Summary
मधुमेह रेटिनोपैथी से संबंधित अपमान जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स से मृत्यु के लिए रेटिना वाहिका की लचीलापन की निगरानी के लिए एक सुरक्षा परख विकसित की गई थी।
Abstract
डायबिटिक रेटिनोपैथी (डीआर) एक जटिल और प्रगतिशील ओकुलर बीमारी है जो इसके रोगजनन में दो अलग-अलग चरणों की विशेषता है। पहले चरण में रेटिना को मधुमेह से प्रेरित क्षति से सुरक्षा का नुकसान शामिल है, जबकि दूसरा चरण इस क्षति के संचय पर केंद्रित है। पारंपरिक परख मुख्य रूप से केशिका अध: पतन के मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो क्षति की गंभीरता का संकेत है, अनिवार्य रूप से डीआर के दूसरे चरण को संबोधित करता है। हालांकि, वे केवल अप्रत्यक्ष रूप से अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं कि क्या रेटिना वास्कुलचर के सुरक्षात्मक तंत्र से समझौता किया गया है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, रेटिना के सुरक्षात्मक तंत्र का सीधे आकलन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया गया था - विशेष रूप से, ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स जैसे मधुमेह से प्रेरित अपमान के खिलाफ इसकी लचीलापन। यह सुरक्षा परख, हालांकि शुरू में मधुमेह रेटिनोपैथी के लिए डिज़ाइन किया गया था, दोनों शारीरिक और रोग संदर्भों में व्यापक अनुप्रयोगों की क्षमता रखता है। सारांश में, मधुमेह रेटिनोपैथी के रोगजनन को समझने में सुरक्षा हानि और क्षति संचय के दोहरे चरणों को पहचानना शामिल है, इस अभिनव सुरक्षा परख के साथ अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करना और संभावित रूप से अन्य चिकित्सा स्थितियों तक विस्तार करना।
Introduction
डायबिटिक रेटिनोपैथी (डीआर) डायबिटीज मेलिटस (डीएम) की माइक्रोवैस्कुलर जटिलताओं में से एक है, औरविकसित देशों में कामकाजी उम्र के व्यक्तियों में अंधेपन का प्रमुख कारण है। डायबिटिक रेटिनोपैथी के लिए प्रमुख जोखिम कारक हाइपरग्लेसेमिया 2,3,4 की अवधि और डिग्री हैं। जबकि डीएम रेटिना5 के संवहनी और तंत्रिका दोनों घटकों की शिथिलता का कारण बनता है, डीआर का निदान रेटिना वास्कुलचर6 की रूपात्मक विशेषताओं पर आधारित है।
हाइपरग्लेसेमिया-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव डीआर रोगजनन7 के ड्राइवरों में से एक है। ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि से व्यापक क्षति होती है, जो माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यक्षमता से समझौता करती है और इस तरह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर को और बढ़ाती है। ये घटनाएं रेटिना वाहिकाओं के रिसाव, भड़काऊ साइटोकिन्स के स्तर में वृद्धि और रेटिना के भीतर तंत्रिका और संवहनी कोशिका दोनों प्रकारों की मृत्यु के साथ होती हैं। संवहनी कोशिकाओं का नुकसान, और इसलिए रेटिना के व्यापक केशिका नेटवर्क की कार्यक्षमता, हाइपोक्सिया में परिणाम, प्रतिक्रियाओं की एक किस्म के लिए एक शक्तिशाली उत्तेजना5. इस तरह की प्रतिक्रियाओं में संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) की अभिव्यक्ति में वृद्धि शामिल है जो पारगम्यता और एंजियोजेनेसिस दोनों को चलाती है, डीआर के उन्नत, दृष्टि-धमकी देने वाले चरणों की कार्डिनल विशेषताएं - मधुमेह धब्बेदार एडिमा, और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी6.
डीआर की कुछ विशेषताएं बताती हैं कि एक जीव (दोनों रोगियों और प्रयोगात्मक जानवरों) में इस संकेत का विरोध करने की आंतरिक क्षमता होती है। दृष्टि-धमकी देने वाले डीआर 8,9,10,11,12,13 विकसित करने से पहले मरीजों को डीएम के कई दशकों का अनुभव होता है। जबकि डीएम के कृंतक मॉडल डीआर14 के उन्नत, दृष्टि-धमकी देने वाले चरणों को विकसित नहीं करते हैं, डीआर का प्रारंभिक/हल्का रूप जो प्रकट होता है वह डीएम15,16 के हफ्तों या महीनों की अवधि के बाद ही ऐसा करता है। इसके अलावा, रोगियों और प्रयोगात्मक जानवरों दोनों में, डीआर प्रगतिशील है, और डीएम की अवधि लंबे समय तक बढ़ने के साथ रेटिना की शिथिलता / क्षति बढ़ जाती है। अंत में, डीएम के साथ कुछ रोगी कभी भी डीआर विकसित नहीं करते हैं। कुछ उदाहरणों में, ऐसा इसलिए है क्योंकि ऐसे व्यक्तियों को डीआर विकसित होने के लिए लंबे समय तक मधुमेह का अनुभव नहीं होता है। अन्य उदाहरणों में, ऐसा इसलिए है क्योंकि वे डीआर के लिए असाधारण प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं; जैसा कि मेडलिस्ट अध्ययन के प्रतिभागियों के साथ होता है, जो डीएम17 के 50 या अधिक वर्षों के बाद डीआर विकसित नहीं करते हैं। डीआर से सुरक्षा के अस्तित्व और इसकी विशाल अनुवाद संबंधी प्रासंगिकता के लिए इस तरह के सम्मोहक समर्थन के बावजूद, अंतर्निहित सुरक्षा तंत्र की आक्रामक जांच नहीं की गई है।
इस के साथ वर्णित संरक्षण परख क्यों मधुमेह चूहों में डीएम की शुरुआत से डॉ देरी हो रही है की जांच की सुविधा के लिए विकसित किया गया था. डीएम और गैर-डीएम चूहों पर लागू इस परख के प्रमुख चरणों में (1) आंख (पूर्व विवो या विवो में) के लिए एक उप-अधिकतम मृत्यु-उत्प्रेरण अपमान प्रदान करना, (2) रेटिना वाहिका को अलग करना, (3) ट्यूनल और डीएपी के साथ वास्कुलचर को धुंधला करना, (4) परिणामी छवियों को चित्रित करना और ट्यूनल / डीएपीआई डबल-पॉजिटिव प्रजातियों के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करना।
Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन को शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और संस्थागत जैव सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। सात सप्ताह के नर C57/BL6/J चूहों को 12 h-light/dark cycle पर रोगजनक मुक्त वातावरण में समूह पिंजरों में रखा गया और मुफ्त भोजन और पानी की सुविधा प्रदान की गई। चूहों सीओ2 श्वासावरोध द्वारा euthanized थे, और आंखों enucleated और तुरंत18 संसाधित किया गया. जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)। अध्ययन के लिए आवश्यक आवश्यक उपकरण चित्र 1 में दर्शाए गए हैं।
1. मृत्यु-उत्प्रेरण अपमान का वितरण
- टीबीएच (ईएक्स विवो) के साथ ऑक्सीडेटिव तनाव करें।
- संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद चूहों को इच्छामृत्यु दें और उनकी आंखोंको 18 (चित्रा 2ए)को एन्यूक्लियेट करें।
- नेत्रगोलक को सीधे डीएमईएम + 1% बीएसए युक्त 24-अच्छी प्लेट के अलग-अलग कुओं में रखें, 5 एमएम टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपरॉक्साइड (टीबीएच) के साथ या बिना ( सामग्री की तालिकादेखें); 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। डीएनए को खंडित करने के लिए 10 मिनट के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण नमूने का इलाज डीएनएएस (50 यू /
नोट: टीबीएच की खुराक (एजेंट है कि ऑक्सीडेटिव तनाव लाती है) अलग रेटिना वाहिकाओं18 के भीतर कोशिका मृत्यु का एक आसानी से पता लगाने योग्य और उप अधिकतम स्तर प्रेरित करने के लिए चुना गया था. - रात भर 10% बफर फॉर्मेलिन में आंखों को ठीक करें (16 घंटे न्यूनतम)।
- सूजन (विवो में) को प्रेरित करने के लिए साइटोकिन कॉकटेल का उपयोग करें।
- 100 मिलीग्राम/किग्रा केटामाइन और 5 मिलीग्राम/किग्रा xylazine के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें।
- साइटोकिन कॉकटेल के 1 माइक्रोन/आंख को कांच में इंजेक्ट करने के लिए एक अनुकूलित 33 जी सुई ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें; इंजेक्शन साइट लिम्बस (चित्रा 2बी) से 2-3 मिमी है।
नोट: साइटोकिन कॉकटेल में 1 μg/mL TNF-α, 1 μg/mL IL-1β और 1500 U/μL IFN-γ18 का 1:1:1 अनुपात होता है ( सामग्री की तालिकादेखें)। - इंजेक्शन के 24 घंटे बाद, चूहों को इच्छामृत्यु (संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए), उनकी आंखों को एन्यूक्लिएट करें और रात भर 10% बफर फॉर्मेलिन के साथ ठीक करें।
नोट: प्रयोग अधिकतम 1 सप्ताह के लिए निर्धारण के बाद रोका जा सकता है और फिर बाद में पुनरारंभ किया जा सकता है।
2. रेटिना अलगाव
- नेत्रगोलक को काटें।
- ऑप्टिक तंत्रिका धीरे (चित्रा 2C) हड़पने के लिए सीधे संदंश का प्रयोग करें. लिम्बस के पीछे 2-3 मिमी का चीरा बनाने के लिए दूसरे हाथ से एक माइक्रो-चाकू पकड़ें।
- ऑप्टिक तंत्रिका के साथ नेत्रगोलक को घुमाते हुए लिंबस के समानांतर काटने के लिए माइक्रो-चाकू से माइक्रो-कैंची पर स्विच करें जब तक कि नेत्रगोलक को दो हिस्सों में काट नहीं दिया जाता है।
- लेंस (चित्रा 2C) सहित आंख के पूर्वकाल आधे त्यागें।
- श्वेतपटल निकालें।
- धीरे रेटिना के बंद श्वेतपटल 1-3 मिमी लिफ्ट करने के लिए सीधे संदंश का प्रयोग करें.
- ऑप्टिक तंत्रिका के रास्ते के श्वेतपटल भाग में दो रेडियल कटौती करने के लिए माइक्रो कैंची का प्रयोग करें. अंतर्निहित रेटिना को काटने से बचें।
- घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग करने के लिए काठक प्रालंब हड़पने और रेटिना बंद यह फाड़. RPE परत श्वेतपटल के साथ बंद आ जाएगी।
- रेटिना को धो लें।
- एक सूक्ष्म रंग का प्रयोग करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से पकवान है कि डबल आसुत पानी से भरा गया है के भीतर एक अच्छी तरह से अलग रेटिना हस्तांतरण करें.
- कमरे के तापमान पर मध्य-मध्यम गति से पकवान को धीरे से हिलाएं। हर 30 मिनट से 1 घंटे तक पानी बदलें, कम से कम 4-5 बार, फिर रात भर छोड़ दें।
3. रेटिना vasculature अलगाव
- पाचन: डबल-डिस्टिल्ड वॉटर को YL ट्रिप्सिन सॉल्यूशन के 800 μL (0.1 M Tris बफर (pH 7.8)) में 3% ट्रिप्सिन) से बदलें। 4 घंटे 15 मिनट19 (चित्रा 2डी)के लिए कोई मिलाते हुए कोमल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
नोट: तेजी से झटकों से बचें क्योंकि यह वाहिका को नुकसान पहुंचा सकता है। - स्थानांतरण: वाईएल ट्रिप्सिन समाधान के साथ एक ग्लास ट्रांसफर पिपेट के व्यापक छोर को डुबोएं ताकि रेटिना को 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जा सके जिसमें लिंट-फ्री, डबल-डिस्टिल्ड पानी हो।
- बाहरी परमाणु परत (फोटोरिसेप्टर) (चित्रा 2E) निकालें।
- रेटिना अर्ध-क्षेत्र को नीचे की ओर पलटें। रेटिना को डिश के नीचे धीरे से दबाने के लिए सीधे सिंगल-हेयर ब्रश का उपयोग करें।
- रेटिना के फोटोरिसेप्टर को धीरे से ब्रश करने के लिए लूप ब्रश का उपयोग करें। ब्रश स्ट्रोक ऑप्टिक तंत्रिका से रेटिना की परिधि की ओर एक दिशा में लागू होते हैं। फोटोरिसेप्टर बड़ी चादरों में अलग हो सकते हैं क्योंकि वे रक्त वाहिकाओं द्वारा बाकी रेटिना में लंगर नहीं डालते हैं।
- तंत्रिका ऊतक की चादरों को इकट्ठा करने और त्यागने के लिए 200 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करना।
- कांच को हटा दें।
- रेटिना अर्ध-गोले को पलटें ताकि यह ऊपर की ओर हो। घुमावदार संदंश (ए) की एक जोड़ी का प्रयोग करें एक विदारक खुर्दबीन के तहत जितना संभव हो उतना कांच समझ.
नोट: कांच ऑप्टिक तंत्रिका या रेटिना से जुड़ी पारदर्शी ऊतक की एक शीट की तरह दिखता है। - एक और घुमावदार संदंश (बी) का प्रयोग करें कांच के अंत समझ जहां यह ऑप्टिक तंत्रिका जोड़ता है. संदंश एक संदंश बी से दूर खींच द्वारा कांच निकालें.
- कांच का त्याग करें। कांच के अवशेषों की जांच करें और सभी कांच को हटाने के लिए इस चरण को दोहराएं क्योंकि अवशिष्ट अगले चरणों में बाधा डालेगा।
- रेटिना अर्ध-गोले को पलटें ताकि यह ऊपर की ओर हो। घुमावदार संदंश (ए) की एक जोड़ी का प्रयोग करें एक विदारक खुर्दबीन के तहत जितना संभव हो उतना कांच समझ.
- शेष तंत्रिका और ग्लियाल ऊतक (चित्रा 2F) निकालें।
- रेटिना अर्ध-गोले को पलटें ताकि यह फिर से नीचे की ओर हो। एक बार फिर, डिश के नीचे रेटिना को धीरे से दबाने के लिए सीधे ब्रश का उपयोग करें (बालों की नोक का उपयोग न करें)।
- शेष तंत्रिका ऊतक20 को हटाने के लिए परिधि की ओर ऑप्टिक तंत्रिका सिर से वास्कुलचर पर धीरे ब्रश करने के लिए लूप ब्रश का उपयोग करें।
- सीधे ब्रश के साथ धीरे-धीरे रेटिना स्पिन करें और रेटिना वाहिका पर तंत्रिका ऊतक के सभी छोटे हिस्सों को हटाने के लिए लूप ब्रश का उपयोग करें, जब तक कि संवहनी नेटवर्क अच्छी तरह से साफ न हो जाए(चित्रा 2जी, एच)।
4. एक खुर्दबीन स्लाइड पर पृथक रेटिना vasculature बढ़ते
- एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे एक साफ बढ़ते कैसेट ( सामग्री की तालिकादेखें) रखें। कैसेट को डबल-डिस्टिल्ड वॉटर से भरें।
- प्रबुद्ध पारदर्शी वाहिका को देखने के लिए विपरीत उत्पन्न करने में मदद करने के लिए विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे एक काले रंग की पृष्ठभूमि का उपयोग करें।
- बढ़ते कैसेट के तल में एक साफ, लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड जगह संदंश का प्रयोग करें.
- रेटिना वाहिका स्थानांतरण.
- वाईएल ट्रिप्सिन समाधान के साथ एक ग्लास ट्रांसफर पिपेट के व्यापक छोर को डुबोएं।
- साफ रेटिना vasculature स्थानांतरण और धीरे बढ़ते कैसेट के भीतर और खुर्दबीन स्लाइड के ऊपर डबल आसुत जल में vasculature नाराज.
- रेटिना वाहिका माउंट.
नोट: जबकि वास्कुलचर माइक्रोस्कोप स्लाइड के ऊपर तैर रहा है, पृथक वास्कुलचर अपने सामान्य कटोरे के आकार का अधिग्रहण करेगा।- ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रेटिना अर्द्ध क्षेत्र फ्लिप करने के लिए पाश ब्रश का प्रयोग करें और धीरे कांच स्लाइड पर vasculature नीचे धक्का, और फिर स्लाइड के केंद्र पर खोला vasculature नीचे से निपटने के लिए बालों का उपयोग करें. वास्कुलचर को स्लाइड से चिपकना चाहिए क्योंकि यह छूता है।
- फ्लैट ऑप्टिक तंत्रिका से परिधि के लिए कटोरे के आकार के रेटिना पोत brushing द्वारा vasculature माउंट.
- सभी दिशाओं में ब्रश करना दोहराएं जब तक कि वास्कुलचर पूरी तरह से स्लाइड से चिपक न जाए।
- रेटिना वाहिका को हवा में सुखाएं।
- एक बार जब पूरे रेटिना वास्कुलचर स्लाइड से जुड़ जाता है, तो स्लाइड को पानी से बाहर निकालें या तो धीरे से एक किनारे को उठाकर या धाराओं को कम करने के लिए कैसेट के कोने पर धीरे-धीरे पानी की निकासी करके, फिर इसे बाहर निकालें (चित्र 2I)।
नोट: वास्कुलचर आसानी से दिखाई देने के बाद यह एक बार हवा सूख गया है (चित्रा 2J). - एक मार्कर कलम के साथ स्लाइड के पीछे रेटिना vasculature की परिधि को चिह्नित करें.
- बिना रुके नमूना दाग करने के लिए आगे बढ़ें।
- एक बार जब पूरे रेटिना वास्कुलचर स्लाइड से जुड़ जाता है, तो स्लाइड को पानी से बाहर निकालें या तो धीरे से एक किनारे को उठाकर या धाराओं को कम करने के लिए कैसेट के कोने पर धीरे-धीरे पानी की निकासी करके, फिर इसे बाहर निकालें (चित्र 2I)।
5. ट्यूनल धुंधला होने के साथ मौत का पता लगाना
नोट: इस प्रक्रिया के विवरण के लिए, झेंग एट अल.21 देखें। पृथक रेटिना वाहिकाओं में इस्किमिया +/- बैल तनाव प्रेरित एपोप्टोटिक निकायों की प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 3में दर्शाया गया है।
- पीबीएस के साथ पृथक वास्कुलचर को फिर से हाइड्रेट करें। पीबीएस में इसे 3 बार कुल्ला और फिर अलग वाहिका permeabilize करने के लिए बर्फ पर 2 मिनट के लिए पीबीएस में 1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ सेते हैं.
- अवशिष्ट ट्राइटन X-100 को हटाने के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइड कुल्ला। नमूने के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं।
- नमूने पर ट्यूनल प्रतिक्रिया मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें) के 50 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए एक आर्द्र वातावरण में स्लाइड सेते हैं.
- TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण को हटाने के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड 3 बार कुल्ला. नमूने के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं।
- DAPI के साथ नाभिक को दागने के लिए DAPI माउंटिंग मीडिया की एक बूंद जोड़ें और सैंपल को कवर ग्लास से माउंट करें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: छवियों को कैप्चर करने से पहले प्रोटोकॉल को 1 सप्ताह तक रोका जा सकता है। - एक confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ जिसके परिणामस्वरूप vasculature फोटोग्राफ. ऑप्टिक तंत्रिका (चित्रा 4) के आसपास दूर परिधि में छह से आठ बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों पर कब्जा.
नोट: पृथक रेटिना वाहिकाओं में साइटोकाइन प्रेरित एपोप्टोटिक निकायों की प्रतिनिधि छवियां चित्रा 5 में चित्रित की गई हैं। - परिणामों का विश्लेषण करें।
- पूर्व विवो, टीबीएच-उपचारित नमूनों के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
- छवि J का उपयोग करके प्रत्येक क्षेत्र में एपोप्टोटिक निकायों (TUNEL/DAPI डबल-पॉजिटिव प्रजातियों) की संख्या की गणना करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक ही नमूने के सभी क्षेत्रों में एपोप्टोटिक निकायों का मतलब टैली।
- गैर-डीएम और डीएम नमूनों की बेतरतीब ढंग से चयनित जोड़ी के बीच एपोप्टोटिक निकायों की संख्या में गुना परिवर्तन की गणना करें।
- निर्धारित करें कि दो-पूंछ वाले छात्र टी-टेस्ट18 का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर है या नहीं।
नोट: एक ही अवसर पर नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने (गैर-डीएम और डीएम) को दाग दें क्योंकि ट्यूनल धुंधला होने की सीमा अलग-अलग हो सकती है, भले ही उसी तरह से किया जाए। अप करने के लिए 10 retinas साफ किया जा सकता है और एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा प्रति दिन मुहिम शुरू की जा सकती है, इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले नियंत्रण और प्रयोगात्मक रेटिना की एक समान संख्या को संसाधित करने की योजना.
- विवो में, साइटोकिन्स कॉकटेल ने नमूनों का इलाज किया, निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
- मैन्युअल रूप से पूरे रेटिना वाहिका में एपोप्टोटिक निकायों (ट्यूनल / डीएपी डबल पॉजिटिव प्रजातियों) की संख्या की गणना करें।
- गैर-डीएम और डीएम नमूनों की बेतरतीब ढंग से चयनित जोड़ी के बीच एपोप्टोटिक निकायों की संख्या में गुना परिवर्तन की गणना करें।
- निर्धारित करें कि दो-पूंछ वाले छात्र टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर है या नहीं।
- पूर्व विवो, टीबीएच-उपचारित नमूनों के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
Representative Results
रेटिना vasculature के सफल अलगाव माउस रेटिना vasculature के पूरे नेटवर्क के एक फ्लैट माउंट में परिणाम, वास्तुशिल्प अखंडता बरकरार है (चित्रा 2J) के साथ. आवधिक एसिड-शिफ हेमेटोक्सिलिन (पीएएसएच) के साथ धुंधला होने पर, दो संवहनी सेल प्रकारों को अलग करना संभव है: एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) और पेरिसाइट्स (पीसी) (चित्रा 6)। एंडोथेलियल सेल नाभिक लम्बी, हल्के से दागदार होते हैं, और पूरी तरह से पोत की दीवारों के भीतर रहते हैं। पेरिसाइट नाभिक गोलाकार, घने दाग वाले होते हैं, और केशिका की दीवारों से निकलते हैं। पीएएसएच-दाग वाले नमूने भी अकोशिकीय केशिकाओं को प्रकट करते हैं, जिनमें नाभिक की कमी होती है।
मृत्यु को प्रेरित करने का दृष्टिकोण निम्नलिखित तर्क द्वारा निर्देशित किया गया था। यह अनुमान लगाया गया था कि सुरक्षा सीमित थी, यानी, एक बहुत मजबूत मृत्यु-उत्प्रेरण अपमान से अभिभूत हो सकता है। नतीजतन, अपमान (इस्किमिया / ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स18 दोनों) को अनुकूलित किया गया था ताकि वे आसानी से पता लगाने योग्य वृद्धि को प्रेरित कर सकें लेकिन फिर भी मृत्यु की सबमैक्सिमल सीमा (चित्रा 3 और चित्रा 5)।
यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि ट्यूनेल-पॉजिटिव नाभिक की उपस्थिति कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करने के लिए नियोजित विशिष्ट प्रकार के अपमान पर आकस्मिक थी। इस्किमिया/ऑक्सीडेटिव तनाव अपमान ने सेल एपोप्टोसिस के ट्राम-ट्रैक पैटर्न का नेतृत्व किया, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, जबकि साइटोकिन अपमान के परिणामस्वरूप एक अलग और अच्छी तरह से परिभाषित पैटर्न हुआ, जैसा कि चित्र 5में दर्शाया गया है। दोनों पैटर्न डीआर रोगियों22 से रेटिना वाहिकाओं में मनाया जा सकता है, सुझाव है कि एजेंटों के दोनों प्रकार मनुष्यों में कोशिका मृत्यु प्रेरित. इसके अलावा, मनाया गया रूपात्मक भेद मूल्यांकन करने का एक साधन प्रदान करता है कि क्या पैथोलॉजी ऑक्सीडेटिव तनाव या साइटोकिन्स द्वारा संचालित थी।
चित्रा 1: माउस रेटिना वाहिका को अलग करने के लिए उपकरण। बाएं से दाएं: बढ़ते कैसेट, दो एकल बाल ब्रश, एक उलटा स्थानांतरण pipet, सूक्ष्म spatula, दो घुमावदार संदंश, वसंत कैंची, सूक्ष्म चाकू, और सीधे सुझावों के साथ संदंश. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: योजनाबद्ध एक मौत उत्प्रेरण अपमान देने के महत्वपूर्ण कदम दिखा रहा है और फिर एक माउस आंख से रेटिना vasculature को अलग करना। (ए) इस्किमिया/ऑक्सीडेटिव चोट का प्रेरण, पूर्व विवो। संलयन के बाद, नेत्रगोलक को टीबीएच की उपस्थिति में इस्किमिया के अधीन किया जाता है। (बी) साइटोकिन्स के विवो प्रशासन (इंट्राविट्रियल इंजेक्शन) में। (C) नेत्रगोलक को दो हिस्सों में काटना। (डी) रेटिना एंजाइमिक पाचन: श्वेतपटल को हटाने और रात भर डबल-आसुत जल में रेटिना को धोना। एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में 4 घंटे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में सेते हैं. (ई) फोटोरिसेप्टर को हटाना। (एफ) शेष तंत्रिका और ग्लियल ऊतक को हटाना। (जी) साफ कटोरे के आकार का संवहनी नेटवर्क ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है। (एच)एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर एक काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ एक 35 मिमी पकवान में पृथक संवहनी नेटवर्क। (I) एक स्लाइड पर फ्लैट-माउंटेड रेटिना वास्कुलचर। (जे) एक स्लाइड पर हवा में सुखाया रेटिना vasculature यह आंकड़ा ली एट अल.18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: माउस रेटिना वाहिकाओं के भीतर एपोप्टोटिक निकायों का पता लगाना इस्किमिया +/- टीबीएच के साथ पूर्व विवो का इलाज किया। "पृथक रेटिना वाहिकाओं में इस्किमिया +/- बैल तनाव-प्रेरित एपोप्टोटिक निकायों की प्रतिनिधि छवियां"। प्रत्येक स्तंभ का शीर्षक धुंधला इंगित करता है। (ए-सी) रेटिना वाहिकाओं नेत्रगोलक से अलग है कि अकेले ischemia के 1 घंटे से गुजरे. (डीएफ) (एसी) के समान, 1 घंटे अपमान को छोड़कर इस्किमिया और ऑक्सीडेटिव तनाव (5 मिमी टीबीएच) का संयोजन था। लाल तीर प्रतिनिधि ट्यूनल / (जी-I) DNase के साथ इलाज किया गया सकारात्मक नियंत्रण। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा ली एट अल.18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: परिणामों की मात्रा का ठहराव के लिए क्षेत्र चयन का चित्रण। TUNEL और DAPI सिग्नल के मर्ज के साथ रेटिना वास्कुलचर का 5 x 5 टाइल स्कैन। ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास की परिधि में छह से आठ क्षेत्रों का चयन लाल वर्गों के साथ दिखाया गया है। आवर्धन, 200x। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: साइटोकिन्स (विवो प्रशासन में) के इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के जवाब में माउस रेटिना वाहिकाओं के भीतर एपोप्टोटिक निकायों का पता लगाना। पृथक रेटिना वाहिकाओं में साइटोकिन प्रेरित एपोप्टोटिक निकायों की प्रतिनिधि छवियां। प्रत्येक स्तंभ का शीर्षक धुंधला इंगित करता है। (ए-सी) चूहों intravitreally पीबीएस के साथ इंजेक्शन से अलग रेटिना वाहिकाओं की छवियों. (डीएफ) (एसी) के समान, एक साइटोकिन कॉकटेल को छोड़कर पीबीएस के साथ इंजेक्शन लगाया गया था। लाल तीर प्रतिनिधि ट्यूनल-पॉजिटिव प्रजातियों की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा ली एट अल.18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: एक पाश दाग रेटिना वाहिकाओं की एक प्रतिनिधि छवि। एक माउस के रेटिना जहाजों है कि एसटीजेड प्रेरित डीएम के 20 सप्ताह का अनुभव चित्रा 2 में वर्णित के रूप में अलग कर रहे थे, PASH के साथ दाग, और दृश्य प्रकाश के साथ प्रकाशित जबकि imaged. केशिकाओं में पेरिसाइट नाभिक अधिक गोलाकार और घने दाग (नीले तीर) होते हैं, जबकि लम्बी और कम घनी दाग वाले नाभिक एंडोथेलियल कोशिकाओं (लाल तीर) का निदान करते हैं। पीला तीर एक अकोशिकीय केशिका की ओर इशारा करता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस अध्ययन में, डीएम / डीआर से संबंधित अपमान जैसे इस्किमिया / ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स द्वारा प्रेरित मृत्यु के लिए रेटिना वास्कुलचर के प्रतिरोध / भेद्यता का पता लगाने के लिए एक परख स्थापित की गई थी। इस पांडुलिपि कई प्रकाशित प्रोटोकॉल 19,20,21 का एक संशोधन है जो इस परख, का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है.
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। सबसे पहले, रेटिना को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करना अनिवार्य है, संवहनी नेटवर्क के संरक्षण को सुनिश्चित करना और पर्याप्त आँसू को रोकना। यह एक चीरा बनाने के द्वारा पूरा किया जा सकता है 2-3 लिंबस करने के लिए मिमी पीछे रेटिना कसकर ओरा सेराटा का पालन करता है, और यह अलग चुनौतीपूर्ण है. दूसरा, पूरी प्रक्रिया में वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में इन उपकरणों को डुबोकर ट्रिप्सिन के साथ जहाजों (जैसे, सिंगल-हेयर ब्रश, ट्रांसफिंग पिपेट और संदंश) के संपर्क में आने वाले सभी उपकरणों को कोट करें। यह इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों का पालन करने से वास्कुलचर को रोकता है। तीसरा, क्योंकि माइक्रोवैस्कुलचर सामान्य प्रकाश के तहत लगभग अदृश्य है, आकस्मिक नुकसान को रोकने के लिए मलबे की आकांक्षा और माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरण के दौरान बढ़ी हुई सतर्कता की आवश्यकता होती है।
रेटिना की विभिन्न परतों के एंजाइमेटिक पाचन की एक उपयुक्त डिग्री महत्वपूर्ण है; अपर्याप्त पाचन संवहनी नेटवर्क से न्यूरोनल ऊतक को अलग करने से रोकता है, जबकि अत्यधिक पाचन संवहनी जाल को भंग कर देता है। 1 घंटे19 से रात भर 23 तक के विभिन्न पाचन समय की सूचना दी गई है। टिप्पणियों के आधार पर, 4 घंटे और 15 मिनट का पाचन समय 2 घंटे, 3 घंटे और 4 घंटे की अवधि की तुलना में सबसे अनुकूल परिणाम देता है। इस बिंदु से परे पाचन को लम्बा करना प्रक्रिया को बढ़ाने की संभावना नहीं है और इसके बजाय वाहिका की अखंडता से समझौता कर सकता है।
ऐसे मामलों में जहां पचाने वाला रेटिना सिंगल-हेयर ब्रश का पालन करता है, बालों को वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में कई बार डुबोएं। यह ब्रश के चिपचिपे क्षेत्रों को कम करता है। यदि हेयरब्रश अभी भी संवहनी ऊतक का पालन करता है, तो कांच के अवशिष्ट टुकड़ों के लिए इसका निरीक्षण करें, और उन्हें संदंश के साथ हटा दें।
पूर्ण कांच के हटाने के लिए इष्टतम क्षण फोटोरिसेप्टर को खत्म करने के बाद है, लेकिन शेष तंत्रिका और ग्लियल ऊतक को हटाने से पहले। फोटोरिसेप्टर हटाए जाने तक रेटिना कठोरता बनाए रखता है। इस स्तर पर कांच का निष्कर्षण संभावित रूप से रेटिना/वाहिका को फाड़ सकता है। अवशिष्ट तंत्रिका और ग्लियल ऊतक की नाजुक परतें संवहनी संरचना के घुमावदार रूप को संरक्षित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। वे रेटिना को उसके केंद्र में फाड़ने से रोकते हैं जब विट्रियस ऑप्टिक तंत्रिका से अलग हो जाता है।
यदि पृथक वास्कुलचर माइक्रोस्कोप स्लाइड का बिल्कुल भी पालन नहीं करता है, तो यह इंगित करता है कि स्लाइड का वह भाग जहां आसंजन होने की उम्मीद है, गंदा है। एक चिपचिपा स्थान का पता लगाने के लिए स्लाइड की सतह पर जहाजों को स्थानांतरित करने का प्रयास करें, एक अलग स्लाइड पर स्विच करें या स्लाइड को सावधानीपूर्वक साफ करें और फिर से प्रयास करें। यदि बर्तन अपने कटोरे जैसी आकृति में फहराने से पहले स्लाइड से चिपक जाते हैं, तो स्लाइड से वास्कुलचर को उठाएं ताकि यह एक बार फिर पानी में स्वतंत्र रूप से तैर सके। इस चरण को संदंश के साथ करें जिसे बार-बार वाईएल ट्रिप्सिन समाधान में डुबोया गया है।
वास्कुलचर को अलग करने के लिए कई वैकल्पिक तकनीकों की सूचना दी गई है, जो यहां वर्णित सुरक्षा परख के लिए उपयुक्त नहीं होगी। उदाहरण के लिए, आसमाटिक lysis ऊतक24,25 की जैव रासायनिक जांच की सुविधा, unfixed रेटिना नमूनों से vasculature को अलग करने के लिए नियोजित किया गया है. हालांकि, यह प्रक्रिया वास्कुलचर की शारीरिक रचना के साथ-साथ इस लेख में नियोजित दृष्टिकोण को संरक्षित नहीं कर सकती है। इसी तरह, जबकि माइक्रोवैस्कुलचर के बड़े खंडों को अलग करने के लिए ऊतक प्रिंट विधि वाहिका के इलेक्ट्रोटोनिक वास्तुकला26 के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, पूरे संवहनी बिस्तर को आमतौर पर पुनर्प्राप्त नहीं किया जाता है।
यह परख विकसित की गई थी क्योंकि केशिका अध: पतन की निगरानी के लिए मौजूदा दृष्टिकोण सुरक्षा के मुद्दे को संबोधित नहीं करते हैं। केशिका अध: पतन, जो लंबे समय तक डीएम के बाद होता है, इंगित करता है कि क्या डीआर विकसित हुआ है। डीआर का निदान करने के अलावा, यह परिणाम यह आकलन करने के लिए उपयोगी है कि क्या कोई एजेंट / हालांकि, मौजूदा केशिका अध: पतन परख एजेंट की कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्र से बात नहीं करते हैं। ऐसा एजेंट रोग संबंधी घटनाओं को रोक सकता है जो डीआर को बढ़ाते हैं जैसे कि ऑक्सीडेटिव तनाव या साइटोकिन्स। वैकल्पिक रूप से, एजेंट ऑक्सीडेटिव तनाव और साइटोकिन्स के प्रति लचीलापन बढ़ाकर सुरक्षा लागू कर सकता है और/या क्षति की मरम्मत को बढ़ावा दे सकता है। इस नई सुरक्षा परख का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि किसी दिए गए चिकित्सा के लाभकारी प्रभाव में अंतर्जात प्रणाली को लागू करना शामिल है जो डीएम से संबंधित मौत से बचाता है।
इस सुरक्षा परख का एक दोष यह है कि यह रेटिना वाहिकाओं के भीतर दो सेल प्रकारों को अलग नहीं करता है: एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) और पेरिसाइट्स (पीसी)। जबकि पीएएसएच-दाग वाले वर्गों में उनके नाभिक की उपस्थिति सेल-प्रकार विशिष्ट (चित्रा 6) है, प्रत्येक नाभिक नैदानिक विशेषताओं को प्रदर्शित नहीं करता है। नाभिक के लगभग 30% को कम से कम भाग में ईसी या पीसी के रूप में स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं किया जा सकता है क्योंकि पीएएसएच-दाग वाले नमूनों से प्राप्त द्वि-आयामी छवियां संवहनी जाल की त्रि-आयामी संरचना को अपूर्ण रूप से हल करती हैं। इस बाधा को अतिरिक्त विश्लेषण द्वारा पार किया जा सकता है जैसे कि सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना। ऐसी छवियां, जो दो सेल प्रकारों को अलग करती हैं, प्रत्येक संवहनी कोशिका प्रकारों के प्रतिरोध / भेद्यता को निर्धारित करने के लिए ट्यूनल के साथ सह-दाग हो सकती हैं।
यह संवहनी-केंद्रित परख तंत्रिका रेटिना के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है। ऐसी जानकारी प्रदान करने के लिए अतिरिक्त परख विकसित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, रेटिना वाहिका को अलग करने के बजाय, पूरे रेटिना का एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न किया जा सकता है और फिर प्रतिरोध / भेद्यता के लिए (फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा) विश्लेषण किया जा सकता है। कोशिका मृत्यु के संकेतकों के साथ सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों (तंत्रिका और संवहनी दोनों) को शामिल करने से रेटिना सेल प्रकारों की एक और पूरी तस्वीर प्रदान की जाएगी जिसमें डीएम / डीआर-मध्यस्थता वाली मौत से सुरक्षा की क्षमता है।
अंत में, यहां वर्णित सुरक्षा परख डीएम की शुरुआत और चूहों में डीआर की अभिव्यक्ति के बीच देरी के लिए जिम्मेदार तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Disclosures
लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को इलिनोइस सोसाइटी टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (EY031350 और EY001792) से अनुदान और रिसर्च टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस फाउंडेशन से एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
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