Summary
여기에서는 트라미네트 포도, 발효 포도 및 최종 와인의 박테리아 군집을 결정하기 위한 앰플리콘 메타게놈을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
염기서열 분석 기술의 발전과 미생물 군집 구조를 프로파일링하기 위한 생물정보학 도구 사용에 대한 비교적 쉬운 접근은 포도와 와인의 배양 가능한 미생물과 배양 불가능한 미생물 모두에 대한 더 나은 이해를 촉진했습니다. 산업 발효 과정에서 알려지거나 알려지지 않은 미생물은 종종 제품 개발 및 맛 제거를 담당합니다. 따라서 포도에서 와인에 이르기까지 박테리아를 프로파일링하면 현장 미생물 역학을 쉽게 이해할 수 있습니다. 이 연구에서 트라미네트 포도의 박테리아는 발효를 거쳐야 하며, 최종 와인은 15ng/μL에서 87ng/μL를 산출하는 DNA 추출을 거쳤습니다. V4 영역의 초가변 영역의 16S 앰플리콘을 서열분석하였고, 프로테오박테리아(Proteobacteria), 악티노박테리오타(Actinobacteriota), 피르미쿠테스(Firmicutes), 박테로이도타(Bacteroidota), 푸소박테리오타(Fusobacteriota)로 구성된 비교적 풍부한 박테리아를 서열화하였고, 그 뒤를 이어 베루코마이크로바이오타(Verrucomicrobiota), 할로박테로타(Halobacterota), 데설포박테로타(Desulfobacterota), 믹소코코코타(Myxococcota) 및 애시도박테리오타(Acidobacteriota)가 뒤따랐다. 공유된 고유한 OTU(Operational Taxonomic Unit)에 대한 벤 다이어그램 분석에 따르면 15개의 박테리아 문(phyla)이 포도 머스트, 발효 단계 및 최종 와인 모두에 공통적으로 나타나는 것으로 나타났습니다. 이전에 보고되지 않았던 문(phyla)은 16S 앰플리콘 시퀀싱(amplicon sequencing)뿐만 아니라 장내세균(Enterobacteriaceae) 및 락토바실러스과(Lactobacillaceae)와 같은 속(genera)을 사용하여 검출되었습니다. 와인의 유기 영양소 사용의 변화와 박테리아에 미치는 영향을 테스트했습니다. Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O로 자극된 Fermaid O 및 Traminette L을 포함하는 Traminette R 탱크. Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 알파 다양성은 균일성의 정도를 결정했습니다. 베타 다양성은 두 가지 처리의 발효 단계에서 박테리아의 변화를 나타냈으며 최종 와인 박테리아는 비슷하게 보였습니다. 이 연구는 16S 앰플리콘 염기서열 분석을 사용하여 와인 생산 중 박테리아 변화를 모니터링하여 와인 생산 중 포도 박테리아의 품질과 더 나은 활용을 지원할 수 있음을 확인했습니다.
Introduction
트라미네트 포도는 우수한 품질의 와인 생산이 특징이며, 상당한 수확량과 여러 곰팡이 감염에 대한 부분적인 저항성이 있습니다 1,2,3. 포도의 자연 발효는 관련 미생물, 와인 생산 환경 및 발효 용기에 의존합니다 4,5. 종종 많은 와이너리에서는 발효, 알코올 생산, 에스테르, 향 및 풍미 개발을 위해 야생 효모와 박테리아에 의존합니다6.
이 연구의 목표는 포도의 박테리아 구성을 조사하고 발효 중 역학을 모니터링하는 것입니다. 알코올이 생산되는 1차 발효를 위해 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)과 같은 스타터 배양균을 현대적으로 사용하는 것은 다양한 와인 스타일에 공통적이다7. 또한 말산이 Oenococcus oeni에 의해 젖산으로 탈카르복실화되는 2차 발효는 와인의 관능 및 맛 프로필을 개선하고 와인의 산도를 감소시킵니다 8,9. 최근 배양 독립적 방법의 사용이 발전함에 따라, 이제 와인 포도와 관련된 다양한 미생물 및 머스트(must)로 옮겨진 종을 결정하고 최종 생성물(10)까지 상이한 시간에 발효에 참여할 수 있다.
와인 발효 과정에서 머스트(must)로 옮겨진 다양한 포도의 야생 박테리아의 역할과 역학은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 박테리아 중 많은 수의 분류학은 알려져 있지 않거나 표현형 특성이 특성화되지 않았습니다. 이로 인해 공동 배양 발효에 대한 적용은 여전히 제대로 활용되지 않습니다. 그러나 미생물 배양 기반 분석은 포도 및 와인과 관련된 박테리아 개체군을 결정하는 데 사용되었습니다10. 선택적 배양 도금은 지루하고 오염되기 쉬우며 재현성이 낮고 출력이 의심스러울 수 있다는 것은 널리 알려져 있습니다. 또한 성장 요구 사항을 알 수 없는 박테리아 종도 놓치고 있습니다. 이전 연구에 따르면 배양에 독립적인 16S rRNA 유전자 기반 방법론은 복잡한 미생물 군집을 특성화하는 데 보다 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다11. 예를 들어, 16S rRNA 유전자의 초가변 영역 염기서열 분석은 포도 잎, 열매 및 와인 12,13,14의 박테리아를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 연구에 따르면 16S rRNA 메타바코딩 또는 전체 메타게놈 염기서열분석(whole metagenomic sequencing)을 사용하는 것이 마이크로바이옴 연구에 적합하다15. 와인 생산 중 박테리아 다양성과 신진대사 특성의 연관성에 대한 새로운 정보가 있으며, 이는 와인 양조학적 특성과 떼루아를 결정하는 데 도움이 될 수 있다16.
포도 및 와인 미생물 생태학을 연구하기 위해 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하는 메타게놈 도구의 이점을 극대화해야 할 필요성이 강조되었습니다16,17. 또한 식품 및 발효 생태계의 미생물 다양성을 프로파일링하기 위해 고처리량 염기서열 분석을 기반으로 하는 배양 독립적 분석법의 사용은 많은 실험실에서 매우 관련성이 높고 가치가 있으며 산업용으로 권장됩니다18,19. 이는 현재 미생물 개체군의 검출 및 분류학적 프로파일링과 환경 미생물의 기여도, 상대적 풍부도, 알파 및 베타 다양성의 이점을 제공한다20. 16S 영역의 가변 영역의 염기서열 분석은 선택의 중요한 유전자가 되었으며 다양한 미생물 생태학적 연구 중에 사용되었습니다.
많은 연구가 와인 발효 중 곰팡이, 특히 효모에 초점을 맞추고 있지만(21), 이 연구는 와인 생산을 위한 트라미네트 포도 발효 중 박테리아를 연구하는 데 사용된 16S 앰플리콘 시퀀싱 및 생물정보학 도구를 보고했습니다.
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Protocol
1. 실험적인 와인 생산
- 노스캐롤라이나주 존스빌 포도밭에 있는 다이나미스 에스테이트 와인에서 트라미네트 포도를 구해 줄기를 제거하고 으깬 후 두 개의 별도 600L 오픈탑 발효기에 넣어 뚜껑을 덮은 상태로 약 4일 동안 껍질에 그대로 둡니다.
- 하루에 한 번 뚜껑을 아래로 내려 피부를 촉촉하게 유지하고 휘발성 산(VA) 생성을 제한하십시오.
참고: 아이디어는 많은 방향족 전구체(모노테르펜)가 껍질에 위치하고 주스를 피부와 접촉시켜 와인의 방향족 잠재력을 증가시킨다는 것입니다. - 4일 후, 맥주효 모 균 추출물 추출물 QA23 (Lallemand)을 투여합니다. 이 효모는 강력한 발효기이며 포도에서 와인의 품종 특성을 향상시키는 것과 관련이 있기 때문에 선택되었습니다.
- 한 탱크인 Traminette R에 Brix가 17.7일 때 20g/hL Fermaid O를 추가하고 13.1g/hL일 때 20g/hL Fermaid O와 12.5g/hL Fermaid K를 추가하여 발효 안전성을 확보하고, 다른 탱크인 Traminette L에 Brix가 17.1일 때 40g/hL Stimula Sauvignon blanc을 추가합니다. 또한 브릭스가 13.4일 때 20g/hL Fermaid O를 추가하여 와인의 품종 특성을 향상시킵니다.
- 머스트(1일차), 효모 첨가(4일차), 발효 머스트(15일차) 및 완제품 와인 샘플(30일)의 중복 샘플을 채취하고 DNA 추출 및 균유전체 분석 전에 -20°C에서 보관합니다.
2. 균유전체학을 위한 DNA 추출
- 첫 번째 원심분리까지 위에서 얻은 모든 중복 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
- 발효된 샘플 20mL를 멸균 50mL 스크류 캡 튜브에 옮깁니다.
- 찬물 10mL를 넣고 균질화(와류)합니다. 4°C에서 800 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
알림: 이 단계는 샘플의 고형물을 제거합니다. - 2.3단계를 두 번 반복하고 상층액을 동일한 튜브에 합칩니다.
- 4°C에서 3,000 x g 에서 20분 동안 상층액을 원심분리하여 세포를 펠트합니다. 상층액을 버리십시오.
- 펠릿을 1mL의 PBS에 재현탁시키고 2mL 스크류 캡 튜브로 옮기고 14,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. PBS를 사용하여 두 번 더 세탁하십시오.
- 이 단계에서 펠릿을 -20°C에서 얼리거나 2.8단계를 따르십시오. 모든 샘플을 동일한 방식으로 처리하는 것이 중요합니다.
- 978μL의 인산나트륨 완충액을 추가합니다. 인산나트륨 완충액을 제조하고NaH2PO4· H2O와Na2HPO4(무수) 10.9g을 증류하여 1 L의 부피를 만들고, pH를 7.4로 조절한다.
- 122μL의 DNA 완충액(DNA 스핀 키트)과 와류를 추가합니다.
- 냉장고(4°C)에서 45분-1시간 동안 그대로 둡니다. 15분마다 샘플을 소용돌이칩니다. 이 단계는 하룻밤(o/n) 또는 DNA 스핀 키트를 계속 사용할 준비가 될 때까지 그대로 둘 수 있습니다.
- 1mL의 샘플을 용해 용액 1 튜브(DNA 스핀 키트)에 옮기고 캡을 조입니다(캡이 아닌 튜브 측면에 샘플 번호를 적으십시오. 키트 시약은 캡에 적힌 모든 것을 제거합니다).
- 비드 비팅 그라인더(6.5m/s, CY: 24 x 2)에서 60초 동안 샘플을 3회 균질화합니다. 비드 비팅 그라인더에 얼음을 넣는 장치가 있는 경우 튜브 아래에 드라이아이스 50g을 넣습니다. 그렇지 않은 경우 샘플을 각 균질화 단계 사이에 5분 동안 젖은 얼음 위에 보관합니다.
- 원심분리기 용해 매트릭스 E 튜브(DNA 스핀 키트)를 16800 x g(또는 최대 속도)에서 1분 동안 가열합니다.
- 상층액을 깨끗한 마이크로튜브로 옮깁니다. 그 후 단백질 침전 용액(PPS) 시약(DNA spin kit) 250μL를 넣고 튜브를 손으로 10회 흔들어 혼합합니다.
- 침전물을 펠릿화하기 위해 16800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 멸균된 15mL 튜브에 옮깁니다. 1mL의 결합 매트릭스 현탁액(DNA 스핀 키트)을 상층액에 추가합니다.
알림: 바인딩 매트릭스 서스펜션이 균질해질 때까지 사용하기 전에 다시 현탁하십시오. - 튜브를 손으로 뒤집어 2분 동안 뒤집은 다음 튜브를 랙에 3분 동안 그대로 둡니다(실리카 매트릭스가 침전될 수 있도록).
- 상층액 1mL를 조심스럽게 제거합니다. 나머지 상층액에 매트릭스를 재현탁시킵니다.
- 혼합물 600μL를 스핀 필터 튜브(DNA 스핀 키트)에 옮기고 14500 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 남은 혼합물과 원심분리기를 추가합니다.
- 플로우스루를 디캔트하고 500μL의 세척 용액(DNA 스핀 키트)을 스핀 필터 튜브에 추가하고 14500 x g에서 1분 동안 원심분리합니다(세척 용액에 EtOH를 추가해야 합니다. 제품 핸드북 참조). 플로우 스루를 디캔팅하고 두 번 더 세탁을 반복합니다(총 3회 세탁).
- 플로우 스루와 원심분리기를 14,500 x g 에서 추가로 2분 동안 디캔팅하여 잔류 세척 용액 매트릭스를 건조시킵니다.
- 탈수 필터를 제거하고 새 캐치 튜브(DNA 스핀 키트)에 넣습니다. 스핀 필터를 실온(RT)에서 5분 동안 자연 건조합니다.
- DNAse가 없는 물(DNA 스핀 키트)을 55°C에서 5분 동안 데웁니다. DNAse가 없는 물 50μL를 넣고 DNA를 효율적으로 용출하기 위해 피펫 팁으로 필터 멤브레인의 매트릭스를 부드럽게 저어줍니다. 샘플을 실온에서 1분 동안 그대로 둔 다음 14500 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리합니다.
- 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 시료 혼합물(시료 2μL + 물 2μL + 로딩 버퍼 1μL)을 겔에 넣습니다. DNA 농도를 측정합니다.
- 샘플을 -20 °C에서 보관합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 추출된 DNA를 정량화합니다.
참고: 1μL 부피의 DNA를 적하하고 정량화했으며 DNA의 품질은 A260/A280 비율로 기록되었습니다.
3. DNA 전기영동
- 1 Tris/Borate/EDTA(TBE) 완충액(미니 겔의 경우 20mL, 중간 겔의 경우 70-100mL)에 0.5% 아가로스 겔을 준비합니다. 아가로스+완충액의 무게를 달고 전자레인지에 끓여 아가로스를 녹인 후 다시 무게를 잰 다음 원래 무게에 dH2O를 추가합니다. 아가로스 용액을 55-60 °C로 식히고 빗 어셈블리가 있는 겔 포머에 붓습니다. 젤이 굳도록 두십시오.
- 샘플(10μL)에 1μL의 10x 겔 로딩 버퍼를 추가하고 분자량 마커 옆에 있는 겔에 로딩합니다. 파란색 염료가 바닥 근처에 올 때까지 100-115V(대형 젤) 또는 90V(미니 젤)에서 음극(검은색)에서 양극(빨간색)으로 실행합니다.
- 1 μL/mL 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 그린(니트릴 장갑 및 고글 필요)에 30분 동안 겔을 염색하고 물로 헹구고 자외선(UV) 광원 아래에서 봅니다. 중복된 샘플에서 추가 처리를 위해 가장 높은 수율을 선택합니다.
4. 고처리량 시퀀싱
- 특정 프라이머 515F(5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') 및 806R(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22을 사용하여 16S rRNA 유전자의 V4 초가변 영역을 증폭합니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 조건을 94°C에서 2분, 94°C에서 20초, 58°C에서 20초, 65°C에서 1분, 65°C에서 10분(최종 연장)으로 설정합니다.
- 고충실도 PCR 마스터 믹스(재료 표)를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다.
- DNA 라이브러리 준비 키트로 라이브러리를 생성한 후 염기서열분석 플랫폼에서 paired-end sequencing을 사용하여 염기서열분석을 수행할 수 있습니다.
참고: 여기에서 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit로 생성된 라이브러리는 novaseq6000 플랫폼에서 paired-end Illumina 염기서열분석(2 × 250bp)을 사용하여 시퀀싱되었습니다. - 시퀀싱 단계를 따릅니다.
- 1단계: 일반적으로 일반적인 크기를 선택하는 방법으로 효소로 DNA를 전단합니다.
- 3.5μL의 염기서열분석 완충액과 1.5μL의 효소 혼합물을 25μL의 DNA(약 1μg)에 넣고 피펫으로 10회 혼합하고 빠르게 회전시킵니다.
- 뚜껑을 75°C로 예열하고, (1) 30°C에서 20분 (2) 30°C에서 65분 (3) 4°C로 예열합니다.
- 2단계: 결찰을 통해 어댑터 추가
- 피펫을 사용하여 15μL의 ligation master mix, 1.25μL의 adapter, 0.5μL의 ligation enhancer 및 30μL의 end prep DNA mix를 추가합니다.
- 20°C에서 thermocycler에서 15분 동안 배양한 다음 1.5μL의 우라실 특이적 절제 시약(USER) 효소를 연결 혼합물에 추가하여 총 48.26μL를 얻습니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 어댑터 결찰 DNA에 43.5μL의 마그네틱 비드를 추가하고 피펫으로 20회 혼합한 후 RT에서 5분 동안 배양합니다. 마그네틱 랙으로 비드를 분리한 다음 5-10분 동안 배양하고 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 100 % 에탄올 80 μL로 세척하고 30 초 동안 건조시킨 다음 다시 세척하십시오. 8.5 μL의 10 mM Tris HCl / 0.1x Tris-EDTA (TE) / HPLCH 20에 비드와 펠릿을 용출하고 피펫과 혼합하고 RT에서 2 분 동안 배양합니다.
- 마그네틱 랙에서 배양하고 7.5μL의 용출된 DNA를 상층액으로 제거합니다. 용리액을 새 튜브에 넣고 PCR 단계를 수행합니다.
- 먼저, 12.5 μL의 마스터 믹스, 2.5 μL의 index primer i7 primer, 2.5 μL의 universal PCR primer/i5 primer를 7.5 μL 어댑터 접합 DNA에 첨가하여 25 μL의 PCR 반응 믹스를 얻습니다. 다음 PCR 조건을 사용하십시오: 뚜껑을 103°C로 예열합니다. 98°C에서 30초, 98°C에서 10초, 65°C에서 75초, 65°C에서 5분, 4주기 후 10°C에서 유지합니다.
- 25μL 증폭된 DNA를 세척합니다. 22.5μL의 마그네틱 비드를 넣고 20회 혼합합니다. 상온에서 5분 동안 배양하고 상층액 50μL를 제거합니다. 80% 에탄올 100μL로 비드를 세척하고 비드를 30초 동안 부드럽게 건조시켜 모든 에탄올을 제거합니다.
- 짙은 갈색 비드를 16μL의 물에 다시 현탁시키고 피펫으로 20회 혼합한 다음 마그네틱 랙에 30-60초 동안 놓습니다. 15μL를 새 튜브로 옮깁니다.
- 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 완충액 90μL + 염료 1μL + DNA 라이브러리 샘플 2μL를 혼합하고 농도를 판독합니다. DNA를 2nM로 희석하고 플로우 셀에 27-30μL를 로드한 다음 시퀀서에 넣습니다.
- 3단계: 어댑터의 염기서열을 분석하고, 위에서 생성된 라이브러리를 패턴화된 플로우 셀의 매트릭스에 하이브리드화하고, 제조업체의 지침에 따라 DNA를 캡처합니다. 두 번째 합성을 위한 템플릿으로 사용합니다.
- 그런 다음 두 번째 가닥을 클론 클러스터로 증폭합니다. 클러스터를 선형화하고 활성 사이트를 차단합니다. 시퀀싱 프라이머를 추가하여 manuacturer의 프로토콜에 따라 시퀀스에서 합성에 의한 시퀀싱을 위한 사이트를 제공합니다.
참고: 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 자연 상보성을 사용하여 DNA 템플릿 가닥에 결합합니다. 각 뉴클레오티드에는 형광 태그와 다음 염기의 포함을 차단하는 가역 종결제가 있습니다. 그러므로, 형광 신호의 존재는 어떤 뉴클레오티드가 삽입되었는지를 나타내고, 종결인자는 결합할 다음 염기를 위해 절단된다.
- 그런 다음 두 번째 가닥을 클론 클러스터로 증폭합니다. 클러스터를 선형화하고 활성 사이트를 차단합니다. 시퀀싱 프라이머를 추가하여 manuacturer의 프로토콜에 따라 시퀀스에서 합성에 의한 시퀀싱을 위한 사이트를 제공합니다.
- 4단계: 단일 결합 가닥을 증폭하여 합성에 의해 나란히 서열화된 염기서열 클러스터를 제공합니다.
참고: 클러스터는 양방향 스캐닝 및 2채널 시퀀싱 화학을 통해 단일 가닥보다 더 밝은 신호를 제공합니다. 시퀀싱 소프트웨어는 데이터 분석을 위해 기본 호출(*.cbcl) 파일을 지정된 출력 폴더 위치로 자동 전송합니다.
- 1단계: 일반적으로 일반적인 크기를 선택하는 방법으로 효소로 DNA를 전단합니다.
5. 생물정보학
- 시퀀스 데이터를 FASTQ 파일로 생성합니다. 다음 부분을 포함하도록 분석합니다.
- 파트 I :
- 시퀀서에서 가져온 FASTQ 파일을 저장하고 클릭하여 스프레드시트 파일을 열고 매핑/메타데이터 파일을 생성합니다.
- Nephele 열기 web사이트(https://nephele.niaid.nih.gov/), FASTQ 업로드 files, QIIME222에서 QC, 필터링 및 트리밍을 읽습니다. 원시 염기서열을 SRA(Sequence Read Archive) 및 GenBank로 NCBI BioProject(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)에 보관합니다.
- 파트 II: Nephele 웹 사이트(https://nephele.niaid.nih.gov/)로 이동하여 역다중화 쌍 끝 읽기, 필터 대체 및 키메라 오류를 수행하고 DADA223을 사용하여 병합합니다. Silva 버전 132 99% OTU 데이터베이스에서 훈련된 Naive Bayes 분류기를 사용하여 97% 유사성24에서 박테리아 분류 할당을 수행합니다.
- 파트 III: MicrobiomeDB 웹사이트를 열고 클릭하여 파일을 업로드하고 OTU 알파 다양성, 베타 다양성, 상대 풍부도 및 희귀 곡선(https://microbiomedb.org/mbio/app)을 생성합니다.
- 파트 IV: 스프레드시트를 열고 데이터를 전송하여 히트맵, 벤 다이어그램 및 선형 판별 분석 효과 크기(https://microbiomedb.org/mbio/app)를 만듭니다.
- 파트 I :
6. 통계 분석
- QIIME222를 열고 alpha-group-significance 스크립트를 사용하여 그룹 간 알파 다양성의 유의한 차이를 확인합니다. 이것은 또한 Kruskal-Wallis 테스트를 수행합니다.
- 쌍별 검정을 포함하여 PERMANOVA를 사용하여 그룹 간 베타 다양성의 차이를 결정합니다25.
- MicrobiomeDB를 사용하여 그룹 간의 박테리아 군집 구조에서 중요한 차이점을 얻습니다. p-값 ≤0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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Representative Results
포도에서 추출한 DNA의 양과 질, 발효 와인, 최종 와인이 먼저 결정되었습니다. 수량 값의 범위는 15-87ng/μL입니다(표 1).
염기서열분석 및 생물정보학
Illumina 고처리량 시퀀서는 Nephele로 가져와서 QIIME 2 플랫폼26에서 볼 수 있는 FASTQ 파일을 생성했습니다. 첫째, FastQC 소프트웨어를 사용하여 시퀀스 품질을 확인했습니다. 그런 다음, DADA2 디노이저(23)를 사용하여 OTU(종에 대한 작동 정의)로 클러스터링하기 전에 저품질 뉴클레오티드를 제거하고, 노이즈를 제거하고, 병합하고, 키메라 서열을 고갈시키기 위해 5' 및 3' 말단 모두에서 트리밍되었습니다. 이들은 SILVA v138.1 데이터베이스를 사용하여 박테리아 분류군에 매핑되었습니다. 염기서열은 99%의 뉴클레오티드 염기서열 유사성을 기반으로 OTU로 군집화되었습니다. 그림 1 은 OTU에 대한 DADA2 희박 곡선을 보여줍니다. 그것은 고원에 이르렀다. 이것은 미생물 다양성의 대부분을 나타내기에 충분한 서열이 덮여 있음을 나타냅니다. 염기서열의 반복 분석에서는 유의미한 차이가 발생하지 않았습니다.
포도 머스트에서 와인에 이르기까지 다양한 체제에서 박테리아의 상대적 풍부도를 기반으로 한 히트맵은 그림 2에 나와 있습니다. 빨간색으로 표시된 가장 우세한 문은 프로테오박테리아, 악티노박테리오타, 피르미쿠테스, 박테로이도타, 푸소박테리오타, 그리고 베루코마이크로바이오타, 할로박테로타, 데설포박테로타, 믹소코코타, 애시도박테리오타가 그 뒤를 잇습니다. 가장 적은 박테리아는 파란색으로 표시되었습니다. 효모가 첨가되었지만 발효 중에는 결핍된 효모, 특히 니트로스피로타, 브델로비브리오노타, 니트로스피노타, 아르마티모나도타, 젬마티모나도타, 클로로플렉시, 캄필로박테로타, 데이노코코타, 파테시박테리아, 플랑토마이세토타, 압디티박테리오타, 크레나르카이오타, 스피로카에토타, 의존과, 서모토고타, 메틸로미라빌로타 및 엘루시마이크로비오타. 상대적 풍부도는 또한 속 수준에서 결정되었으며, 결과는 그림 3과 같이 Enterobacteriaceae 및 Lactobacillaceae와 같은 중요한 속을 나타냅니다. 공유된 고유 OTU의 벤 다이어그램 분석은 와인 포도 머스트에서 최종 와인에 이르기까지 15개의 박테리아가 존재한다는 것을 보여주었습니다(그림 4). V4 변수 영역을 기반으로 한 앰플리콘 염기서열분석의 결과도 두 트라미네트 R과 L의 알파 다양성을 나타냈으며, 그림 4는 분포 표시로서의 종 균일성을 보여주며, 이는 두 영양 처리 간에 다릅니다. 데이터에 따르면 Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O의 다양성 이동은 13.4 brix에서 1보다 낮았으며 상대적 풍부도가 다양하기 때문에 균일성이 0에 가깝습니다. 데이터는 또한 베타 다양성에 대해 분석되었습니다. 도 5는 두 발효 Traminette R과 L의 차이를 보여줍니다. 박테리아는 필수 및 효모 첨가 단계에서 유사했습니다. 두 가지 처리의 발효 단계에서 박테리아에 변화가 있었고 최종 와인에서도 비슷하게 보입니다(그림 6).
그림 1: 관찰된 OTU의 희박 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상대적 풍부도 히트맵. 문(phylum) 수준 R과 L에서의 상대적 풍부도의 히트맵은 유의하게 다르지 않았다(p ≤0.05). 범례 막대는 키 점수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 상위 10개 분류군의 상대적 풍부도. Wilcoxon 순위 합계 검정(p ≤0.05)을 통해 배지별로 순위가 매겨진 상위 10개 분류군의 속 수준에서의 상대적 풍부도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 벤 다이어그램. 필수품, 효모 첨가, 발효 및 와인 중 독특하고 공유 된 박테리아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Traminette R과 Traminette L의 알파 다양성. Kruskal-Wallis 검정 분석을 기반으로 한 두 영양 Fermaid O 및 Stimula Sauvignon blanc 및 Fermaid O의 Shannon's H 지수의 알파 다양성(Dunn > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 주성분 분석. 와인 생산의 서로 다른 단계에서 두 가지 영양 Fermaid O 및 Stimula Sauvignon Blanc 및 Fermaid O의 Bray-Curtis를 기반으로 한 베타 다양성의 16S rRNA 데이터의 주성분 분석. 파란색 원은 필수 및 효모 첨가 단계의 클러스터를 나타냅니다. 빨간색 원은 최종 와인을 나타내고 검은색 원은 두 트리트먼트의 발효 단계를 나타냅니다. 축 1과 2는 변형입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플링 날짜 | 견본 | A260/A280 시리즈 | 농도 ng/μL 트라미네트 R | A260/A280 시리즈 | 농도 ng/μL 트라미네트 L |
| 8/30/21 | 포도 | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | 합니다 | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | 쉬다 | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | 효모 첨가 | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | 발효 | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | 발효 | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | 파이널 와인 | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
표 1: 포도에서 추출한 DNA의 양과 질, 발효 와인, 최종 와인.
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Discussion
균유전체학(metagenomics)의 프로토콜은 포도 머스트(must)의 샘플링에서 시작되며, 머스트에 효모가 첨가되면 발효 와인과 최종 와인 샘플이 됩니다. 그 다음에는 이들 샘플에서 성공적으로 추출된 중복 DNA 추출이 뒤따랐습니다. 얻어진 양은 농도가 15ng/μL에서 87ng/μL까지 다양했습니다. 이는 DNA 추출 프로토콜이 와인의 메타게놈 연구에 효과적임을 보여줍니다. A260/A280에서 DNA의 품질은 다양하지만, 이는 게놈 추출을 억제할 수 있는 기타 유기 식물 물질뿐만 아니라 발효 중 및 발효 후에 발생한 알코올 농도 및 기타 발효 대사 산물과 같이 추출에 영향을 미칠 수 있는 다양한 매개변수에 기인할 수 있습니다. 이전의 연구들은 균유전체 식물 물질(metagenomic plant material)에 대한 유사한 관찰을 보고했다(27). 그러나, 기술된 프로토콜에서 추출된 DNA는 분석의 다음 단계에 충분한 양을 달성하였다. 메타게놈 연구, 특히 Illumina 염기서열분석 플랫폼을 사용하는 데 필요한 PCR 바코드에서는 최소 DNA 양을 1ng/L로 설정해야 합니다. V4 영역은 서열을 분석하고, 박테리아 다양성을 측정하기 위해서는 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용해야 합니다. 이 유전자는 V1-V923과 다른 가변 영역을 가지고 있다. 총 6,393,443개의 쌍말단 서열은 서로 다른 샘플에서 추출된 DNA에서 평균 399590.1875 ± 138442.6148로 판독됩니다. V4는 일반적으로 사용되어 왔으며 박테리아 분류 및 다양성 분석에 좋은 유전자의 초가변 영역이라고합니다. 염기서열분석 동안, 쌍을 이루는 Illumina 염기서열분석 ca. 200-300 bp 염기서열이 생성되었습니다. 식품 및 발효 음료에서 추출한 DNA의 염기서열을 분석하기 위해 사용되는 다양한 플랫폼이있다 28. Illumina 플랫폼을 사용하는 이유는 다음과 같습니다: (1) Illumina는 우수한 출력을 가진 2세대 시퀀싱 플랫폼이며, 화학적 성질로 인해 오류율과 프로파일이 낮습니다. 또한 도서관 준비를 위해 사용 가능한 상업용 키트에 비해 저렴하며 상대적으로 짧은 판독은 차등 표현에 이상적입니다. 프로토콜의 마지막 단계는 미생물 다양성 측정을 위한 앰플리콘 16 염기서열분석 사용의 중요한 구성 요소인 생물정보학이었습니다. 얻어진 서열 FASTQ 파일의 품질 검사는 매우 양호했으며, QIIME에서 얻은 OTU는 상대적 풍부도, 알파 및 베타 다양성의 결과로 분류학적 분석을 나타냈습니다.
차세대 염기서열분석(NGS)은 다양한 발효 미생물 군집의 박테리아를 프로파일링하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 이 연구에서 16S 앰플리콘 분류는 문(phylum) 수준에서 처음 수행되었으며, 포도 와인 발효 중에 이전에 보고된12보다 더 다양한 박테리아 그룹이 발견되었습니다. Venn 결과의 분석에서 나타난 바와 같이 15 개의 문도 공유되었습니다. 또한, 속 수준에서의 분석은 Traminette R 탱크에서 더 풍부한 Enterobacteriaceae 및 Lactobacillaceae와 같은 중요한 속의 존재를 보여주었습니다. 우리는 분석을 속 수준의 분류학으로 제한했습니다. 이 방법이 고해상도 샘플 추론을 통해 종 수준의 분류학에서 식별에 사용된 연구가있습니다 23. 앰플리콘 염기서열분석의 한계 중 하나는 16S rRNA 염기서열의 길이가 짧기 때문에 염기서열 데이터로 균주 수준 분류를 결정할 수 없다는 것입니다. 또 다른 한계는 엽록체와 미토콘드리아의 검출입니다. 생물정보학 절차가 포도 식물의 오염 물질이기 때문에 이러한 서열을 제거하는 데 사용될 수 있다면 바람직할 것입니다. 그러나, 엽록체와 미토콘드리아 오염을 최대화하기 위해 PNA-DNA 클램프를 이용한 증폭 프로토콜29. 포도에 있는 Firmicute의 높은 풍부는, 발효 및 마지막 포도주 도중에, 포도주포도 30에 이전 학문과 일치해야 한다. 알파 다양성 분석의 결과는 각 발효 영양 처리의 박테리아 균일성을 나타냈습니다. Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O 영양소는 더 다양한 박테리아를 생성한 것으로 보입니다. 또한 베타 다양성 데이터는 발효 단계에서 박테리아의 이동을 보여주었습니다. 동적 변화는 발효 단계가 영양 변화가 박테리아 선택에 영향을 미치는 매우 중요한 기간임을 나타냅니다. 이 기술은 발효를 모니터링하고 품질과 일관성을 개선하기 위해 산업에서 채택 및 사용할 수 있습니다28. 그러나 와인 발효 중 미생물 다양성에 대한 유기농 영양소의 영향을 더 잘 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
이 연구는 박테리아 변화를 결정하기 위해 16S 앰플리콘 바코드 시퀀싱을 사용하여 트라미네트 포도와 와인의 발효 중 박테리아 다양성을 조사한 최초의 연구입니다. 이를 통해 문(phylum)과 속(genus) 수준에서 박테리아의 다양성을 확인했다. 프로테오박테리아(Proteobacteria)와 피르미쿠테스(Firmicutes)가 그 뒤를 잇는 프로테오박테리아(Proteobacteria)는 발효가 최종 와인으로 진행됨에 따라 가장 풍부했습니다. 이전에 보고되지 않았던 많은 문(phyla)이 16S 앰플리콘 염기서열분석을 사용하여 검출되었으며, 이를 통해 이 방법을 사용하여 와인 생산을 모니터링할 수 있음을 확인했습니다. 알파 다양성은 영양 변화의 역할을 보여주었습니다. 그것은 발효 박테리아에 영향을 미쳤고, 베타 다양성은 발효 단계에서의 변화를 나타냅니다. 설명된 많은 문과 속이 와인 발효에서 수행하는 기능적 역할을 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
애팔래치아 주립대학교 연구위원회(URC) 보조금과 브라질 상파울루 리베이랑 프레투에 있는 상파울루 대학교(Universidade de São Paulo)의 FAO 방문을 지원한 CAPES Print Travel 펠로우십의 자금 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001에 의해 부분적으로 재정 지원을 받았습니다. ECPDM은 그녀의 애팔래치아 주립대학교 방문을 지원해 준 CAPES Print Travel 보조금에 감사하고 있습니다. ECPDM은 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq)의 연구원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
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