rRNA genet ved hjelp av spesifikke primere 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') og 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Sett polymerasekjedereaksjonsbetingelsene (PCR) til 94 °C i 2 minutter, 30 sykluser på 94 °C i 20 s, 58 °C i 20 s, 65 °C i 1 minutter og 65 °C i 10 minutter (endelig forlengelse).
  2. Utfør PCR-reaksjoner med en high-fidelity PCR-masterblanding (materialfortegnelse).
  3. Generer biblioteker med DNA-bibliotekforberedelsessett og deretter sekvens ved hjelp av sammenkoblet sekvensering på en sekvenseringsplattform.
    MERK: Her ble bibliotekene generert med NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit sekvensert ved hjelp av sammenkoblet Illumina-sekvensering (2 × 250 bp) på novaseq6000-plattformen.
  4. Følg sekvenseringstrinnene:
    1. Trinn 1: Skjær DNA med et enzym, vanligvis ved en metode som velger for en generell størrelse.
      1. Tilsett 3,5 μL sekvenseringsbuffer og 1,5 μL enzymblanding til 25 μL DNA (ca. 1 μg,), bland 10 ganger med en pipette og spinn raskt.
      2. Plasser i en termosyklist med følgende betingelser: forvarm lokket ved 75 °C, (1) 30 min til 20 °C (2) 30 min til 65 °C (3) hold ved 4 °C.
    2. Trinn 2: Legg til adaptere via ligering
      1. Tilsett 15 μL ligeringsmasterblanding, 1,25 μL adapter, 0,5 μL ligeringsforsterker og 30 μL endeprep DNA-blanding med en pipette.
      2. Inkuber ved 20 °C i 15 minutter i en termosyklist og tilsett deretter 1,5 μL uracil-spesifikt eksisjonsreagens (USER) enzym til ligeringsblandingen for å oppnå totalt 48,26 μL. Inkuber 37 °C i 15 minutter.
      3. Tilsett 43,5 μL magnetiske perler til adapterligerings-DNA, bland 20 ganger med en pipette og inkuber i 5 minutter ved RT. Separer perlene med et magnetisk stativ, inkuber deretter i 5-10 minutter, og kast supernatanten.
      4. Vask pelleten med 100 μL 80% etanol, tørk i 30 s, og vask igjen. Eltkuler og pellet i 8,5 μL 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLCH 20, bland med en pipette og inkuber ved RT i 2 minutter.
      5. Inkuber i magnetstativet og fjern 7,5 μL eluert DNA som supernatant. Plasser eluen i et nytt rør og utfør et PCR-trinn.
      6. Først tilsettes 12,5 μL masterblanding, 2,5 μL indeksprimer i7-primer og 2,5 μL universell PCR-primer/i5-primer til 7,5 μL adapterligert DNA for å oppnå 25 μL PCR-reaksjonsblanding. Bruk følgende PCR-betingelse: forvarm lokket til 103 °C. 98 °C i 30 s, 98 °C i 10 s, 65 °C i 75 s, 65 °C i 5 minutter og hold ved 4 °C etter 10 sykluser.
      7. Rengjør 25 μL forsterket DNA. Tilsett 22,5 μL magnetiske perler og bland 20 ganger. Inkuber ved RT i 5 minutter og fjern 50 μL av supernatanten. Vask perlene med 100 μL 80% etanol, og fjern all etanol ved å tørke perlene forsiktig i 30 s.
      8. Suspender de mørkebrune perlene i 16 μL vann, bland 20 ganger med en pipette og sett i magnetstativet i 30-60 s. Overfør 15 μL til et nytt rør.
      9. Bestem DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et fluorometer. Bland 90 μL buffer + 1 μL fargestoff + 2 μL DNA-bibliotekprøve, og les konsentrasjonen. Fortynn DNA til 2 nM, last 27-30 μL til strømningscellen, og plasser den i sequenceren.
    3. Trinn 3: Sekvenser adapterne, hybridiser bibliotekene som er generert ovenfor til matrisen til den mønstrede strømningscellen, og fang DNA i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk den som mal for den andre syntesen.
      1. Deretter forsterker du den andre strengen til en klonal klynge. Lineariser klyngen og blokker de aktive områdene. Legg til sekvenseringsprimer for å gi et sted for sekvensering ved syntese i sekvensen i henhold til manuacturerens protokoll.
        MERK: Kjemisk binder de modifiserte nukleotidene seg til DNA-malstrengen ved hjelp av naturlig komplementaritet. Hvert nukleotid har en fluorescerende tag og en reversibel terminator som blokkerer inkluderingen av neste base. Derfor indikerer tilstedeværelsen av et fluorescerende signal hvilket nukleotid som settes inn, og terminatoren spaltes for neste base for å binde.
    4. Trinn 4: Forsterk den enkeltbundne strengen for å gi klynger av sekvenser som sekvenseres i tandem ved syntese.
      MERK: Klyngene gir et lysere signal enn en enkelt streng gjennom toveis skanning og tokanals sekvenseringskjemi. Sekvenseringsprogramvaren overfører automatisk baseanropsfiler (*.cbcl) til den angitte utdatamappeplasseringen for dataanalyse.

5. Bioinformatikk

  1. Generer sekvensdataene som FASTQ-filer. Analyser for å inkludere følgende deler.
    1. Del I:
      1. Lagre FASTQ-filene hentet fra sequenceren, klikk for å åpne en regnearkfil, og opprett kartleggings- / metadatafiler.
      2. Åpne Nephele-nettstedet (https://nephele.niaid.nih.gov/), last opp FASTQ-filene, les QC, filtrering og trimming i QIIME222. Deponer råsekvensene som sekvenslesearkiv (SRA) og GenBank i NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. Del II: Gå til Nephele-nettstedet (https://nephele.niaid.nih.gov/), gjør de demultipleksede sammenkoblede end-avlesningene, filtrer erstatning og kimærfeil, og slå sammen med DADA223. Bruk Naive Bayes-klassifikatoren trent på Silva versjon 132 99% OTU-databasen for å utføre bakteriell taksonomisk tildeling ved 97% likhet24.
    3. Del III: Åpne MicrobiomeDB-nettstedet, klikk for å laste opp filer, og generer OTU alfa-mangfold, beta-mangfold, relativ overflod og sjeldne kurver (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. Del IV: Åpne et regneark og overfør data for å lage varmekart, Venn-diagrammer og lineær diskriminerende analyseeffektstørrelse (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Statistisk analyse

  1. Åpne QIIME222, og bestem de signifikante forskjellene i alfadiversitet mellom grupper ved hjelp av alfa-gruppe-signifikansskriptet. Dette vil også utføre Kruskal-Wallis-testen.
  2. Bestem forskjellene i betadiversitet mellom grupper ved å bruke PERMANOVA, inkludert en parvis test25.
  3. Få de signifikante forskjellene i bakteriesamfunnsstrukturen blant gruppene ved hjelp av MicrobiomeDB. P-verdi ≤0,05 ble vurdert som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mengden og kvaliteten på DNA ekstrahert fra druemost, gjærende vin og endelig vin ble først bestemt; mengdeverdien varierer fra 15-87 ng / μL (tabell 1).

Sekvensering og bioinformatikk
Illumina high throughput sequencer genererte en FASTQ-fil som ble importert til Nephele og vist på QIIME 2-plattformen26. For det første ble FastQC-programvare brukt til å sjekke sekvenskvaliteten. Deretter ble den trimmet i både 5'- og 3'- ender for å eliminere nukleotider av dårlig kvalitet, denoised, fusjonert og utarmet av kimære sekvenser før den ble klynget inn i OTUs (operasjonell definisjon for en art) ved hjelp av DADA2 denoiser23. De ble kartlagt til bakteriell taxa ved hjelp av databasen SILVA v138.1. Sekvensene ble gruppert i OTU basert på 99% nukleotidsekvenslikhet. Figur 1 viser DADA2-rarefaksjonskurvene for OTUene; Den nådde et platå. Dette indikerte at nok sekvenser ble dekket til å indikere flertallet av det mikrobielle mangfoldet. Replikasjonsanalyse av sekvensene genererte ingen signifikant forskjell.

Varmekartet basert på den relative mengden av bakterier ved forskjellige regimer fra druemost til vin er vist i figur 2. Den mest dominerende phyla angitt i rødt består av Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota, og etterfulgt av Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota og Acidobacteriota. De minst tallrike bakteriene ble angitt i blått. Mange av disse gruppene var til stede i must, da gjær ble tilsatt, men fraværende under gjæring, spesielt Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota og Elusimicrobiota. Den relative forekomsten ble også bestemt på slektsnivå, og resultatene indikerte viktige slekter som Enterobacteriaceae og Lactobacillaceae, som vist i figur 3. En Venn-diagramanalyse av den delte unike OTU viste at 15 bakterier var tilstede fra vindruemosten til den endelige vinen (figur 4). Resultatene av amplikonsekvenseringen basert på V4-variabelområdet indikerte også alfadiversiteten i de to Traminette R og L. Figur 4 viser artens jevnhet som et fordelingsmerke, som er forskjellig mellom de to ernæringsbehandlingene. Dataene viste at mangfoldsskiftet i Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O var lavere enn 1 ved 13,4 brix, og jevnhet nærmer seg null ettersom relative mengder varierer. Dataene ble også analysert for betadiversitet; Figur 5 viser forskjellen mellom de to gjæringen Traminette R og L; Bakteriene var like på MUST og gjær-lagt stadier. Det var et skifte i bakteriene på gjæringsstadiet for de to behandlingene, og det ser likt ut i den endelige vinen (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Sjeldne plott av observerte OTUer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Relativ overflod varmekart. Varmekartet for den relative mengden på fylumnivå R og L var ikke signifikant forskjellig (p ≤0,05). Forklaringslinjen angir nøkkelpoengsummen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Relativ overflod av de ti øverste taxaene. Den relative overflod på slektsnivå av topp ti taxa rangert av media med Wilcoxon rang sum test (p ≤0.05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Venn-diagram. De unike og delte bakteriene blant must, gjær tilsatt, gjæring og vin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Alfadiversitet av Traminette R og Traminette L. Alfadiversitet av Shannons H-indeks for de to ernæringsmessige Fermaid O og Stimula Sauvignon blanc og Fermaid O (Dunn > 0,05) basert på analysen av Kruskal-Wallis-testen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Prinsipal komponentanalyse. Hovedkomponentanalyse av 16S rRNA-data av betadiversitet basert på Bray-Curtis av de to ernæringsmessige Fermaid O og Stimula Sauvignon Blanc og Fermaid O på forskjellige stadier av vinproduksjon. Den blå sirkelen representerer en klynge av must og gjær tillegg stadier. Den røde sirkelen indikerer den endelige vinen og den svarte sirkelen er gjæringstrinnet i de to behandlingene. Akse 1 og 2 er variasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Dato for prøvetaking Eksempel A260/A280 Konsentrasjon ng / μL Traminette R A260/A280 Konsentrasjon ng / μL Traminette L
8/30/21 Drue 1.762 37 1.75 28
8/31/31 Må 1.769 23 1.818 20
09-02-2021 Hvile 1.667 15 -1 1
09-04-2021 Gjær lagt 2.185 59 1.968 61
09-06-2021 Fermenting 2.023 87 2.048 43
09-09-2021 Fermenting 3.4 17 2.048 43
9/14/21 Avsluttende vin 2.143 30 2.042 49

Tabell 1: Mengden og kvaliteten på DNA ekstrahert fra druemost, gjærende vin og sluttvin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen for metagenomikk starter fra prøvetaking av druemosten, og når gjær ble tilsatt mosten, gjærende vin og endelige vinprøver. Dette ble etterfulgt av duplikat DNA-ekstraksjon som ble ekstrahert fra disse prøvene. De oppnådde mengdene varierte i konsentrasjon fra 15 ng / μL til 87 ng / μL. Dette viser at DNA-ekstraksjonsprotokollen er effektiv for metagenomiske studier av vin. Selv om kvaliteten på DNA ved A260/A280 varierer, kan dette tilskrives forskjellige parametere som kan påvirke ekstraksjonen, for eksempel alkoholkonsentrasjon og andre fermenteringsmetabolitter som utviklet seg under og etter gjæring, samt andre organiske plantematerialer som kan hemme genomekstraksjon. Tidligere studier har rapportert en lignende observasjon på det metagenomiske plantematerialet27. Imidlertid oppnådde DNA ekstrahert i protokollen som ble beskrevet, en mengde som var nok for neste trinn i analysen. PCR-strekkodingen som trengs for metagenomiske studier, spesielt ved bruk av Illumina-sekvenseringsplattformen, krever at minimum DNA-mengde settes til 1 ng / L. V4-regionen ble sekvensert, og bestemmelsen av bakteriemangfoldet krever bruk av 16S rRNA-gensekvensering; dette genet har forskjellige variable regioner fra V1-V923. Totalt 6 393 443 parsekvensavlesninger med et gjennomsnitt på 399590,1875 ± 138442,6148 fra DNA ekstrahert fra de forskjellige prøvene. V4 har vært mye brukt, og det omtales som den hypervariable regionen av genet som er bra for bakteriell taksonomisk og mangfoldsanalyse. Under sekvensering ble parret Illumina-sekvensering ca. 200-300 bp-sekvenser generert. Det er forskjellige plattformer som brukes til sekvensering av DNA hentet fra mat og gjærede drikker28. Årsakene til å bruke Illumina-plattformen er følgende: (1) Illumina er en 2. andre generasjons sekvenseringsplattform med utmerket utgang, og kjemien gir en lav feilrate og profil. Det er også rimelig sammenlignet med tilgjengelige kommersielle sett for bibliotekforberedelse, og de relativt korte lesningene er ideelle for differensialuttrykk. Det siste trinnet i protokollen var bioinformatikk, en viktig komponent i bruken av amplikon 16-sekvensering for bestemmelse av mikrobielt mangfold. Kvalitetskontrollen av sekvensene FASTQ-filen oppnådde var veldig god, og OTUene hentet fra QIIME resulterte i en taksonomisk analyse vist i resultatene av relativ overflod, alfa og beta-mangfold.

Neste generasjons sekvensering (NGS) har blitt et viktig verktøy for å profilere bakteriene i forskjellige fermenteringsmikrobielle samfunn. I denne studien ble 16S amplicon-klassifiseringen først gjort på fylumnivå, og en mer variert gruppe bakterier ble lagt merke til enn tidligere rapportert12 under druevingjæring; 15 phyla ble også delt, som indikert fra analysen av Venn-resultatet. Også analyse på slektsnivå viste tilstedeværelsen av viktige slekter, som Enterobacteriaceae og Lactobacillaceae som var mer rikelig i Traminette R-tanken. Vi begrenset analysen til taksonomi på genusnivå; Det finnes studier der metoden har blitt brukt for identifisering på artsnivå taksonomi gjennom høyoppløselig prøveinferens23. En av begrensningene ved amplikonsekvensering er at sekvensdataene ikke kan bestemme taksonomien på belastningsnivå på grunn av den korte lengden på 16S rRNA-sekvensen. En annen begrensning er påvisning av kloroplast og mitokondrier. Det vil være ønskelig om den bioinformatiske prosedyren kan brukes til å eliminere disse sekvensene, siden de er forurensninger av drueplanter. Imidlertid bruker amplifikasjonsprotokoll PNA-DNA-klemmer for å maksimere kloroplast- og mitokondrieforurensning29. Den høye forekomsten av Firmicute i druer må under gjæring og sluttvin stemme overens med tidligere studier på vindrue30. Resultatene av alfa-mangfoldsanalysen indikerte bakteriejevnheten i hver gjæringsernæringsbehandling; det ser ut til at Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O-næringsstoffet genererte en mer variert bakterie. I tillegg viste beta-mangfoldsdataene skiftet i bakteriene på gjæringsstadiet; Dynamiske endringer indikerer at gjæringstrinnet er en svært viktig periode hvor næringsendringene påvirker bakterievalget. Teknikken kan tilpasses og brukes av næringer for å overvåke gjæring og forbedre kvalitet og konsistens28. Imidlertid vil det være behov for ytterligere studier for bedre å forstå virkningen av organiske næringsstoffer på mikrobielt mangfold under vingjæring.

Denne studien er den første som undersøker bakteriemangfoldet under gjæringen av Traminette-druer og vin ved hjelp av 16S amplicon strekkodesekvensering for å bestemme bakterieendringene. Dette bekreftet mangfoldet av bakterier på fylum- og slektsnivå. Proteobakterier, etterfulgt av Firmicutes, var de mest tallrike da gjæringen utviklet seg til den endelige vinen. Mange phyla som ikke tidligere ble rapportert ble påvist ved hjelp av 16S amplicon-sekvensering, og dette bekreftet at metoden kan brukes til å overvåke vinproduksjonen. Alpha mangfold viste rollen som ernæringsmessig endring; Det påvirket gjæringsbakteriene, mens betadiversiteten indikerer endringene under gjæringsstadiet. Videre studier er nødvendig for å undersøke de funksjonelle rollene som mange av de beskrevne phyla og slekter spiller i vinfermentering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Finansiering fra Appalachian State University Research Council (URC) tilskudd og CAPES Print Travel fellesskap som støttet besøket av FAO til Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil, er takknemlig anerkjent. Denne studien ble delvis finansiert av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. ECPDM er takknemlig for CAPES Print Travel-stipendet som støttet hennes besøk til Appalachian State University. ECPDM er stipendiat 2 fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. Ã, Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu,, Morozov, I. V., Bukin, S. V., Zakharenko, A. S., Zemskaya, T. I. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).

Tags

Biologi utgave 202
Profilering av bakteriesamfunnet av gjærende traminettedruer under vinproduksjon ved bruk av metagenomisk amplikonsekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goppold, A., Conradie, L., Almeida,… More

Goppold, A., Conradie, L., Almeida, O. G. G. d., De Martinis, E. C. P., Oguntoyinbo, F. A. Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (202), e65598, doi:10.3791/65598 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter