Summary
En beskyttelsesanalyse ble utviklet for å overvåke retinal vaskulaturens motstandskraft mot død fra diabetes / diabetisk retinopati-relaterte fornærmelser som oksidativt stress og cytokiner.
Abstract
Diabetisk retinopati (DR) er en kompleks og progressiv okulær sykdom preget av to forskjellige faser i patogenesen. Den første fasen innebærer tap av beskyttelse mot diabetes-indusert skade på netthinnen, mens den andre fasen sentrerer seg om akkumulering av denne skaden. Tradisjonelle analyser fokuserer primært på å evaluere kapillær degenerasjon, noe som indikerer alvorlighetsgraden av skade, og adresserer i hovedsak den andre fasen av DR. Imidlertid gir de bare indirekte innsikt i om beskyttelsesmekanismene til retinal vaskulaturen har blitt kompromittert. For å løse denne begrensningen ble det utviklet en ny tilnærming for å direkte vurdere netthinnens beskyttelsesmekanismer - spesielt dens motstandskraft mot diabetesinduserte fornærmelser som oksidativt stress og cytokiner. Denne beskyttelsesanalysen, selv om den opprinnelig ble designet for diabetisk retinopati, har potensial for bredere applikasjoner i både fysiologiske og patologiske sammenhenger. Oppsummert innebærer forståelse av patogenesen av diabetisk retinopati å gjenkjenne de to fasene av beskyttelsestap og skadeakkumulering, med denne innovative beskyttelsesanalysen som tilbyr et verdifullt verktøy for forskning og potensielt strekker seg til andre medisinske tilstander.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) er en av de mikrovaskulære komplikasjonene av diabetes mellitus (DM), og den ledende årsaken til blindhet hos personer i arbeidsfør alder i utviklede land1. Viktige risikofaktorer for diabetisk retinopati er varigheten og graden av hyperglykemi 2,3,4. Mens DM forårsaker dysfunksjon av både vaskulære og nevrale komponenter i netthinnen5, er diagnosen DR basert på morfologiske trekk ved retinal vaskulatur6.
Hyperglykemi-indusert oksidativt stress er en av driverne for DR-patogenese7. Økt oksidativt stress forårsaker utbredt skade, noe som kompromitterer funksjonaliteten til mitokondriene og derved øker nivået av reaktive oksygenarter ytterligere. Disse hendelsene er ledsaget av lekkasje av retinalkar, en økning i nivået av inflammatoriske cytokiner og død av både nevrale og vaskulære celletyper i netthinnen. Tap av vaskulære celler, og dermed funksjonaliteten til det omfattende kapillære nettverket av netthinnen, resulterer i hypoksi, en kraftig stimulans for en rekke responser5. Slike responser inkluderer økt ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) som driver både permeabilitet og angiogenese, kardinaltrekk ved de avanserte, synstruende stadiene av DR-diabetisk makulært ødem og proliferativ diabetisk retinopati6.
Visse trekk ved DR antyder at en organisme (både pasienter og forsøksdyr) har en egen evne til å motstå denne indikasjonen. Pasienter opplever flere tiår med DM før de utvikler synstruende DR 8,9,10,11,12,13. Mens gnagermodeller av DM ikke utvikler de avanserte, synstruende stadiene av DR14, gjør den initiale/milde formen av DR som manifesterer det først etter en periode på uker eller måneder med DM15,16. Videre, hos både pasienter og forsøksdyr, er DR progressiv, og retinal dysfunksjon / skade øker etter hvert som varigheten av DM forlenges. Endelig utvikler noen pasienter med DM aldri DR. I visse tilfeller skyldes dette at slike personer ikke opplever diabetes lenge nok til at DR kan utvikle seg. I andre tilfeller er det fordi de viser ekstraordinær motstand mot DR; som tilfellet er med deltakere i Medaliststudien, som ikke utvikler DR etter 50 eller flere år med DM17. Til tross for en slik overbevisende støtte for eksistensen av beskyttelse mot DR og dens enorme translasjonsrelevans, har mekanismen som ligger til grunn for beskyttelse ikke blitt aggressivt undersøkt.
Beskyttelsesanalysen beskrevet her ble utviklet for å lette undersøkelsen av hvorfor DR er forsinket fra begynnelsen av DM hos diabetiske mus. De viktigste trinnene i denne analysen, brukt på DM og ikke-DM-mus, inkluderer (1) å levere en submaksimal dødsfremkallende fornærmelse mot øyet (ex vivo eller in vivo), (2) isolere retinalvaskulaturen, (3) farge vaskulaturen med TUNEL og DAPI, (4) fotografere de resulterende bildene og kvantifisere prosentandelen av TUNEL / DAPI dobbeltpositive arter.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Office of Animal Care and Institutional Biosafety ved University of Illinois i Chicago. Syv uker gamle mannlige C57 / BL6 / J-mus ble plassert i gruppebur i et patogenfritt miljø på en 12 h-lys / mørk syklus og ga gratis tilgang til mat og vann. Mus ble avlivet ved CO2 -kvelning, og øynene ble enukleert og behandlet umiddelbart18. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). De essensielle verktøyene som trengs for studien er vist i figur 1.
1. Levering av den dødsfremkallende fornærmelsen
- Utfør oksidativt stress med TBH (ex vivo).
- Avlive musene etter institusjonelt godkjente protokoller og enucleate deres øyne18 (figur 2A).
- Sett øyebollene direkte i individuelle brønner i en 24-brønnsplate som inneholder DMEM + 1% BSA, med eller uten 5 mM Tert-butylhydroperoksid (TBH) (se materialtabell); ruge i 1 time ved 37 °C. En positiv kontrollprøve behandles med DNase (50 U/100 μL) i 10 minutter for å fragmentere DNA.
MERK: Dosen av TBH (midlet som induserer oksidativt stress) ble valgt for å indusere et lett detekterbart og submaksimalt nivå av celledød i de isolerte retinalkarene18. - Fest øynene i 10% bufret formalin over natten (minimum 16 timer).
- Bruk cytokincocktail for å indusere betennelse (in vivo).
- Bedøv musene med en intraperitoneal injeksjon av ketamin på 100 mg/kg og 5 mg/kg xylazin.
- Bruk en tilpasset 33 G kanyle (se materialfortegnelse) til å injisere 1 μL/øye av cytokincocktailen i glasslegemet. injeksjonsstedet er 2-3 mm fra limbus (figur 2B).
MERK: Cytokincocktailen inneholder forholdet 1:1:1 på 1 μg/ml TNF-α, 1 μg/ml IL-1β og 1500 U/μL IFN-γ18 (se materialfortegnelsen). - 24 timer etter injeksjonen, avlive musene (etter institusjonelt godkjente protokoller), enucleate øynene og fikse med 10% bufret formalin over natten.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause etter fiksering i maksimalt 1 uke og deretter startes på nytt senere.
2. Retina isolasjon
- Skjær opp øyebollet.
- Bruk rett tang for å ta forsiktig tak i synsnerven (figur 2C). Hold en mikrokniv med den andre hånden for å lage et snitt på 2-3 mm bakre til limbus.
- Bytt fra mikrokniven til mikrosaks for å kutte parallelt med limbus mens du roterer øyebollet sammen med optisk nerve til øyebollet er kuttet i to halvdeler.
- Kast den fremre halvdelen av øyet, inkludert linsen (figur 2C).
- Fjern sclera.
- Bruk rett tang til å forsiktig løfte sklera 1-3 mm av netthinnen.
- Bruk mikrosaks til å lage to radiale kutt i scleraen en del av veien til optisk nerve. Unngå å kutte den underliggende netthinnen.
- Bruk et par buede tang for å ta tak i sklerklaffen og rive den av netthinnen. RPE-laget vil komme av med sclera.
- Vask netthinnen.
- Bruk en mikrospatel for å overføre den isolerte netthinnen til en brønn i en 24-brønns tallerken som er fylt med dobbeltdestillert vann.
- Rist fatet forsiktig ved middels moderat hastighet ved romtemperatur. Bytt vann hvert 30. minutt til 1 time, minst 4-5 ganger, og la det stå over natten.
3. Retinal vaskulatur isolasjon
- Fordøyelse: Bytt ut dobbeltdestillert vann med 800 μL YL-trypsinløsning (3% trypsin i 0,1 M Tris-buffer (pH 7,8)). Inkuber ved 37 °C med lett til ingen risting i 4 t 15 min19 (figur 2D).
MERK: Unngå rask risting, da dette kan skade vaskulaturen. - Overføring: Dypp den brede enden av en glassoverføringspipett med YL-trypsinløsning for å overføre netthinnen til en 35 mm petriskål som inneholder lofritt, dobbeltdestillert vann.
- Fjern det ytre kjernefysiske laget (fotoreseptorer) (figur 2E).
- Vend netthinnen halvkule nedovervendt. Bruk den rette enhårsbørsten til å trykke netthinnen forsiktig til bunnen av fatet.
- Bruk løkkebørsten til å forsiktig børste bort fotoreseptorene i netthinnen. Penselstrøkene påføres i en retning fra synsnerven mot periferien av netthinnen. Fotoreseptorene kan løsne i store ark fordi de ikke er forankret til resten av netthinnen av blodkar.
- Ved hjelp av en 200 μL pipette for å samle og kaste arkene av nevrale vev.
- Fjern glasslegemet.
- Vend retina-halvkulen slik at den vender oppover. Bruk en par buede tang (A) for å gripe glasslegemet så mye som mulig under et dissekerende mikroskop.
MERK: Glasslegemet ser ut som et ark med gjennomsiktig vev festet til optisk nerve eller netthinnen. - Bruk en annen buet tang (B) for å gripe enden av glasslegemet der den forbinder optisk nerve. Fjern glasslegemet ved å trekke tang A bort fra tang B.
- Kast glasslegemet. Undersøk resten av glasslegemet og gjenta dette trinnet for å fjerne alt glasslegemet, da resten vil hindre de neste trinnene.
- Vend retina-halvkulen slik at den vender oppover. Bruk en par buede tang (A) for å gripe glasslegemet så mye som mulig under et dissekerende mikroskop.
- Fjern gjenværende nerve- og glialvev (figur 2F).
- Vend retina-halvkulen slik at den vender nedover igjen. Igjen, bruk den rette børsten til å trykke netthinnen forsiktig til bunnen av fatet (ikke bruk tuppen av håret).
- Bruk løkkebørsten til å forsiktig børste over vaskulaturen fra synsnervehodet mot periferien for å fjerne det gjenværende nevrale vevet20.
- Spinn netthinnen sakte med den rette børsten og bruk løkkebørsten til å fjerne alle de små bitene av nevralvev på retinal vaskulaturen, til det vaskulære nettverket er godt rengjort (figur 2G,H).
4. Montering av den isolerte retinale vaskulaturen på et mikroskopglass
- Plasser et lysbilde i mikroskop.
- Plasser en ren monteringskassett (se materialfortegnelse) under et dissekerende mikroskop. Fyll kassetten med dobbeltdestillert vann.
- Bruk en svart bakgrunn under dissekeringsmikroskopet for å generere kontrast for å se den opplyste gjennomsiktige vaskulaturen.
- Bruk tang til å plassere et rent, merket mikroskopskyv inn i bunnen av monteringskassetten.
- Overfør retinal vaskulaturen.
- Dypp den brede enden av en glassoverføringspipett med YL-trypsinløsning.
- Overfør den rensede retinale vaskulaturen og løsne vaskulaturen forsiktig i det dobbeltdestillerte vannet i monteringskassetten og over mikroskoplysbildet.
- Monter retinal vaskulaturen.
MERK: Mens vaskulaturen svever over mikroskoplysbildet, vil den isolerte vaskulaturen få sin normale bolleform.- Bruk løkkebørsten til å snu retina-halvkulen vendt oppover og skyv vaskulaturen forsiktig ned på glasslysbildet, og bruk deretter håret til å feste ned den åpnede vaskulaturen på midten av lysbildet. Vaskulaturen skal feste seg til lysbildet når den berører.
- Flatmonter vaskulaturen ved å børste det bolleformede retinalkaret fra optisk nerve til periferien.
- Gjenta børstingen i alle retninger til vaskulaturen fester seg helt til lysbildet.
- Lufttørk retinal vaskulaturen.
- Når hele retinalvaskulaturen festes til lysbildet, tar du lysbildet ut av vannet enten ved å løfte forsiktig den ene kanten eller ved å tømme vann sakte i hjørnet av kassetten for å minimere strømmer, og deretter trekke den ut (figur 2I).
MERK: Vaskulaturen vil bli lett synlig når den en gang har lufttørket (figur 2J). - Merk omkretsen av retinal vaskulaturen på baksiden av lysbildet med en markørpenn.
- Fortsett å flekke prøven uten pause.
- Når hele retinalvaskulaturen festes til lysbildet, tar du lysbildet ut av vannet enten ved å løfte forsiktig den ene kanten eller ved å tømme vann sakte i hjørnet av kassetten for å minimere strømmer, og deretter trekke den ut (figur 2I).
5. Dødsdeteksjon med TUNEL-farging
MERK: For detaljer om denne prosedyren, se Zheng et al.21. Representative bilder av iskemi +/- oksestressinduserte apoptotiske legemer i isolerte netthinnekar er vist i figur 3.
- Rehydrer den isolerte vaskulaturen med PBS. Skyll det 3 ganger i PBS og inkuber deretter med 1% Triton X-100 i PBS i 2 minutter på is for å permeabilisere den isolerte vaskulaturen.
- Skyll lysbildene to ganger med PBS for å fjerne gjenværende Triton X-100. Tørk området rundt prøven.
- Tilsett 50 mikrol TUNEL reaksjonsblanding (se materialfortegnelse) på prøven. Inkuber lysbildet i en fuktet atmosfære i 60 minutter ved 37 °C i mørket.
- Skyll lysbildet 3 ganger med PBS for å fjerne TUNEL reaksjonsblandingen. Tørk området rundt prøven.
- Legg til en dråpe DAPI-monteringsmedier for å flekke kjernene med DAPI og monter prøven med et dekselglass. Oppbevares ved 4 °C i mørket.
MERK: Protokollen kan settes på pause i opptil 1 uke før du tar bilder. - Fotografer den resulterende vaskulaturen med et konfokal fluorescensmikroskop (se materialfortegnelse). Fang opp seks til åtte tilfeldig utvalgte felt i den ytterste periferien som omgir synsnerven (figur 4).
MERK: Representative bilder av cytokininduserte apoptotiske legemer i isolerte retinale kar er illustrert i figur 5. - Analyser resultatene.
- For ex vivo, TBH-behandlede prøver, utfør følgende trinn.
- Tell antall apoptotiske legemer (TUNEL/DAPI dobbeltpositive arter) i hvert felt ved hjelp av bilde J (se materialfortegnelse). Telle gjennomsnittet av de apoptotiske legemene i alle feltene i en enkelt prøve.
- Beregn foldeendringen i antall apoptotiske legemer mellom et tilfeldig valgt par ikke-DM- og DM-prøver.
- Finn ut om det er en statistisk signifikant forskjell ved bruk av tosidig student t-test18.
MERK: Beis kontroll- og eksperimentprøvene (ikke-DM og DM) ved samme anledning fordi omfanget av TUNEL-farging kan variere, selv når det gjøres på samme måte. Siden opptil 10 netthinner kan rengjøres og monteres per dag av en erfaren bruker, planlegger du å behandle like mange kontroll- og eksperimentelle netthinner før du starter denne protokollen.
- For in vivo, cytokiner cocktailbehandlede prøver, utfør følgende trinn.
- Tell antall apoptotiske legemer (TUNEL/DAPI dobbeltpositive arter) manuelt i hele retinalvaskulaturen.
- Beregn foldeendringen i antall apoptotiske legemer mellom et tilfeldig valgt par ikke-DM- og DM-prøver.
- Finn ut om det er en statistisk signifikant forskjell ved bruk av tosidig student t-test.
- For ex vivo, TBH-behandlede prøver, utfør følgende trinn.
Representative Results
Den vellykkede isoleringen av retinal vaskulatur resulterer i en flat montering av hele nettverket av musens retinale vaskulatur, med den arkitektoniske integriteten intakt (figur 2J). Ved farging med periodisk syre-schiff-hematoksylin (PASH) er det mulig å skille de to vaskulære celletypene: endotelceller (EC) og pericytter (PC) (figur 6). Endotelcellekjernene er langstrakte, lett farget og ligger helt innenfor fartøyets vegger. Pericytkjerner er sirkulære, tett farget og stikker ut fra kapillærveggene. De PASH-fargede prøvene avslører også acellulære kapillærer, som mangler kjerner.
Tilnærmingen til å indusere døden ble styrt av følgende begrunnelse. Det ble spekulert i at beskyttelsen var begrenset, dvs. kunne bli overveldet av en veldig sterk dødsfremkallende fornærmelse. Følgelig ble fornærmelser (både iskemi/oksidativt stress og cytokiner18) optimalisert slik at de ville indusere en lett påviselig økning, men likevel submaksimal grad av død (figur 3 og figur 5).
Det er viktig å fremheve at tilstedeværelsen av TUNEL-positive kjerner var betinget av den spesifikke typen fornærmelse som ble brukt til å utløse celledød. Iskemi/oksidativ stressfornærmelse førte til et spormønster av celleapoptose, som illustrert i figur 3, mens cytokinfornærmelsen resulterte i et tydelig og veldefinert mønster, som vist i figur 5. Begge mønstrene kan observeres i retinalkar fra DR-pasienter22, noe som tyder på at begge typer midler induserer celledød hos mennesker. Videre gir de observerte morfologiske forskjellene et middel til å evaluere om patologi ble drevet av oksidativt stress eller cytokiner.
Figur 1: Verktøy for isolering av netthinnevaskulatur hos mus. Fra venstre til høyre: monteringskassetten, to enkelthårbørster, en omvendt overføringspipet, mikrospatel, to buede tanger, fjærsaks, mikrokniv og tang med rette spisser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk som viser de viktigste trinnene for å levere en dødsfremkallende fornærmelse og deretter isolere retinalvaskulaturen fra et museøye. (A) Induksjon av iskemi/oksidativ skade, ex vivo. Etter enukleasjon blir øyebollet utsatt for iskemi i nærvær av TBH. (B) In vivo administrering (intravitreal injeksjon) av cytokiner. (C) Kutte øyeeplet i to halvdeler. (D) Retinal enzymfordøyelse: fjerne sclera og vaske netthinnen i dobbeltdestillert vann over natten. Inkubering i YL-trypsinløsning ved 37 °C i 4 timer og 15 minutter i en brønn med en 24-brønnsplate. (E) Fjerning av fotoreseptorene. (F) Fjerning av gjenværende nevrale og gliale vev. (G) Rengjort bolleformet vaskulært nettverk vendt oppover. (H) Isolert vaskulært nettverk i en 35 mm tallerken med svart bakgrunn på scenen av et dissekerende mikroskop. (I) Flatmontert retinal vaskulatur på et lysbilde. (J) Lufttørket retinal vaskulatur på et lysbilde. Denne figuren er modifisert fra Li et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påvisning av apoptotiske legemer i netthinnekar behandlet ex vivo med iskemi +/- TBH. Representative bilder av iskemi +/- oksestressinduserte apoptotiske legemer i isolerte netthinnekar. Overskriften på hver kolonne angir fargingen. (AC) Retinalkar isolert fra øyeboller som gjennomgikk 1 time iskemi alene. (VG Nett) Samme som (AC), bortsett fra 1 h fornærmelse var en kombinasjon av iskemi og oksidativt stress (5 mM TBH). De røde pilene peker mot representative TUNEL/DAPI dobbeltpositive arter. (VG Nett) Positiv kontroll behandlet med DNase. Skala bar = 50 μm. Denne figuren er modifisert fra Li et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Illustrasjon av feltvalg for kvantifisering av resultater. En 5 x 5 fliser skanning av retinal vaskulatur med sammenslåing av TUNEL og DAPI signal. Utvalget av seks til åtte felt i den ytterste periferien rundt synsnerven er vist med røde firkanter. Forstørrelse, 200x. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Påvisning av apoptotiske legemer i netthinnekar fra mus som respons på intravitreal injeksjon av cytokiner (in vivo administrering). Representative bilder av cytokininduserte apoptotiske legemer i isolerte retinalkar. Overskriften på hver kolonne angir fargingen. (AC) Bilder av netthinnekarene isolert fra mus injisert med PBS. (VG Nett) Samme som (A-C), bortsett fra at en cytokincocktail ble injisert sammen med PBS. De røde pilene peker mot representative TUNEL-positive arter. Skalastenger = 100 μm. Denne figuren er modifisert fra Li et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Et representativt bilde av et PASH-farget netthinnekar. Netthinnekar fra en mus som opplevde 20 uker med STZ-indusert DM ble isolert som beskrevet i figur 2, farget med PASH og avbildet mens det var opplyst med synlig lys. Pericytkjerner i kapillærer har en tendens til å være mer sirkulære og tettfargede (blå piler), mens langstrakte og mindre tettfargede kjerner er diagnostiske for endotelceller (røde piler). Den gule pilen peker på en acellulær kapillær. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
I denne studien ble det etablert en analyse for å påvise resistens/sårbarhet av retinal vaskulatur til død indusert av DM/DR-relaterte fornærmelser som iskemi/oksidativt stress og cytokiner. Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av denne analysen, som er en modifikasjon av flere publiserte protokoller 19,20,21.
Protokollen omfatter flere avgjørende stadier. For det første er det viktig å omhyggelig dissekere netthinnen, sikre bevaring av det vaskulære nettverket og forhindre betydelige tårer. Dette kan oppnås ved å lage et snitt 2-3 mm bakenfor limbus siden netthinnen tett fester seg til ora serrata, og separasjon er utfordrende. For det andre, belegg alle instrumenter som kommer i kontakt med karene (f.eks. enkelthårbørster, overføringspipett og tang) med trypsin ved å dyppe disse verktøyene i YL-trypsinløsningen gjennom hele prosedyren. Dette forhindrer vaskulaturen i å feste seg til instrumentene som brukes i denne protokollen. For det tredje, fordi mikrovaskulaturen er nesten usynlig under normalt lys, er det nødvendig med økt årvåkenhet under aspirasjon av rusk og overføring til mikroskoplysbildet for å forhindre utilsiktet tap.
En passende grad av enzymatisk fordøyelse av de forskjellige lagene i netthinnen er avgjørende; Utilstrekkelig fordøyelse forhindrer separasjon av nevronvev fra det vaskulære nettverket, mens overdreven fordøyelse løser vaskulær plexus. Ulike fordøyelsestider fra 1 time19 til over natten 23 har blitt rapportert. Basert på observasjoner gir en fordøyelsestid på 4 timer og 15 minutter de gunstigste resultatene sammenlignet med varigheter på 2 timer, 3 timer og 4 timer. Forlengelse av fordøyelsen utover dette punktet er usannsynlig å forbedre prosessen og kan i stedet kompromittere integriteten til vaskulaturen.
I tilfeller der den fordøyede netthinnen fester seg til enkelthårbørsten, dypp håret i YL-trypsinoppløsning flere ganger. Dette reduserer børstens klebrige områder. Hvis hårbørsten fortsatt fester seg til det vaskulære vevet, må du inspisere det for gjenværende fragmenter av glasslegeme, og fjerne dem med tang.
Det optimale øyeblikket for fullstendig fjerning av glasslegemet er etter eliminering av fotoreceptorene, men før fjerning av det gjenværende nevrale og glialvevet. Netthinnen opprettholder stivhet til fotoreceptorer fjernes. Ekstrahering av glasslegemet på dette stadiet kan potensielt rive netthinnen / vaskulaturen. De delikate lagene av gjenværende nevrale og glialvev spiller en sentral rolle i å bevare den buede formen av den vaskulære strukturen. De forhindrer netthinnen i å rive i midten når glasslegemet er løsrevet fra optisk nerve.
Hvis den isolerte vaskulaturen ikke fester seg til mikroskoplysbildet i det hele tatt, indikerer det at delen av lysbildet der adhesjon forventes å forekomme, er skitten. Prøv å flytte fartøyene over lysbildets overflate for å finne et klebrig sted, bytt til et annet lysbilde eller rengjør lysbildet grundig og prøv igjen. Hvis karene fester seg til sklien før de folder seg ut i sin skållignende form, løfter du vaskulaturen fra sklien slik at den kan flyte fritt i vannet igjen. Gjør dette trinnet med tang som gjentatte ganger har blitt dyppet i YL-trypsinløsningen.
Det er rapportert flere alternative teknikker for å isolere vaskulaturen som ikke egner seg for beskyttelsesanalysen beskrevet her. For eksempel har osmotisk lyse blitt brukt til å isolere vaskulaturen fra ufikserte netthinneprøver, noe som letter biokjemiske undersøkelser av vevet24,25. Imidlertid kan denne prosedyren ikke bevare anatomien til vaskulaturen så vel som tilnærmingen som brukes i denne artikkelen. På samme måte, mens vevstrykkmetoden for å isolere store segmenter av mikrovaskulatur muliggjør analyse av vaskulaturens elektrotoniske arkitektur26, blir hele vaskulær seng vanligvis ikke gjenvunnet.
Denne analysen ble utviklet fordi eksisterende tilnærminger for å overvåke kapillær degenerasjon ikke tar opp spørsmålet om beskyttelse. Kapillær degenerasjon, som oppstår etter langvarig DM, indikerer om DR har utviklet seg. I tillegg til å diagnostisere DR, er dette resultatet nyttig for å vurdere om et middel / terapi forhindrer DR. Imidlertid snakker eksisterende kapillære degenerasjonsanalyser ikke med den underliggende virkningsmekanismen til midlet. Et slikt middel kan forhindre patologiske hendelser som driver DR, slik som økt oksidativt stress eller cytokiner. Alternativt kan midlet håndheve beskyttelsen ved å øke motstandsdyktigheten mot oksidativt stress og cytokiner og/eller fremme reparasjon av skade. Denne nye beskyttelsesanalysen kan brukes til å avgjøre om den gunstige effekten av en gitt terapi innebærer å håndheve det endogene systemet som beskytter mot DM-relatert død.
En ulempe med denne beskyttelsesanalysen er at den ikke skiller de to celletypene i retinalkarene: endotelceller (EC) og pericytter (PCer). Mens utseendet til kjernene deres i PASH-fargede seksjoner er celletypespesifikt (figur 6), viser ikke alle kjerner diagnostiske egenskaper. Omtrent 30% av kjernene kan ikke entydig defineres som EC eller PC, i det minste delvis fordi de todimensjonale bildene oppnådd fra PASH-fargede prøver ufullstendig løser den tredimensjonale strukturen til vaskulær plexus. Denne hindringen kan overvinnes ved ytterligere analyse som immunfluorescerende farging med celletypespesifikke markører. Slike bilder, som skiller de to celletypene, kan farges sammen med TUNEL for å bestemme motstanden / sårbarheten til hver av de vaskulære celletypene.
Denne vaskulære fokuserte analysen gir ingen informasjon om nevrale netthinnen. Ytterligere analyser kan utvikles for å gi slik informasjon. For eksempel, i stedet for å isolere retinal vaskulaturen, kan en enkeltcellesuspensjon av hele netthinnen genereres og deretter analyseres (ved fluorescerende aktivert cellesortering) for motstand / sårbarhet. Inkluderingen av celletypespesifikke markører (både nevrale og vaskulære) sammen med indikatorer for celledød vil gi et mer komplett bilde av retinale celletyper som har kapasitet til beskyttelse mot DM / DR-mediert død.
Avslutningsvis gir beskyttelsesanalysen beskrevet her en kraftig tilnærming til å undersøke mekanismen som er ansvarlig for forsinkelsen mellom utbruddet av DM og manifestasjonen av DR hos mus.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 og EY001792) og et ubegrenset tilskudd fra Research to Prevent Blindness Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
- Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21 (2015).
- Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21 (2016).
- Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R.
- Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187 (2018).
- Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
- Aiello, L. P., et al.
- Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
- Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
- Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
- Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
- Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
- Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869 (2023).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489 (2013).
- Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
- Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
- Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
- Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
- Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
