Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para descrever a metagenômica amplicon para determinar a comunidade bacteriana de uvas Traminette, uvas em fermentação e vinho final.
Abstract
Os avanços na tecnologia de sequenciamento e o acesso relativamente fácil ao uso de ferramentas de bioinformática para traçar o perfil das estruturas da comunidade microbiana têm facilitado uma melhor compreensão dos micróbios cultiváveis e não cultiváveis em uvas e vinhos. Durante a fermentação industrial, micróbios, conhecidos e desconhecidos, são frequentemente responsáveis pelo desenvolvimento de produtos e dessabor. Portanto, o perfil das bactérias da uva ao vinho pode permitir uma fácil compreensão da dinâmica microbiana in situ . Neste estudo, as bactérias do mosto de uvas Traminette submetidas à fermentação, e o vinho final foi submetido à extração de DNA que resultou em 15 ng/μL a 87 ng/μL. O amplicon 16S da região hipervariável da região V4 foi sequenciado, bactérias relativamente abundantes constituídas pelos filos Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e seguidas pelos Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. Uma análise do diagrama de Venn das unidades taxonômicas operacionais únicas compartilhadas (OTU) revelou que 15 filos de bactérias eram comuns ao mosto de uva, ao estágio de fermentação e ao vinho final. Filos não relatados anteriormente foram detectados usando o sequenciamento do amplicon 16S, assim como gêneros como Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. Testou-se a variação no uso de nutrientes orgânicos no vinho e seu impacto sobre as bactérias; Tanque Traminette R contendo Fermaid O e Traminette L estimulado com Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. A diversidade alfa usando o teste de Kruskal-Wallis determinou o grau de equitabilidade. A diversidade beta indicou uma mudança nas bactérias no estágio de fermentação para os dois tratamentos, e as bactérias finais do vinho pareceram semelhantes. O estudo confirmou que o sequenciamento de amplicon 16S pode ser usado para monitorar as mudanças bacterianas durante a produção de vinho para apoiar a qualidade e melhor utilização das bactérias da uva durante a produção de vinho.
Introduction
A uva Traminette caracteriza-se pela produção de vinhos de qualidade superior, além de rendimento apreciável e resistência parcial a diversas infecções fúngicas 1,2,3. A fermentação natural das uvas depende de microrganismos associados, ambiente de produção de vinho e vasos de fermentação 4,5. Muitas vezes, muitas vinícolas dependem de leveduras e bactérias selvagens para fermentação, produção de álcool, ésteres, aroma e desenvolvimento de sabor6.
O objetivo deste estudo é examinar a composição bacteriana de uvas e monitorar sua dinâmica durante a fermentação. No entanto, o uso moderno de culturas iniciadoras, como a Saccharomyces cerevisiae, para fermentação primária, onde o álcool é produzido, é comum a diferentes estilos de vinho7. Além disso, a fermentação secundária, em que o ácido málico é descarboxilado por Oenococcus oeni em ácido lático, melhora o perfil organoléptico e gustativo do vinho e reduz a acidez do vinho 8,9. Com os recentes avanços no uso de métodos independentes de cultura, agora é possível determinar diferentes micróbios associados à uva vinífera e às espécies que são transferidas para o mosto e participar da fermentação em diferentes momentos até o produto final10.
Os papéis e a dinâmica de bactérias selvagens de diferentes uvas transferidas para o mosto durante a fermentação do vinho são pouco compreendidos. A taxonomia de muitas dessas bactérias ainda não é conhecida, ou suas propriedades fenotípicas não estão caracterizadas. Isso faz com que sua aplicação na fermentação da cocultura ainda seja pouco utilizada. No entanto, a análise microbiológica baseada em cultura tem sido utilizada para determinar a população bacteriana associada à uva e ao vinho10. Sabe-se que o plaqueamento seletivo de cultura é tedioso, propenso à contaminação, tem baixa reprodutibilidade e o resultado pode ser duvidoso; Também perde espécies bacterianas cujas necessidades de crescimento são desconhecidas. Estudos prévios indicam que metodologias baseadas no gene 16S rRNA, independentes de cultura, oferecem uma abordagem mais confiável e custo-efetiva para caracterizar comunidades microbianas complexas11. Por exemplo, o sequenciamento das regiões hipervariáveis do gene 16S rRNA tem sido empregado com sucesso para estudar bactérias em folhas de uvas, bagas e vinho 12,13,14. Estudos têm mostrado que o uso de metabarcoding de 16S rRNA ou sequenciamento metagenômico completo é adequado para estudos de microbioma15. Estão surgindo informações sobre a possível ligação da diversidade bacteriana aos seus atributos metabólicos durante a produção do vinho, o que poderia auxiliar na determinação das propriedades enológicas e do terroir16.
A necessidade de maximizar as vantagens das ferramentas metagenômicas utilizando o sequenciamento de próxima geração (NGS) para estudar a ecologia microbiana da uva e do vinho tem sido enfatizada16,17. Além disso, o uso de métodos independentes de cultura baseados em sequenciamento de alto rendimento para traçar o perfil da diversidade microbiana do ecossistema alimentar e fermentativo tornou-se muito relevante e valioso para muitos laboratórios, sendo recomendado para uso industrial18,19. Fornece uma vantagem de detecção e perfil taxonômico das populações microbianas presentes e a contribuição de micróbios ambientais, sua abundância relativa e diversidade alfa e beta20. O sequenciamento da região variável da região 16S tornou-se um importante gene de escolha e tem sido utilizado durante diferentes estudos ecológicos microbianos.
Enquanto muitos estudos se concentram em fungos, especialmente leveduras, durante a fermentação do vinho21, este estudo relatou o sequenciamento de amplicon 16S e ferramentas de bioinformática usadas para estudar as bactérias durante a fermentação de uvas Traminette para produção de vinho.
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Protocol
1. Produção experimental de vinho
- Obtenha uvas Traminnette do vinho Dynamis Estate em Jonesville, vinhedo da Carolina do Norte, destale e esmague para liberar o mosto em dois fermentadores abertos separados de 600 L e deixe em cascas por cerca de 4 dias com as tampas ligadas.
- Perfure as tampas uma vez por dia para manter as peles molhadas e limitar a produção de ácido volátil (VA).
OBS: A ideia é que muitos dos precursores aromáticos (monoterpenos) fiquem situados nas cascas e deixem o suco em contato com a pele para aumentar o potencial aromático do vinho. - Após 4 dias, pitch Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Esta levedura foi selecionada por ser um fermentador forte e está associada ao reforço do caráter varietal no vinho das uvas.
- Em um tanque, Traminette R, adicione 20 g/hL Fermaid O quando o brix estiver a 17,7 e 20 g/hL Fermaid O e 12,5 g/hL Fermaid K a 13,1 g/hL para alcançar a segurança de fermentação, enquanto no outro tanque Traminette L, adicione 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc quando o brix estiver em 17,1. Adicione também 20 g/hL Fermaid O quando o brix estiver em 13,4 para realçar o caráter varietal do vinho.
- Colher amostras duplicadas de mosto (dia 1), levedura adicionada (dia 4), mosto fermentado (dia 15) e amostras de vinho acabado (dia 30) e manter a -20 °C antes da extracção de ADN e análise metagenómica.
2. Extração de DNA para metagenômica
- Manter todas as amostras duplicadas obtidas acima no gelo até a primeira centrifugação.
- Transferir 20 mL da amostra fermentada para um tubo estéril de tampa de rosca de 50 mL.
- Adicionar 10 mL de água fria e homogeneizar (vórtice). Centrifugar durante 1 min a 800 x g a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 ml.
NOTA: Esta etapa removerá os sólidos da amostra. - Repita o passo 2.3 duas vezes e junte os sobrenadantes no mesmo tubo.
- Centrifugar sobrenadante a 3.000 x g a 4 °C por 20 min para peletizar as células. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS, transferir para um tubo de tampa de rosca de 2 mL e centrifugar a 14.000 x g por 2 min. Realize mais duas lavagens usando PBS.
- Nesta etapa, congele os pellets a -20°C ou siga o passo 2.8. É importante que todas as amostras sejam tratadas da mesma forma.
- Adicionar 978 μL de tampão fosfato de sódio. Preparar tampão fosfato de sódio, adicionar 3,1 g de NaH2PO4· H2O e 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) para destilar H2O para fazer um volume de 1 L, e ajustar o pH para 7,4.
- Adicionar 122 μL de tampão de DNA (kit de spin de DNA) e vórtice.
- Deixe descansar na geladeira (4 °C) por 45 min-1 h. Vórtice as amostras a cada 15 min. Esta etapa pode ser deixada durante a noite (o/n) ou até que esteja pronta para continuar usando o kit de spin de DNA.
- Transfira 1 mL de amostra para um tubo de solução de lise 1 (kit de spin de DNA) e aperte a tampa (escreva o número da amostra na lateral do tubo e não na tampa; os reagentes do kit removerão qualquer coisa escrita na tampa).
- Homogeneizar a amostra em um moedor batedor de contas (6,5 m/s, CY: 24 x 2) por 60 s três vezes. Se o moedor de contas tiver o dispositivo para colocar gelo, coloque 50 g de gelo seco sob os tubos. Caso contrário, manter as amostras em gelo úmido por 5 min entre cada etapa de homogeneização.
- Centrífuga Lysing Matrix E tubos (kit de spin DNA) por 1 min a 16800 x g (ou velocidade máxima).
- Transfira o sobrenadante para um microtubo limpo. Em seguida, adicione 250 μL de reagente de solução de precipitação proteica (PPS) (kit de spin de DNA) e misture agitando o tubo manualmente 10 vezes.
- Centrifugar por 5 min a 16800 x g para pellet o precipitado.
- Transfira o sobrenadante para um tubo estéril de 15 mL. Adicionar 1 mL de suspensão de matriz de ligação (kit de spin de DNA) ao sobrenadante.
NOTA: Ressuspenda a suspensão da matriz de ligação antes de usar até que ela fique homogênea. - Inverta os tubos manualmente por 2 min, em seguida, deixe os tubos em um rack por 3 min (para permitir o assentamento da matriz de sílica).
- Retire cuidadosamente 1 ml do sobrenadante. Ressuspenda a matriz no sobrenadante restante.
- Transfira 600 μL da mistura para um tubo de filtro de spin (kit de spin de DNA) e centrífuga por 1 min a 14500 x g.
- Adicione a mistura restante e centrifuga.
- Decantar o fluxo e adicionar 500 μL de solução de lavagem (kit de spin de DNA) no tubo do filtro de spin e centrifugar por 1 min a 14500 x g (certifique-se de adicionar EtOH à solução de lavagem; consulte o manual do produto). Decantar o fluxo e repetir a lavagem mais duas vezes (3 lavagens no total).
- Decantar o fluxo e centrifugar por mais 2 min a 14.500 x g para secar a matriz da solução de lavagem residual.
- Retire o filtro de spin e coloque-o em um tubo de captura fresco (kit de spin de DNA). Seque o filtro de spin ao ar por 5 min à temperatura ambiente (TR).
- Aqueça a água livre de DNAse (kit de spin de DNA) a 55 °C por 5 min. Adicione 50 μL de água sem DNAse e agite suavemente a matriz na membrana do filtro com uma ponta de pipeta para uma eluição eficiente do DNA. Deixe as amostras repousarem em RT por 1 min e, em seguida, centrifugar por 1 min a 14500 x g para eluir o DNA.
- Coloque as amostras no gelo. Carregar a mistura da amostra (2 μL de amostra + 2 μL de água + 1 μL de tampão de carga) num gel. Medir a concentração de DNA.
- Conservar as amostras a -20 °C.
- Use um espectrofotômetro para quantificar o DNA extraído.
NOTA: Um volume de 1 μL de DNA foi descartado e quantificado, e a qualidade do DNA foi observada em uma proporção A260/A280.
3. Eletroforese de DNA
- Preparar gel de agarose a 1% em tampão 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 mL para um mini gel, 70-100 mL para um gel médio). Pese agarose+tampão, ferva no micro-ondas para derreter a agarose, pese novamente e adicione dH2O ao peso original. Arrefecer a solução de agarose a 55-60 °C e deitar na formadora de gel com o conjunto do pente. Deixe o gel solidificar.
- Adicionar 1 μL de tampão de carregamento de 10x gel à amostra (10 μL) e carregar no gel junto a um marcador de peso molecular. Passe de negativo (preto) para positivo (vermelho) a 100-115 V (gel grande) ou 90 V (mini gel) até que o corante azul esteja perto do fundo.
- Coloração em gel por 30 min em brometo de etídio de 1 μL/mL ou verde SYBR (luvas e óculos de nitrilo necessários), enxaguar em água e visualizar sob fonte de luz ultravioleta (UV). A partir das amostras duplicadas, selecione o maior rendimento para processamento posterior.
4. Sequenciamento de alto rendimento
- Amplificar a região hipervariável V4 do gene 16S rRNA usando os primers específicos 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') e 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Definir as condições de reação em cadeia da polimerase (PCR) em 94 °C por 2 min, 30 ciclos de 94 °C por 20 s, 58 °C por 20 s, 65 °C por 1 min e 65 °C por 10 min (extensão final).
- Realizar reações de PCR com um master mix de PCR de alta fidelidade (Tabela de Materiais).
- Gere bibliotecas com kit de preparação de biblioteca de DNA e, em seguida, sequencie usando sequenciamento de extremidade emparelhada em uma plataforma de sequenciamento.
NOTA: Aqui, as bibliotecas geradas com o NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit foram sequenciadas usando sequenciamento Illumina pareado (2 × 250 pb) na plataforma novaseq6000. - Siga as etapas de sequenciamento:
- Passo 1: Cisalhe o DNA com uma enzima, geralmente por um método que seleciona para um tamanho geral.
- Adicionar 3,5 μL de tampão de sequenciação e 1,5 μL de mistura enzimática a 25 μL de ADN (cerca de 1 μg), misturar 10 vezes com uma pipeta e girar rapidamente.
- Coloque em um termociclador com as seguintes condições: pré-aqueça a tampa a 75°C, (1) 30 min para 20 °C (2) 30 min para 65 °C (3) segure a 4°C.
- Passo 2: Adicionar adaptadores via ligadura
- Adicionar 15 μL de mistura mestre de ligadura, 1,25 μL de adaptador, 0,5 μL de intensificador de ligadura e 30 μL de mistura de DNA de preparação final com uma pipeta.
- Incubar a 20 °C durante 15 minutos num termociclador e, em seguida, adicionar 1,5 μL de enzima reagente de excisão específica para uracila (USER) à mistura de ligadura para obter um total de 48,26 μL. Incubar 37 °C durante 15 minutos.
- Adicione 43,5 μL de esferas magnéticas ao DNA de ligadura do adaptador, misture 20 vezes com uma pipeta e incube por 5 min em RT. Separe as contas com um rack magnético, incube por 5-10 min e descarte o sobrenadante.
- Lave o pellet com 100 μL de etanol 80%, seque por 30 s e lave novamente. Contas eluídas e pellet em 8,5 μL de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, misturar com uma pipeta e incubar em TR por 2 min.
- Incubar no rack magnético e remover 7,5 μL de DNA eluído como sobrenadante. Coloque a eluição em um tubo novo e realize uma etapa de PCR.
- Primeiro, adicione 12,5 μL de mistura mestra, 2,5 μL de primer índice i7 primer e 2,5 μL de primer universal de PCR/primer i5 a 7,5 μL de DNA ligado a adaptador para obter 25 μL de mistura de reação de PCR. Use a seguinte condição de PCR: pré-aqueça a tampa a 103 °C. 98 °C por 30 s, 98 °C por 10 s, 65 °C por 75 s, 65 °C por 5 min e mantenha a 4 °C após 10 ciclos.
- Limpe o DNA amplificado de 25 μL. Adicionar 22,5 μL de esferas magnéticas e misturar 20 vezes. Incubar em TR por 5 min e remover 50 μL do sobrenadante. Lave as contas com 100 μL de etanol 80% e retire todo o etanol secando as contas suavemente por 30 s.
- Ressuspenda as contas castanhas escuras em 16 μL de água, misture 20 vezes com uma pipeta e coloque no rack magnético por 30-60 s. Transferir 15 μL para um novo tubo.
- Determinar a concentração de DNA usando um fluorômetro. Misture 90 μL de tampão + 1 μL de corante + 2 μL de amostra de biblioteca de DNA e leia a concentração. Diluir o DNA em 2 nM, carregar 27-30 μL na célula de fluxo e colocá-lo no sequenciador.
- Passo 3: Sequenciar os adaptadores, hibridizar as bibliotecas geradas acima para a matriz da célula de fluxo padronizada e capturar o DNA de acordo com as instruções do fabricante. Use-o como modelo para a segunda síntese.
- Em seguida, amplie a segunda fita em um cluster clonal. Linearize o cluster e bloqueie os sites ativos. Adicionar primer de sequenciamento para fornecer um local para sequenciamento por síntese na sequência de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: Quimicamente, os nucleotídeos modificados ligam-se à fita molde de DNA usando complementaridade natural. Cada nucleotídeo tem uma etiqueta fluorescente e um terminador reversível que bloqueia a inclusão da próxima base. Portanto, a presença de um sinal fluorescente indica qual nucleotídeo está inserido, e o terminador é clivado para a próxima base se ligar.
- Em seguida, amplie a segunda fita em um cluster clonal. Linearize o cluster e bloqueie os sites ativos. Adicionar primer de sequenciamento para fornecer um local para sequenciamento por síntese na sequência de acordo com o protocolo do fabricante.
- Passo 4: Amplificar a fita de ligação única para dar agrupamentos de sequências que são sequenciadas em conjunto por síntese.
NOTA: Os clusters fornecem um sinal mais brilhante do que uma única fita através de varredura bidirecional e química de sequenciamento de dois canais. O software de sequenciamento transfere automaticamente os arquivos de chamada base (*.cbcl) para o local da pasta de saída especificada para análise de dados.
- Passo 1: Cisalhe o DNA com uma enzima, geralmente por um método que seleciona para um tamanho geral.
5. Bioinformática
- Gere os dados de sequência como arquivos FASTQ. Analise para incluir as seguintes partes.
- Parte I:
- Salve os arquivos FASTQ obtidos do sequenciador, clique para abrir um arquivo de planilha e crie arquivos de mapeamento/metadados.
- Abra o site da Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), carregue os arquivos FASTQ, leia o QC, filtre e corte no QIIME222. Deposite as sequências brutas como sequence read archive (SRA) e GenBank no NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
- Parte II: Vá para o site da Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), faça as leituras de extremidade emparelhada desmultiplexadas, substituição de filtros e erros de quimera e mescle usando DADA223. Utilizar o classificador Naive Bayes treinado no banco de dados Silva versão 132 99% OTU para realizar a atribuição taxonômica bacteriana a 97% de similaridade24.
- Parte III: Abra o site do MicrobiomeDB, clique para fazer upload de arquivos e gere curvas de diversidade alfa, beta, abundância relativa e rarefação (https://microbiomedb.org/mbio/app) da OTU.
- Parte IV: Abra uma planilha e transfira dados para fazer mapas de calor, diagramas de Venn e tamanho de efeito de análise discriminante linear (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Parte I:
6. Análise estatística
- Abra o QIIME222 e determine as diferenças significativas na diversidade alfa entre os grupos usando o script de significância de grupo alfa. Este também realizará o teste de Kruskal-Wallis.
- Determinar as diferenças na diversidade beta entre os grupos usando PERMANOVA, incluindo um teste pareado25.
- Obter as diferenças significativas na estrutura da comunidade bacteriana entre os grupos usando MicrobiomeDB. Um valor de p ≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Representative Results
A quantidade e a qualidade do DNA extraído do mosto de uvas, do vinho fermentado e do vinho final foram primeiramente determinadas; o valor da quantidade varia de 15-87 ng/μL (Tabela 1).
Sequenciamento e bioinformática
O sequenciador de alta taxa de transferência do Illumina gerou um arquivo FASTQ que foi importado para o Nephele e visualizado na plataforma QIIME 226. Primeiramente, foi utilizado o software FastQC para verificar a qualidade da sequência. Em seguida, foi aparado nas extremidades 5' e 3'- para eliminar nucleotídeos de baixa qualidade, desruído, fundido e esgotado de sequências quiméricas antes de agrupar em OTUs (definição operacional para uma espécie) usando o denoiser DADA223. Eles foram mapeados para táxons bacterianos usando o banco de dados SILVA v138.1. As sequências foram agrupadas em OTU com base na similaridade de 99% das sequências de nucleotídeos. A Figura 1 mostra as curvas de rarefação DADA2 para as UTOs; atingiu um platô. Isso indicou que sequências suficientes foram cobertas para indicar a maior parte da diversidade microbiana. A análise replicada das sequências não gerou diferença significativa.
O mapa de calor baseado na abundância relativa das bactérias em diferentes regimes do mosto de uva ao vinho é mostrado na Figura 2. Os filos mais dominantes indicados em vermelho consistem em Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e, seguidos por Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. As bactérias menos abundantes foram indicadas em azul. Muitos desses grupos estavam presentes no mosto, quando a levedura foi adicionada, mas ausente durante a fermentação, especialmente Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota e Elusimicrobiota. A abundância relativa também foi determinada em nível de gênero, e os resultados indicaram gêneros importantes como Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae, como mostrado na Figura 3. Uma análise do diagrama de Venn da OTU única compartilhada revelou que 15 bactérias estavam presentes desde o mosto de uva de vinho até o vinho final (Figura 4). Os resultados do sequenciamento de amplicon com base na região da variável V4 também indicaram a diversidade alfa nas duas Traminette R e L. A Figura 4 mostra a equitabilidade das espécies como uma marca de distribuição, que é diferente entre os dois tratamentos nutricionais. Os dados mostraram que a mudança de diversidade em Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O foi menor que 1 a 13,4 brix, e a equitabilidade se aproxima de zero à medida que as abundâncias relativas variam. Os dados também foram analisados para diversidade beta; A Figura 5 mostra a diferença entre as duas fermentações Traminette R e L; As bactérias foram semelhantes nos estágios de mosto e levedura. Houve um deslocamento das bactérias na fase de fermentação para os dois tratamentos, e isso parece semelhante no vinho final (Figura 6).
Figura 1: Gráficos de rarefação das UTOs observadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mapa de calor de abundância relativa. O mapa de calor da abundância relativa nos níveis de filo R e L não foi significativamente diferente (p ≤0,05). A barra de legenda indica a pontuação da chave. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Abundância relativa dos dez principais táxons. A abundância relativa em nível de gênero dos dez melhores táxons classificados por meios com o teste da soma de postos de Wilcoxon (p ≤0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diagrama de Venn. As bactérias únicas e compartilhadas entre o mosto, levedura adicionada, fermentação e vinho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Diversidade alfa de Traminette R e Traminette L. Diversidade alfa do índice H de Shannon das duas nutricionais Fermaid O e Stimula Sauvignon blanc e Fermaid O (Dunn > 0,05) com base na análise do teste de Kruskal-Wallis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise de componentes principais. Análise de componentes principais de dados de diversidade beta do 16S rRNA com base em Bray-Curtis das duas Fermaid O nutricionais e Stimula Sauvignon Blanc e Fermaid O em diferentes estágios de produção de vinho. O círculo azul representa um aglomerado de estágios de adição de mosto e levedura. O círculo vermelho indica o vinho final e o círculo preto é a etapa de fermentação nos dois tratamentos. Os eixos 1 e 2 são variações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Data de amostragem | Amostra | A260/A280 | Concentração ng/μL Traminette R | A260/A280 | Concentração ng/μL Traminette L |
| 8/30/21 | Uva | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Dever | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Descansar | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Levedura adicionada | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Fermentação | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Fermentação | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Vinho final | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Quadro 1: Quantidade e qualidade do ADN extraído do mosto de uvas, do vinho fermentado e do vinho final.
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Discussion
O protocolo de metagenômica começa a partir da amostragem do mosto de uva, e quando a levedura foi adicionada ao mosto, o vinho fermentador e amostras finais de vinho. Isso foi seguido pela extração de DNA duplicado que foi extraído com sucesso dessas amostras. As quantidades obtidas variaram em concentração de 15 ng/μL a 87 ng/μL. Isso mostra que o protocolo de extração de DNA é eficaz para estudos metagenômicos do vinho. Embora a qualidade do DNA em A260/A280 varie, isso pode ser atribuído a diferentes parâmetros que podem afetar a extração, como a concentração de álcool e outros metabólitos de fermentação que se desenvolveram durante e pós-fermentação, bem como outros materiais vegetais orgânicos que podem inibir a extração do genoma. Estudos anteriores relataram observação semelhante sobre o material vegetal metagenômico27. No entanto, o DNA extraído no protocolo descrito alcançou quantidade suficiente para a próxima etapa da análise. O código de barras de PCR necessário para estudos metagenômicos, especialmente usando a plataforma de sequenciamento Illumina, requer que a quantidade mínima de DNA seja definida em 1 ng/L. A região V4 foi sequenciada, e a determinação da diversidade bacteriana requer o uso de sequenciamento do gene 16S rRNA; este gene possui diferentes regiões variáveis de V1-V923. Um total de 6.393.443 sequências pareadas lê com uma média de 399590,1875 ± 138442,6148 do DNA extraído das diferentes amostras. V4 tem sido comumente usado, e é referido como a região hipervariável do gene que é boa para taxonômica bacteriana e análise de diversidade. Durante o sequenciamento, sequenciamento Illumina pareado de cerca de 200-300 pb sequências foram geradas. Existem diferentes plataformas utilizadas para sequenciamento de DNA extraído de alimentos e bebidas fermentadas28. As razões para usar a plataforma Illumina são as seguintes: (1) O Illumina é uma plataforma de sequenciamento de 2ª segunda geração com excelente saída, e sua química fornece uma baixa taxa de erro e perfil. Também é acessível em comparação com os kits comerciais disponíveis para preparação de bibliotecas, e suas leituras relativamente curtas são ideais para expressão diferencial. A etapa final do protocolo foi a bioinformática, um componente importante do uso do sequenciamento amplicon 16 para a determinação da diversidade microbiana. A verificação da qualidade das sequências obtidas pelo arquivo FASTQ foi muito boa, e as UTOs obtidas a partir do QIIME resultaram em uma análise taxonômica mostrada nos resultados de abundância relativa, diversidade alfa e beta.
O sequenciamento de próxima geração (NGS) tornou-se uma ferramenta importante para o perfil das bactérias de diferentes comunidades microbianas de fermentação. Neste estudo, a classificação do amplicon 16S foi feita primeiramente em nível de filo, e um grupo mais diverso de bactérias foi observado do que previamente relatado12 durante a fermentação do vinho de uva; 15 filos também foram compartilhados, como indicado a partir da análise do resultado de Venn. Além disso, a análise em nível de gênero mostrou a presença de gêneros importantes, como Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae, que foram mais abundantes no tanque Traminette R. Limitamos nossa análise à taxonomia em nível de gênero; Há estudos em que o método tem sido utilizado para identificação em taxonomia em nível de espécie por meio de inferência amostral de altaresolução23. Uma das limitações do sequenciamento de amplicon é que os dados da sequência não podem determinar a taxonomia em nível de deformação devido ao curto comprimento da sequência 16S rRNA. Outra limitação é a detecção de cloroplastos e mitocôndrias. Será desejável que o procedimento de bioinformática possa ser utilizado para eliminar essas sequências, uma vez que são contaminantes das plantas de uva. Entretanto, protocolo de amplificação utilizando pinças de PNA-DNA para maximizar a contaminação por cloroplastos e mitocôndrias29. A elevada abundância de Firmicute no mosto das uvas, durante a fermentação e o vinho final, concorda com os estudos anteriores sobre a uva vinífera30. Os resultados da análise de diversidade alfa indicaram a equitabilidade bacteriana de cada tratamento nutricional fermentativo; parece que o nutriente Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O gerou uma bactéria mais diversa. Além disso, os dados de diversidade beta mostraram a mudança nas bactérias no estágio de fermentação; Mudanças dinâmicas indicam que o estágio de fermentação é um período muito importante onde as mudanças nutricionais afetam a seleção bacteriana. A técnica pode ser adaptada e utilizada pelas indústrias para monitorar a fermentação e melhorar a qualidade e consistência28. No entanto, mais estudos serão necessários para melhor compreender o impacto dos nutrientes orgânicos na diversidade microbiana durante a fermentação do vinho.
Este estudo é o primeiro a examinar a diversidade bacteriana durante a fermentação de uvas e vinho Traminette usando o sequenciamento de código de barras amplicon 16S para determinar as alterações bacterianas. Isso confirmou a diversidade de bactérias em nível de filo e gênero. Proteobacteria, seguido por Firmicutes, foram os mais abundantes à medida que a fermentação progrediu para o vinho final. Muitos filos que não foram relatados anteriormente foram detectados usando o sequenciamento de amplicon 16S, e isso confirmou que o método pode ser usado para monitorar a produção de vinho. A diversidade alfa mostrou o papel da alteração nutricional; Ela impactou as bactérias da fermentação, enquanto a diversidade beta indica as mudanças durante o estágio de fermentação. Mais estudos são necessários para investigar os papéis funcionais que muitos dos filos e gêneros descritos desempenham na fermentação do vinho.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
O financiamento do Appalachian State University Research Council (URC) e da bolsa CAPES Print Travel que apoiou a visita da FAO à Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil, são reconhecidos com gratidão. O presente estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código 001. O ECPDM agradece a bolsa CAPES Print Travel que apoiou sua visita à Appalachian State University. ECPDM é pesquisador fellow 2 do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
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