Summary
En skyddsanalys utvecklades för att övervaka näthinnans kärlens motståndskraft mot dödsfall från diabetes/diabetisk retinopati-relaterade förolämpningar som oxidativ stress och cytokiner.
Abstract
Diabetisk retinopati (DR) är en komplex och progressiv ögonsjukdom som kännetecknas av två distinkta faser i patogenesen. Den första fasen innebär förlust av skydd mot diabetesinducerad skada på näthinnan, medan den andra fasen fokuserar på ackumulering av denna skada. Traditionella analyser fokuserar främst på att utvärdera kapillärdegeneration, vilket är en indikation på skadans allvarlighetsgrad, och tar i huvudsak itu med den andra fasen av DR. De ger dock bara indirekt insikter om huruvida skyddsmekanismerna i näthinnans kärl har äventyrats. För att ta itu med denna begränsning utvecklades ett nytt tillvägagångssätt för att direkt bedöma näthinnans skyddsmekanismer - särskilt dess motståndskraft mot diabetesinducerade förolämpningar som oxidativ stress och cytokiner. Denna skyddsanalys, även om den ursprungligen utformades för diabetisk retinopati, har potential för bredare tillämpningar i både fysiologiska och patologiska sammanhang. Sammanfattningsvis, för att förstå patogenesen av diabetisk retinopati innebär det att känna igen de dubbla faserna av skyddsförlust och skadeackumulering, med denna innovativa skyddsanalys som erbjuder ett värdefullt verktyg för forskning och potentiellt sträcker sig till andra medicinska tillstånd.
Introduction
Diabetesretinopati (DR) är en av de mikrovaskulära komplikationerna av diabetes mellitus (DM) och den främsta orsaken till blindhet hos personer i arbetsför ålder i utvecklade länder1. Viktiga riskfaktorer för diabetesretinopati är varaktigheten och graden av hyperglykemi 2,3,4. Medan DM orsakar dysfunktion i både de vaskulära och neurala komponenterna i näthinnan5, är diagnosen DR baserad på morfologiska egenskaper hos näthinnans kärl6.
Hyperglykemi-inducerad oxidativ stress är en av drivkrafterna för DR-patogenes7. Ökad oxidativ stress orsakar omfattande skador, vilket äventyrar mitokondriernas funktionalitet och därmed ytterligare ökar nivån av reaktiva syrearter. Dessa händelser åtföljs av läckage av näthinnekärl, en ökning av nivån av inflammatoriska cytokiner och död av både neurala och vaskulära celltyper i näthinnan. Förlust av kärlceller, och därmed funktionaliteten hos näthinnans omfattande kapillärnätverk, resulterar i hypoxi, en potent stimulans för en mängdolika svar. Sådana svar inkluderar ökat uttryck av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) som driver både permeabilitet och angiogenes, kardinaldrag i de avancerade, synhotande stadierna av DR - diabetiskt makulaödem och proliferativ diabetisk retinopati6.
Vissa egenskaper hos DR tyder på att en organism (både patienter och försöksdjur) har en inneboende förmåga att motstå denna indikation. Patienter upplever flera decennier av DM innan de utvecklar synhotande DR 8,9,10,11,12,13. Även om gnagarmodeller av DM inte utvecklar de avancerade, synhotande stadierna av DR14, gör den initiala/milda formen av DR som manifesterar sig det först efter en period av veckor eller månader med DM15,16. Dessutom, hos både patienter och försöksdjur, är DR progressiv, och retinal dysfunktion/skada ökar när varaktigheten av DM förlängs. Slutligen utvecklar vissa patienter med DM aldrig DR. I vissa fall beror detta på att sådana individer inte upplever diabetes tillräckligt länge för att DR ska utvecklas. I andra fall beror det på att de uppvisar extraordinär motståndskraft mot DR; vilket är fallet med deltagarna i Medalist-studien, som inte utvecklar DR efter 50 eller fler år med DM17. Trots ett sådant övertygande stöd för existensen av skydd mot DR och dess enorma translationella relevans, har mekanismen bakom skyddet inte undersökts aggressivt.
Skyddsanalysen som beskrivs här utvecklades för att underlätta undersökning av varför DR fördröjs från början av DM hos diabetiska möss. De viktigaste stegen i denna analys, som tillämpas på DM- och icke-DM-möss, inkluderar (1) att leverera en submaximal dödsframkallande förolämpning mot ögat (ex vivo eller in vivo), (2) att isolera näthinnans kärl, (3) att färga kärlen med TUNEL och DAPI, (4) att fotografera de resulterande bilderna och kvantifiera procentandelen TUNEL/DAPI dubbelpositiva arter.
Protocol
Alla djurstudier har godkänts av Office of Animal Care and Institutional Biosafety vid University of Illinois i Chicago. Sju veckor gamla C57/BL6/J-möss av hankön placerades i gruppburar i en patogenfri miljö under en 12 timmar lång cykel med ljus/mörker och fick gratis tillgång till mat och vatten. Möss avlivades genom CO2 kvävning, och ögonen enukleerades och behandlades omedelbart18. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning). De viktigaste verktygen som behövs för studien visas i figur 1.
1. Framförande av den dödsframkallande förolämpningen
- Utför oxidativ stress med TBH (ex vivo).
- Avliva mössen enligt institutionellt godkända protokoll och exukleera deras ögon18 (Figur 2A).
- Lägg ögongloberna direkt i enskilda brunnar på en 24-hålsplatta som innehåller DMEM + 1 % BSA, med eller utan 5 mM tert-butylhydroperoxid (TBH) (se materialförteckning); inkubera i 1 timme vid 37 °C. Ett positivt kontrollprov behandlas med DNas (50 U/100 μL) i 10 minuter för att fragmentera DNA.
OBS: Dosen av TBH (medlet som inducerar oxidativ stress) valdes för att inducera en lätt detekterbar och submaximal nivå av celldöd i de isolerade näthinnekärlen18. - Fixera ögonen i 10 % buffrat formalin över natten (minst 16 timmar).
- Använd cytokincocktail för att inducera inflammation (in vivo).
- Bedöva mössen med en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazin.
- Använd en anpassad 33 G nål (se materialtabell) för att injicera 1 μL/öga av cytokincocktailen i glaskroppen; injektionsstället är 2-3 mm från limbus (Figur 2B).
OBS: Cytokincocktailen innehåller förhållandet 1:1:1 1 av 1 μg/ml TNF-α, 1 μg/ml IL-1β och 1500 U/μL IFN-γ18 (se materialförteckning). - 24 timmar efter injektionen, avliva mössen (enligt institutionellt godkända protokoll), enukcleera deras ögon och fixera med 10% buffrat formalin över natten.
OBS: Experimentet kan pausas efter fixering i högst 1 vecka och sedan startas om senare.
2. Isolering av näthinnan
- Klipp upp ögongloben.
- Använd en rak pincett för att försiktigt ta tag i synnerven (Figur 2C). Håll en mikrokniv med den andra handen för att göra ett snitt på 2-3 mm bakom limbus.
- Byt från mikrokniven till mikrosaxen för att klippa parallellt med limbus samtidigt som du roterar ögongloben tillsammans med synnerven tills ögongloben har skurits i två halvor.
- Kassera den främre halvan av ögat, inklusive linsen (Figur 2C).
- Ta bort sklera.
- Använd en rak pincett för att försiktigt lyfta sclera 1-3 mm från näthinnan.
- Använd en mikrosax för att göra två radiella snitt i sclera en del av vägen till synnerven. Undvik att skära av den underliggande näthinnan.
- Använd en böjd pincett för att ta tag i skleralfliken och slita av den från näthinnan. RPE-skiktet kommer att lossna med sklera.
- Tvätta näthinnan.
- Använd en mikrospatel för att överföra den isolerade näthinnan till en brunn i en skål med 24 brunnar som har fyllts med dubbeldestillerat vatten.
- Skaka skålen försiktigt på medelhög till måttlig hastighet i rumstemperatur. Byt vatten var 30:e minut till 1 timme, minst 4-5 gånger, låt sedan stå över natten.
3. Isolering av näthinnekärl
- Uppslutning: Ersätt det dubbeldestillerade vattnet med 800 μl YL-trypsinlösning (3 % trypsin i 0,1 M Tris-buffert (pH 7,8)). Inkubera vid 37 °C med lätt eller ingen skakning i 4 timmar 15 minuter19 (Figur 2D).
OBS: Undvik snabb skakning eftersom det kan skada kärlen. - Transfer: Doppa den breda änden av en glaspipett med YL-trypsinlösning för att överföra näthinnan till en 35 mm petriskål som innehåller luddfritt, dubbeldestillerat vatten.
- Ta bort det yttre kärnskiktet (fotoreceptorer) (figur 2E).
- Vänd näthinnans halvsfär nedåt. Använd den raka borsten för att försiktigt trycka näthinnan mot botten av skålen.
- Använd ögleborsten för att försiktigt borsta bort näthinnans fotoreceptorer. Penseldragen appliceras i en riktning från synnerven mot näthinnans periferi. Fotoreceptorerna kan lossna i stora ark eftersom de inte är förankrade i resten av näthinnan av blodkärl.
- Använd en 200 μL pipett för att samla upp och kassera arken av nervvävnad.
- Ta bort glaskroppen.
- Vänd näthinnans halvsfär så att den är vänd uppåt. Använd en böjd pincett (A) för att greppa glaskroppen så mycket som möjligt under ett dissektionsmikroskop.
OBS: Glaskroppen ser ut som ett ark av genomskinlig vävnad fäst vid synnerven eller näthinnan. - Använd en annan böjd pincett (B) för att ta tag i änden av glaskroppen där den förbinder synnerven. Ta bort glaskroppen genom att dra bort tången A från pincetten B.
- Kassera glaskroppen. Undersök resterna av glaskroppen och upprepa detta steg för att ta bort all glaskropp eftersom resterna kommer att hindra nästa steg.
- Vänd näthinnans halvsfär så att den är vänd uppåt. Använd en böjd pincett (A) för att greppa glaskroppen så mycket som möjligt under ett dissektionsmikroskop.
- Ta bort den återstående nerv- och gliavävnaden (Figur 2F).
- Vänd näthinnans halvsfär så att den är nedåtvänd igen. Återigen, använd den raka borsten för att försiktigt trycka näthinnan till botten av skålen (använd inte hårspetsen).
- Använd ögleborsten för att försiktigt borsta över kärlen från synnervshuvudet mot periferin för att ta bort den återstående nervvävnaden20.
- Snurra näthinnan långsamt med den raka borsten och använd ögleborsten för att ta bort alla små bitar av nervvävnad på näthinnans kärl, tills det vaskulära nätverket är väl rengjort (Figur 2G,H).
4. Montering av den isolerade näthinnevaskulaturen på ett objektglas
- Placera ett objektglas.
- Placera en ren monteringskassett (se materialtabell) under ett dissektionsmikroskop. Fyll kassetten med dubbeldestillerat vatten.
- Använd en svart bakgrund under dissekeringsmikroskopet för att skapa kontrast för att se den upplysta genomskinliga vaskulaturen.
- Använd en pincett för att placera en ren, märkt mikroskopbild i botten av monteringskassetten.
- Överför näthinnans kärl.
- Doppa den breda änden av en glasrörledning med YL-trypsinlösning.
- Överför den rengjorda näthinnevaskulaturen och lossa försiktigt kärlen i det dubbeldestillerade vattnet i monteringskassetten och ovanför mikroskopglaset.
- Montera näthinnans kärl.
OBS: Medan kärlet svävar ovanför mikroskopglaset kommer det isolerade kärlet att få sin normala skålform.- Använd ögleborsten för att vända näthinnans halvsfär uppåt och tryck försiktigt ner kärlet på glasglaset och använd sedan håret för att fästa ner den öppnade kärlen på mitten av glaset. Kärlen ska fastna på objektglaset när det vidrör.
- Montera kärlet platt genom att borsta det skålformade näthinnekärlet från synnerven till periferin.
- Upprepa borstningen i alla riktningar tills kärlen fastnar helt på objektglaset.
- Lufttorka näthinnans kärl.
- När hela näthinnans kärl har fäst vid objektglaset, ta upp objektglaset ur vattnet antingen genom att försiktigt lyfta en kant eller genom att långsamt tömma vatten i hörnet av kassetten för att minimera strömmar och sedan dra ut det (Figur 2I).
OBS: Kärlen kommer att bli lätt synliga när de väl har lufttorkat (Figur 2J). - Markera omkretsen av näthinnans kärl på baksidan av glaset med en tuschpenna.
- Fortsätt att färga provet utan paus.
- När hela näthinnans kärl har fäst vid objektglaset, ta upp objektglaset ur vattnet antingen genom att försiktigt lyfta en kant eller genom att långsamt tömma vatten i hörnet av kassetten för att minimera strömmar och sedan dra ut det (Figur 2I).
5. Dödsdetektering med TUNEL-färgning
OBS: För detaljer om denna procedur, se Zheng et al.21. Representativa bilder av ischemi +/- ox stressinducerade apoptotiska kroppar i isolerade näthinnekärl visas i figur 3.
- Rehydrera den isolerade vaskulaturen med PBS. Skölj den 3 gånger i PBS och inkubera sedan med 1% Triton X-100 i PBS i 2 minuter på is för att permeabilisera den isolerade kärlbildningen.
- Skölj objektglasen två gånger med PBS för att ta bort resterna av Triton X-100. Torka området runt provet.
- Tillsätt 50 μl TUNEL-reaktionsblandning (se materialtabell) till provet. Inkubera objektglaset i en fuktad atmosfär i 60 minuter vid 37 °C i mörker.
- Skölj objektglaset 3 gånger med PBS för att ta bort TUNEL-reaktionsblandningen. Torka området runt provet.
- Tillsätt en droppe DAPI-monteringsmedia för att färga kärnorna med DAPI och montera provet med ett täckglas. Förvaras vid 4 °C i mörker.
OBS: Protokollet kan pausas i upp till 1 vecka innan bilder tas. - Fotografera den resulterande vaskulaturen med ett konfokalt fluorescensmikroskop (se materialförteckning). Fånga sex till åtta slumpmässigt utvalda fält i den bortre periferin som omger synnerven (figur 4).
OBS: Representativa bilder av cytokininducerade apoptotiska kroppar i isolerade näthinnekärl illustreras i figur 5. - Analysera resultaten.
- För ex vivo, TBH-behandlade samples, utför följande steg.
- Räkna antalet apoptotiska kroppar (TUNEL/DAPI dubbelpositiva arter) i varje fält med hjälp av bild J (se materialförteckning). Räkna medelvärdet av de apoptotiska kropparna i alla fält i ett enda prov.
- Beräkna veckförändringen i antalet apoptotiska kroppar mellan ett slumpmässigt valt par av icke-DM- och DM-prover.
- Ta reda på om det finns en statistiskt signifikant skillnad med hjälp av det tvåsidiga t-testet18.
OBS: Färga kontroll- och experimentproverna (icke-DM och DM) vid samma tillfälle eftersom omfattningen av TUNEL-färgning kan variera, även när det görs på samma sätt. Eftersom upp till 10 näthinnor kan rengöras och monteras per dag av en erfaren användare, planera att bearbeta lika många kontroll- och experimentella näthinnor innan du startar detta protokoll.
- För in vivo, cytokincocktailbehandlade prover, utför följande steg.
- Räkna manuellt antalet apoptotiska kroppar (TUNEL/DAPI dubbelpositiva arter) i hela näthinnans kärl.
- Beräkna veckförändringen i antalet apoptotiska kroppar mellan ett slumpmässigt valt par av icke-DM- och DM-prover.
- Ta reda på om det finns en statistiskt signifikant skillnad med hjälp av det tvåsidiga t-testet.
- För ex vivo, TBH-behandlade samples, utför följande steg.
Representative Results
Den framgångsrika isoleringen av näthinnans kärl resulterar i en platt montering av hela nätverket av musens näthinnekärl, med den arkitektoniska integriteten intakt (Figur 2J). Vid färgning med periodisk syra-schiff hematoxylin (PASH) är det möjligt att skilja de två vaskulära celltyperna: endotelceller (EC) och pericyter (PC) (figur 6). Endotelcellkärnorna är långsträckta, lätt färgade och ligger helt inom kärlväggarna. Pericytkärnor är cirkulära, tätt färgade och sticker ut från kapillärväggarna. De PASH-färgade proverna avslöjar också acellulära kapillärer, som saknar kärnor.
Tillvägagångssättet för att framkalla döden vägleddes av följande logik. Det spekulerades i att skyddet var begränsat, det vill säga att det kunde övermannas av en mycket stark dödsframkallande förolämpning. Följaktligen optimerades förolämpningar (både ischemi/oxidativ stress och cytokiner18) så att de skulle inducera en lätt detekterbar ökning men ändå submaximal dödsomfattning (Figur 3 och Figur 5).
Det är viktigt att betona att närvaron av TUNEL-positiva kärnor var beroende av den specifika typ av förolämpning som användes för att utlösa celldöd. Ischemi/oxidativ stress-förolämpningen ledde till ett spårmönster av cellapoptos, som illustreras i figur 3, medan cytokinförolämpningen resulterade i ett distinkt och väldefinierat mönster, som visas i figur 5. Båda mönstren kan observeras i näthinnekärl från DR-patienter22, vilket tyder på att båda typerna av medel inducerar celldöd hos människor. Dessutom erbjuder de observerade morfologiska skillnaderna ett sätt att utvärdera om patologin drevs av oxidativ stress eller cytokiner.
Figur 1: Verktyg för att isolera näthinnevaskulatur hos möss. Från vänster till höger: monteringskassetten, två enhårsborstar, en inverterad överföringspipa, mikrospatel, två böjda pincetter, fjädersax, mikrokniv och pincett med raka spetsar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk bild av de viktigaste stegen för att utdela en dödsframkallande förolämpning och sedan isolera näthinnans kärl från ett musöga. (A) Induktion av ischemi/oxidativ skada, ex vivo. Efter enukleation utsätts ögongloben för ischemi i närvaro av TBH. B) Administrering in vivo (intravitreal injektion) av cytokiner. (C) Skär ögongloben i två halvor. (D) Enzymisk nedbrytning av näthinnan: avlägsnande av sclera och tvättning av näthinnan i dubbeldestillerat vatten över natten. Inkubation i YL-trypsinlösning vid 37 °C i 4 timmar och 15 minuter i en brunn med 24 brunnar. (E) Avlägsnande av fotoreceptorerna. (F) Avlägsnande av återstående nerv- och gliavävnad. (G) Rengjort skålformat kärlnätverk vänt uppåt. (H) Isolerat kärlnätverk i en 35 mm skål med svart bakgrund på scenen i ett dissekerande mikroskop. (I) Platt monterad retinal vaskulatur på ett objektglas. (J) Lufttorkad näthinnevaskulatur på objektglas. Denna siffra har modifierats från Li et al.18. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Detektion av apoptotiska kroppar i retinala kärl hos möss som behandlats ex vivo med ischemi +/- TBH. Representativa bilder av ischemi +/- ox stressinducerade apoptotiska kroppar i isolerade näthinnekärl. Rubriken på varje kolumn anger färgningen. (A-C) Retinala kärl isolerade från ögonglober som genomgick 1 h ischemi ensam. (D-F) Samma som (A-C), förutom att 1 timmes förolämpning var en kombination av ischemi och oxidativ stress (5 mM TBH). De röda pilarna pekar på representativa dubbelpositiva TUNEL/DAPI-arter. (G-I) Positiv kontroll behandlad med DNase. Skalstapel = 50 μm. Denna siffra har modifierats från Li et al.18. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Illustration av fältval för kvantifiering av resultat. En 5 x 5 bricka skanning av näthinnans kärl med sammanslagning av TUNEL och DAPI-signal. Urvalet av sex till åtta fält i den avlägsna periferin som omger synnerven visas med röda fyrkanter. Förstoring, 200x. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Detektion av de apoptotiska kropparna i retinala kärl hos möss som svar på intravitreal injektion av cytokiner (in vivo-administrering). Representativa bilder av cytokininducerade apoptotiska kroppar i isolerade näthinnekärl. Rubriken på varje kolumn anger färgningen. (A-C) Bilder av näthinnekärlen isolerade från möss intravitrealistiskt injicerade med PBS. (D-F) Samma som (AC), förutom att en cytokincocktail injicerades tillsammans med PBS. De röda pilarna pekar på representativa TUNEL-positiva arter. Skalstreck = 100 μm. Denna siffra har modifierats från Li et al.18. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: En representativ bild av ett PASH-färgat näthinnekärl. Retinala kärl från en mus som upplevde 20 veckors STZ-inducerad DM isolerades enligt beskrivningen i figur 2, färgades med PERSH och avbildades medan de belystes med synligt ljus. Pericytkärnor i kapillärer tenderar att vara mer cirkulära och tätt färgade (blå pilar), medan långsträckta och mindre tätt färgade kärnor är diagnostiska för endotelceller (röda pilar). Den gula pilen pekar på en acellulär kapillär. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
I denna studie etablerades en analys för att detektera resistens/sårbarhet hos näthinnans kärl för död inducerad av DM/DR-relaterade förolämpningar såsom ischemi/oxidativ stress och cytokiner. Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av denna analys, som är en modifiering av flera publicerade protokoll 19,20,21.
Protokollet omfattar flera avgörande steg. För det första är det absolut nödvändigt att noggrant dissekera näthinnan, vilket säkerställer att det vaskulära nätverket bevaras och förhindrar betydande revor. Detta kan åstadkommas genom att göra ett snitt 2-3 mm bakom limbus eftersom näthinnan fäster tätt vid ora serrata, och att separera den är utmanande. För det andra, belägg alla instrument som kommer i kontakt med kärlen (t.ex. enhårsborstar, överföringspipett och pincett) med trypsin genom att doppa dessa verktyg i YL-trypsinlösningen under hela proceduren. Detta förhindrar att kärlen fäster vid de instrument som används i detta protokoll. För det tredje, eftersom mikrokärlen är nästan osynliga under normalt ljus, krävs ökad vaksamhet under aspiration av skräp och överföring till objektglaset för att förhindra oavsiktlig förlust.
En lämplig grad av enzymatisk nedbrytning av de olika lagren i näthinnan är avgörande; Otillräcklig matsmältning förhindrar separation av neuronal vävnad från kärlnätverket, medan överdriven matsmältning löser upp vaskulär plexus. Olika matsmältningstider från 1 timme19 till 23 timmar över natten har rapporterats. Baserat på observationer ger en matsmältningstid på 4 timmar och 15 minuter de mest gynnsamma resultaten jämfört med varaktigheter på 2 timmar, 3 timmar och 4 timmar. Att förlänga matsmältningen bortom denna punkt kommer sannolikt inte att förbättra processen och kan istället äventyra kärlens integritet.
I de fall där den smälta näthinnan fäster vid enhårsborsten, doppa håret i YL-trypsinlösning flera gånger. Detta minskar borstens klibbiga områden. Om hårborsten fortfarande fäster vid kärlvävnaden, inspektera den för kvarvarande fragment av glaskropp och ta bort dem med pincett.
Det optimala ögonblicket för fullständigt avlägsnande av glaskroppen är efter eliminering av fotoreceptorerna, men före avlägsnandet av den återstående nerv- och gliavävnaden. Näthinnan bibehåller styvheten tills fotoreceptorerna avlägsnas. Att extrahera glaskroppen i detta skede kan potentiellt slita sönder näthinnan/kärlen. De känsliga lagren av kvarvarande nerv- och gliavävnad spelar en avgörande roll för att bevara den krökta formen av kärlstrukturen. De förhindrar att näthinnan slits sönder i mitten när glaskroppen lossnar från synnerven.
Om den isolerade vaskulaturen inte fäster vid mikroskopglaset alls, indikerar det att den del av glaset där vidhäftning förväntas uppstå är smutsig. Försök att flytta kärlen över objektglasets yta för att hitta en klibbig plats, byt till en annan rutschkana eller rengör objektglaset noggrant och försök igen. Om kärlen fastnar på objektglaset innan de vecklar ut sig till sin skålliknande form, lyft kärlen från glaset så att det kan flyta fritt i vattnet igen. Gör detta steg med en pincett som upprepade gånger har doppats i YL-trypsinlösningen.
Flera alternativa tekniker för att isolera kärlen har rapporterats, vilka inte skulle vara lämpliga för den skyddsanalys som beskrivs här. Till exempel har osmotisk lys använts för att isolera kärlen från ofixerade näthinneprover, vilket underlättar biokemiska undersökningar av vävnaden24,25. Denna procedur kanske dock inte bevarar kärlens anatomi lika bra som det tillvägagångssätt som används i denna artikel. På samma sätt, medan vävnadsavtrycksmetoden för att isolera stora segment av mikrovaskulatur möjliggör analys av kärlens elektrotoniska arkitektur26, återfinns vanligtvis inte hela kärlbädden.
Denna analys utvecklades eftersom befintliga metoder för att övervaka kapillärdegeneration inte tar itu med frågan om skydd. Kapillärdegeneration, som uppstår efter långvarig DM, indikerar om DR har utvecklats. Förutom att diagnostisera DR är detta resultat användbart för att bedöma om ett medel/terapi förhindrar DR. Befintliga kapillärdegenerationsanalyser talar dock inte om den underliggande verkningsmekanismen för medlet. Ett sådant medel kan förhindra patologiska händelser som driver DR, såsom ökad oxidativ stress eller cytokiner. Alternativt kan medlet förstärka skyddet genom att öka motståndskraften mot oxidativ stress och cytokiner och/eller främja reparation av skador. Denna nya skyddsanalys kan användas för att avgöra om den gynnsamma effekten av en viss terapi innebär att man förstärker det endogena systemet som skyddar mot DM-relaterad död.
En nackdel med denna skyddsanalys är att den inte skiljer mellan de två celltyperna i näthinnans kärl: endotelceller (EC) och pericyter (PC). Även om utseendet på deras kärnor i PASH-färgade sektioner är celltypsspecifikt (figur 6), uppvisar inte alla kärnor diagnostiska egenskaper. Cirka 30 % av kärnorna kan inte entydigt definieras som EC eller PC, åtminstone delvis på grund av att de tvådimensionella bilderna som erhålls från PASH-färgade prover ofullständigt upplöser den tredimensionella strukturen hos vaskulär plexus. Detta hinder skulle kunna övervinnas genom ytterligare analyser, t.ex. immunofluorescensfärgning med celltypsspecifika markörer. Sådana bilder, som skiljer de två celltyperna åt, kan färgas tillsammans med TUNEL för att bestämma resistensen/sårbarheten hos var och en av de vaskulära celltyperna.
Denna vaskulärfokuserade analys ger ingen information om den neurala näthinnan. Ytterligare analyser skulle kunna utvecklas för att tillhandahålla sådan information. Till exempel, istället för att isolera näthinnans kärl, kan en encellssuspension av hela näthinnan genereras och sedan analyseras (genom fluorescerande aktiverad cellsortering) för resistens/sårbarhet. Inkludering av celltypsspecifika markörer (både neurala och vaskulära) tillsammans med indikatorer på celldöd skulle ge en mer komplett bild av de näthinnecelltyper som har kapacitet att skydda mot DM/DR-medierad död.
Sammanfattningsvis ger skyddsanalysen som beskrivs här ett kraftfullt tillvägagångssätt för att undersöka mekanismen som är ansvarig för fördröjningen mellan uppkomsten av DM och manifestationen av DR hos möss.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av anslag från Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 och EY001792) och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
- Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21 (2015).
- Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21 (2016).
- Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R.
- Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187 (2018).
- Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
- Aiello, L. P., et al.
- Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
- Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
- Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
- Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
- Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
- Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869 (2023).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489 (2013).
- Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
- Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
- Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
- Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
- Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
