Summary
산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병/당뇨병성 망막병증 관련 모욕으로 인한 사망에 대한 망막 혈관의 복원력을 모니터링하기 위해 보호 분석법이 개발되었습니다.
Abstract
당뇨병성 망막증(DR)은 발병기전에서 두 가지 뚜렷한 단계를 특징으로 하는 복잡하고 진행성 안구 질환입니다. 첫 번째 단계는 당뇨병으로 인한 망막 손상에 대한 보호 기능 상실을 수반하는 반면, 두 번째 단계는 이러한 손상의 축적에 중점을 둡니다. 기존 분석법은 주로 손상의 심각성을 나타내는 모세관 변성을 평가하는 데 중점을 두며, 기본적으로 DR의 두 번째 단계를 다룹니다. 그러나 망막 혈관의 보호 메커니즘이 손상되었는지 여부에 대한 통찰력을 간접적으로 제공할 뿐입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막의 보호 메커니즘, 특히 산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병으로 인한 모욕에 대한 망막의 회복력을 직접 평가하는 새로운 접근법이 개발되었습니다. 이 보호 분석법은 처음에는 당뇨병성 망막병증을 위해 설계되었지만 생리학적 및 병리학적 맥락 모두에서 더 광범위하게 적용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 요약하면, 당뇨병성 망막병증의 발병기전을 이해하려면 보호 손실과 손상 누적의 이중 단계를 인식해야 하며, 이 혁신적인 보호 분석법은 연구에 유용한 도구를 제공하고 잠재적으로 다른 의학적 상태로 확장될 수 있습니다.
Introduction
당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병(DM)의 미세혈관 합병증 중 하나이며, 선진국의 노동 연령 실명의 주요 원인입니다1. 당뇨병성 망막병증의 주요 위험인자는 고혈당증의 기간과 정도이다 2,3,4. DM은망막의 혈관 및 신경 구성 요소 모두의 기능 장애를 유발하지만5 DR의 진단은 망막 혈관 구조6의 형태학적 특징에 기초한다.
고혈당으로 인한 산화 스트레스는 DR 발병의 원인 중 하나이다7. 산화 스트레스가 증가하면 광범위한 손상이 발생하여 미토콘드리아의 기능이 손상되어 활성 산소 종의 수준이 더욱 높아집니다. 이러한 현상은 망막 혈관의 누출, 염증성 사이토카인 수치의 증가, 망막 내 신경 및 혈관 세포 유형의 사멸을 동반합니다. 혈관 세포의 손실과 그에 따른 망막의 광범위한 모세혈관 네트워크의 기능은 다양한 반응을 위한 강력한 자극인 저산소증을 초래한다5. 이러한 반응에는 투과성과 혈관신생을 모두 유발하는 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현 증가, 당뇨병성 황반부종과 증식성 당뇨병성 망막병증의 진행된 시력 위협 단계의 주요 특징이 포함된다6.
DR의 특정 특징은 유기체(환자 및 실험 동물 모두)가 이 적응증에 저항할 수 있는 내재적 능력을 가지고 있음을 시사합니다. 환자는 시력을 위협하는 DR 8,9,10,11,12,13이 발생하기 전에 수십 년의 DM을 경험합니다. DM의 설치류 모델은 DR14의 진행된 시력 위협 단계를 발달시키지 않는 반면, 나타나는 DR의 초기/경미한 형태는 DM15,16의 몇 주 또는 몇 달 후에만 발현된다. 또한, 환자와 실험동물 모두에서 DR은 진행성이며, DM의 지속 기간이 길어질수록 망막 기능 장애/손상이 증가합니다. 마지막으로, DM을 앓고 있는 일부 환자들은 DR이 전혀 발생하지 않습니다. 어떤 경우에는 이러한 개인이 DR이 발생할 만큼 충분히 오래 당뇨병을 경험하지 않기 때문입니다. 다른 경우에는 DR에 대한 특별한 저항을 나타내기 때문입니다. DM17을 50년 이상 복용한 후에도 DR이 발생하지 않는 Medalist 연구 참가자의 경우와 같습니다. DR로부터의 보호의 존재와 엄청난 번역 관련성에 대한 강력한 지원에도 불구하고 보호의 기본 메커니즘은 적극적으로 조사되지 않았습니다.
본원에 기술된 보호 분석법은 당뇨병성 마우스에서 DR이 DM의 시작으로부터 지연되는 이유에 대한 조사를 용이하게 하기 위해 개발되었다. DM 및 non-DM 마우스에 적용되는 이 분석의 주요 단계에는 (1) 눈에 최대 이하의 사망 유도 모욕을 전달(생체 외 또는 생체 내), (2) 망막 혈관 분리, (3) TUNEL 및 DAPI로 혈관 염색, (4) 결과 이미지 사진 촬영 및 TUNEL/DAPI 이중 양성 종의 백분율 정량화가 포함됩니다.
Protocol
모든 동물 연구는 시카고에 일리노이 대학에 동물 배려 및 기관 생물 안전의 사무실에 의해 찬성되었다. 생후 7주 된 수컷 C57/BL6/J 마우스는 병원균이 없는 환경에서 12시간 빛/어둠 주기로 집단 케이지에 수용되어 무료 음식과 물을 제공했습니다. 마우스는CO2 질식에 의해 안락사되었고, 눈은 즉시 적출되어 처리되었다18. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 연구에 필요한 필수 도구는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 죽음을 유발하는 모욕의 전달
- TBH(ex vivo)로 산화 스트레스를 수행합니다.
- 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시키고 그들의 눈을 적출시킨다18 (도 2A).
- 5mM Tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(TBH)를 포함하거나 포함하지 않고 DMEM + 1% BSA를 함유하는 24웰 플레이트의 개별 웰에 안구를 직접 넣습니다( 재료 표 참조). 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다. 양성 대조군 샘플은 DNA를 단편화하기 위해 10분 동안 DNase(50U/100μL)로 처리합니다.
참고: TBH(산화 스트레스를 유발하는 물질)의 투여량은 분리된 망막 혈관 내에서 쉽게 검출할 수 있고 최대 이하의 세포 사멸을 유도하기 위해 선택되었다(18). - 하룻밤 동안 10% 완충 포르말린으로 눈을 고정합니다(최소 16시간).
- 사이토카인 칵테일을 사용하여 염증을 유도합니다(생체 내).
- 100mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다.
- 맞춤형 33G 바늘( 재료 표 참조)을 사용하여 사이토카인 칵테일 1μL/눈을 유리체에 주입합니다. 주입 부위는 림버스에서 2-3mm 떨어져 있습니다(그림 2B).
참고: 사이토카인 칵테일은 1μg/mL TNF-α, 1μg/mL IL-1β 및 1500U/μL IFN-γ18 의 1:1:1 비율을 함유하고 있습니다( 재료 표 참조). - 주사 후 24시간 후, 쥐를 안락사시키고(제도적으로 승인된 프로토콜에 따라) 눈을 적출시키고 밤새 10% 완충된 포르말린으로 고정합니다.
참고: 실험은 고정 후 최대 1주일 동안 일시 중지했다가 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
2. 망막 격리
- 안구를 잘라 엽니다.
- 곧은 집게를 사용하여 시신경을 부드럽게 잡습니다(그림 2C). 다른 손으로 마이크로 나이프를 잡고 림버스 뒤쪽 2-3mm를 절개합니다.
- 마이크로 나이프에서 마이크로 가위로 전환하여 안구가 두 부분으로 잘릴 때까지 시신경과 함께 안구를 회전시키면서 림버스와 평행하게 자릅니다.
- 수정체를 포함한 눈의 앞쪽 절반을 버립니다(그림 2C).
- 공막을 제거하십시오.
- 직선 집게를 사용하여 공막을 망막에서 1-3mm 부드럽게 들어 올립니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 시신경으로 가는 길의 공막 부분을 두 번 방사형으로 자릅니다. 밑에 있는 망막을 자르지 마십시오.
- 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 공막 피판을 잡고 망막에서 떼어냅니다. RPE 층은 공막과 함께 벗겨집니다.
- 망막을 씻으십시오.
- 마이크로 주걱을 사용하여 분리된 망막을 이중 증류수로 채워진 24웰 접시 내의 웰로 옮깁니다.
- 실온에서 중간 정도의 속도로 접시를 부드럽게 흔듭니다. 30분에서 1시간마다 물을 최소 4-5회 갈아준 다음 밤새 그대로 두십시오.
3. 망막 혈관 분리
- 소화 : 이중 증류수를 800 μL의 YL 트립신 용액 (3 M Tris 완충액 (pH 0.1)의 7.8 % 트립신)으로 대체하십시오. 37°C에서 4시간 15분19 동안 흔들리지 않고 부드럽게 배양합니다(그림 2D).
알림: 혈관을 손상시킬 수 있으므로 급격한 흔들림을 피하십시오. - 전사: 유리 전사 피펫의 넓은 끝을 YL 트립신 용액으로 담그고 망막을 보푸라기가 없는 이중 증류수가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 담그십시오.
- 외부 핵층(광수용체)을 제거합니다(그림 2E).
- 망막 반구를 아래로 향하게 뒤집습니다. 곧은 단발 브러시를 사용하여 망막을 접시 바닥으로 부드럽게 누릅니다.
- 루프 브러시를 사용하여 망막의 광수용체를 부드럽게 털어냅니다. 브러시 스트로크는 시신경에서 망막 주변부 방향으로 적용됩니다. 광수용체는 혈관에 의해 망막의 나머지 부분에 고정되어 있지 않기 때문에 큰 시트에서 분리될 수 있습니다.
- 200μL 피펫을 사용하여 신경 조직 시트를 수집하고 폐기합니다.
- 유리체를 제거하십시오.
- 망막이 위쪽을 향하도록 반구를 뒤집습니다. 한 쌍의 구부러진 집게(A)를 사용하여 해부 현미경으로 유리체를 최대한 잡습니다.
참고: 유리체는 시신경이나 망막에 부착된 투명한 조직처럼 보입니다. - 다른 구부러진 집게(B)를 사용하여 시신경을 연결하는 유리체의 끝을 잡습니다. 겸자 A를 겸자 B에서 당겨 유리체를 제거합니다.
- 유리체를 버리십시오. 유리체의 잔여물을 검사하고 잔류물이 다음 단계를 방해하므로 이 단계를 반복하여 모든 유리체를 제거합니다.
- 망막이 위쪽을 향하도록 반구를 뒤집습니다. 한 쌍의 구부러진 집게(A)를 사용하여 해부 현미경으로 유리체를 최대한 잡습니다.
- 남아 있는 신경 및 신경교 조직을 제거합니다(그림 2F).
- 망막 반구를 뒤집어 다시 아래를 향하도록 합니다. 다시 한 번, 직선 브러시를 사용하여 망막을 접시 바닥에 부드럽게 누릅니다(머리카락 끝을 사용하지 마십시오).
- 루프 브러시를 사용하여 시신경 머리에서 주변부로 혈관 조직을 부드럽게 닦아 나머지 신경 조직20을 제거합니다.
- 직선 브러시로 망막을 천천히 돌리고 루프 브러시를 사용하여 혈관 네트워크가 잘 청소될 때까지 망막 혈관에 있는 신경 조직의 작은 덩어리를 모두 제거합니다(그림 2G,H).
4. 현미경 슬라이드에 분리된 망막 혈관 장착
- 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 깨끗한 장착 카세트( 재료 표 참조)를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 카세트에 이중 증류수를 채웁니다.
- 해부 현미경 아래에 검은색 배경을 사용하여 대비를 생성하여 조명된 투명한 혈관을 볼 수 있습니다.
- 집게를 사용하여 라벨이 부착된 깨끗한 현미경 슬라이드를 장착 카세트 바닥에 놓습니다.
- 망막 혈관을 옮깁니다.
- 유리 이송 피펫의 넓은 끝을 YL 트립신 용액으로 담그십시오.
- 세척된 망막 혈관을 옮기고 장착 카세트 내부와 현미경 슬라이드 위의 이중 증류수로 혈관을 부드럽게 제거합니다.
- 망막 혈관을 장착합니다.
알림: 혈관이 현미경 슬라이드 위에 떠 있는 동안 격리된 혈관은 정상적인 그릇 모양을 얻습니다.- 루프 브러시를 사용하여 망막 반구를 위로 향하게 뒤집고 혈관을 유리 슬라이드 위로 부드럽게 밀어 내린 다음 머리카락을 사용하여 열린 혈관을 슬라이드 중앙에 압착합니다. 혈관은 슬라이드에 닿을 때 달라붙어야 합니다.
- 시신경에서 말초까지 그릇 모양의 망막 혈관을 솔질하여 혈관을 평평하게 장착합니다.
- 혈관이 슬라이드에 완전히 달라붙을 때까지 모든 방향으로 칫솔질을 반복합니다.
- 망막 혈관을 자연 건조시킵니다.
- 전체 망막 혈관이 슬라이드에 부착되면 한쪽 가장자리를 부드럽게 들어 올리거나 카세트 모서리에서 물을 천천히 배출하여 전류를 최소화한 다음 당겨 슬라이드를 물에서 꺼냅니다(그림 2I).
알림: 혈관 구조는 공기 건조되면 쉽게 볼 수 있습니다(그림 2J). - 슬라이드 뒷면의 망막 혈관 둘레를 마커 펜으로 표시합니다.
- 일시 중지 없이 샘플 염색을 진행합니다.
- 전체 망막 혈관이 슬라이드에 부착되면 한쪽 가장자리를 부드럽게 들어 올리거나 카세트 모서리에서 물을 천천히 배출하여 전류를 최소화한 다음 당겨 슬라이드를 물에서 꺼냅니다(그림 2I).
5. TUNEL 염색을 통한 사망 감지
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 Zheng et al.21을 참조하십시오. 고립된 망막 혈관에서 허혈 +/- 황소 스트레스 유발 자가사멸체의 대표적인 이미지가 그림 3에 묘사되어 있습니다.
- PBS로 격리된 혈관을 재수화합니다. PBS에서 3번 헹군 다음 PBS에서 1% Triton X-100으로 얼음 위에서 2분 동안 배양하여 분리된 혈관을 투과시킵니다.
- PBS로 슬라이드를 두 번 헹구어 남아 있는 Triton X-100을 제거합니다. 샘플 주변을 건조시킵니다.
- 50μL의 TUNEL 반응 혼합물( 재료 표 참조)을 샘플에 추가합니다. 어두운 곳에서 37°C에서 60분 동안 가습된 분위기에서 슬라이드를 배양합니다.
- 슬라이드를 PBS로 3번 헹구어 TUNEL 반응 혼합물을 제거합니다. 샘플 주변을 건조시킵니다.
- DAPI 장착 매체 한 방울을 추가하여 DAPI로 핵을 염색하고 커버 유리로 샘플을 장착합니다. 어두운 곳에서 4 °C에서 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 이미지를 캡처하기 전에 최대 1주일 동안 일시 중지될 수 있습니다. - 컨포칼 형광 현미경으로 생성된 혈관 조직을 촬영합니다( 재료 표 참조). 시신경을 둘러싼 먼 주변부에서 무작위로 선택된 6-8개의 필드를 캡처합니다(그림 4).
참고: 고립된 망막 혈관에서 사이토카인에 의해 유도된 자가사멸체의 대표적인 이미지는 그림 5에 나와 있습니다. - 결과를 분석합니다.
- 생체 외, TBH 처리된 샘플의 경우 다음 단계를 수행합니다.
- 이미지 J를 사용하여 각 필드에서 자가사멸체(TUNEL/DAPI 이중 양성 종)의 수를 계산합니다( 재료 표 참조). 단일 샘플의 모든 필드에서 자가사멸체의 평균을 계산합니다.
- 무작위로 선택된 non-DM 샘플과 DM 샘플 쌍 사이의 자가사멸체 수의 접힘 변화를 계산합니다.
- 양측 학생 t-검정18을 사용하여 통계적으로 유의한 차이가 있는지 확인합니다.
알림: 대조군과 실험 샘플(비 DM 및 DM)을 동일한 방식으로 수행하더라도 TUNEL 염색의 정도가 다를 수 있으므로 동일한 경우에 염색하십시오. 숙련된 사용자는 하루에 최대 10개의 망막을 세척하고 장착할 수 있으므로 이 프로토콜을 시작하기 전에 동일한 수의 대조군 망막과 실험용 망막을 처리할 계획을 세우십시오.
- in vivo, cytokines cocktail 처리 샘플의 경우 다음 단계를 수행합니다.
- 전체 망막 혈관에서 자가사멸체(TUNEL/DAPI 이중 양성 종)의 수를 수동으로 계산합니다.
- 무작위로 선택된 non-DM 샘플과 DM 샘플 쌍 사이의 자가사멸체 수의 접힘 변화를 계산합니다.
- 양측 학생 t-검정을 사용하여 통계적으로 유의한 차이가 있는지 확인합니다.
- 생체 외, TBH 처리된 샘플의 경우 다음 단계를 수행합니다.
Representative Results
망막 혈관 구조를 성공적으로 분리하면 생쥐 망막 혈관 구조의 전체 네트워크가 평평하게 장착되고 구조적 무결성이 그대로 유지됩니다(그림 2J). 주기적 acid-schiff hematoxylin(PASH)으로 염색하면 내피 세포(EC)와 주위 세포(PC)의 두 가지 혈관 세포 유형을 구별할 수 있습니다(그림 6). 내피 세포핵은 길쭉하고 약간 염색되어 있으며 완전히 혈관 벽 내에 있습니다. 주위 세포핵은 원형이고 조밀하게 염색되어 있으며 모세혈관 벽에서 돌출되어 있습니다. PASH 염색 샘플은 또한 핵이 없는 무세포 모세혈관을 보여줍니다.
죽음을 유도하는 접근법은 다음과 같은 논리에 따라 진행되었습니다. 보호가 제한되어 있다는 것, 즉 죽음을 유발하는 매우 강한 모욕에 압도될 수 있다는 추측이 있었습니다. 결과적으로, 모욕(허혈/산화 스트레스 및 사이토카인18 모두)은 쉽게 감지할 수 있지만 사망률이 최대치에 못 미치는 정도를 유도하도록 최적화되었습니다(그림 3 및 그림 5).
TUNEL 양성 핵의 존재는 세포 사멸을 유발하기 위해 사용되는 특정 유형의 모욕에 따라 달라진다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 허혈/산화 스트레스 손상은 그림 3과 같이 세포 사멸의 트램 트랙 패턴으로 이어졌고, 사이토카인 손상은 그림 5와 같이 뚜렷하고 잘 정의된 패턴을 초래했습니다. 두 패턴 모두 DR 환자(22)의 망막 혈관에서 관찰될 수 있으며, 이는 두 가지 유형의 약제 모두 인간에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 시사한다. 또한, 관찰된 형태학적 구분은 병리학이 산화 스트레스 또는 사이토카인에 의해 유발되었는지 평가할 수 있는 수단을 제공합니다.
그림 1: 쥐의 망막 혈관을 분리하기 위한 도구. 왼쪽에서 오른쪽으로: 장착 카세트, 단발 브러시 2개, 거꾸로 된 전사 피펫, 마이크로 주걱, 곡선형 집게 2개, 스프링 가위, 마이크로 나이프, 끝이 직선인 집게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 죽음을 유발하는 모욕을 전달한 다음 쥐의 눈에서 망막 혈관을 분리하는 주요 단계를 보여주는 개략도. (A) 허혈/산화 손상의 유도, 생체 외. 적출 후 안구는 TBH가 있는 상태에서 허혈을 겪습니다. (B) 사이토카인의 생체내 투여(유리체내 주사). (C) 안구를 두 부분으로 자릅니다. (D) 망막 효소 소화: 공막을 제거하고 이중 증류수로 밤새 망막을 세척합니다. 37°C의 YL 트립신 용액에서 24웰 플레이트의 웰에서 4시간 15분 동안 배양합니다. (E) 광수용체 제거. (F) 남아 있는 신경 및 신경교 조직을 제거합니다. (G) 위쪽을 향하는 그릇 모양의 혈관 네트워크를 청소합니다. (H) 해부 현미경 스테이지에 검은색 배경이 있는 35mm 접시의 격리된 혈관 네트워크. (I) 슬라이드에 평평하게 장착된 망막 혈관. (J) 슬라이드에서 공기 건조된 망막 혈관. 이 그림은 Li et al.18에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 허혈 +/- TBH로 생체 외에서 치료된 쥐 망막 혈관 내 자가사멸체 검출. 고립된 망막 혈관에서 허혈 +/- 황소 스트레스 유발 자가사멸체의 대표 이미지. 각 열의 제목은 염색을 나타냅니다. (A-C) 1시간의 허혈을 단독으로 겪은 안구에서 분리된 망막 혈관. (D-F) (A-C)와 동일, 1 h 모욕을 제외하고는 허혈과 산화 스트레스 (5 mM TBH)의 조합이었다. 빨간색 화살표는 대표적인 TUNEL/DAPI 이중 양성 종을 가리킵니다. (지-I) DNase로 처리된 양성 대조군. 눈금 막대 = 50μm. 이 그림은 Li et al.18에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 결과 정량화를 위한 필드 선택 그림. TUNEL과 DAPI 신호가 병합된 망막 혈관의 5 x 5 타일 스캔. 시신경을 둘러싼 먼 주변부의 6-8개 영역의 선택은 빨간색 사각형으로 표시됩니다. 배율, 200x. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 사이토카인의 유리체내 주입에 대한 반응으로 마우스 망막 혈관 내 자가사멸체 검출(in vivo 투여). 고립된 망막 혈관에서 사이토카인에 의해 유도된 자가사멸체의 대표 이미지. 각 열의 제목은 염색을 나타냅니다. (A-C) PBS를 주입한 유리체내 마우스에서 분리한 망막 혈관의 이미지. (D-F) 사이토카인 칵테일을 PBS와 함께 주입한 것을 제외하고는 (A-C)와 동일하다. 빨간색 화살표는 대표적인 TUNEL 양성 종을 가리킵니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림은 Li et al.18에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PASH로 염색된 망막 혈관의 대표 이미지. 20주 동안 STZ 유도 DM을 경험한 마우스의 망막 혈관을 그림 2에 설명된 대로 분리하고, PASH로 염색하고, 가시광선으로 조명을 비추면서 이미징했습니다. 모세혈관의 주위 세포핵은 더 원형이고 조밀하게 염색된 경향이 있는 반면(파란색 화살표), 길쭉하고 덜 조밀하게 염색된 핵은 내피 세포(빨간색 화살표)를 진단합니다. 노란색 화살표는 무세포 모세혈관을 가리킵니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구에서는 허혈/산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 DM/DR 관련 모욕에 의해 유발된 사망에 대한 망막 혈관의 저항/취약성을 감지하기 위한 분석을 확립했습니다. 이 원고는 이 분석에 대한 상세한 설명을 제공하며, 이는 여러 공개된 프로토콜 19,20,21의 수정이다.
프로토콜은 몇 가지 중요한 단계를 포함합니다. 첫째, 망막을 꼼꼼하게 절개하여 혈관 네트워크를 보존하고 상당한 파열을 방지하는 것이 필수적입니다. 이것은 망막이 ora serrata에 단단히 부착되어 분리가 어렵기 때문에 변연 뒤쪽 2-3mm를 절개하여 수행할 수 있습니다. 둘째, 혈관과 접촉하는 모든 기구(예: 단모 브러시, 이송 피펫 및 겸자)를 절차 전반에 걸쳐 YL 트립신 용액에 담가 트립신으로 코팅합니다. 이렇게 하면 혈관이 이 프로토콜에 사용되는 기구에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 셋째, 미세혈관은 정상적인 조명 아래에서는 거의 보이지 않기 때문에 파편을 흡인하고 현미경 슬라이드로 옮기는 동안 우발적인 손실을 방지하기 위해 높은 경계가 필요합니다.
망막의 다양한 층의 적절한 수준의 효소 소화가 중요합니다. 소화가 불충분하면 신경 조직이 혈관 네트워크에서 분리되는 것을 방해하는 반면, 과도한 소화는 혈관 신경총을 용해시킵니다. 1시간19 분에서 하룻밤 23 분에 이르는 다양한 소화 시간이 보고되었다. 관찰에 따르면 4시간 15분의 분해 시간은 2시간, 3시간 및 4시간의 지속 시간에 비해 가장 유리한 결과를 산출합니다. 이 시점 이상으로 소화를 연장하는 것은 과정을 향상시키지 않을 것이며 대신 혈관 조직의 무결성을 손상시킬 수 있습니다.
소화된 망막이 단모 브러시에 부착된 경우 YL 트립신 용액에 모발을 여러 번 담그십시오. 이렇게 하면 브러시의 끈적끈적한 부분이 줄어듭니다. 헤어 브러시가 여전히 혈관 조직에 부착되어 있으면 유리체의 잔류 조각이 있는지 검사하고 집게로 제거하십시오.
유리체를 완전히 제거하기 위한 최적의 순간은 광수용체를 제거한 후 남아 있는 신경 및 신경교 조직을 제거하기 전입니다. 망막은 광수용체가 제거될 때까지 경직을 유지합니다. 이 단계에서 유리체를 추출하면 망막/혈관이 찢어질 수 있습니다. 잔여 신경 및 신경 교세포의 섬세한 층은 혈관 구조의 곡선 형태를 보존하는 데 중추적인 역할을 합니다. 유리체가 시신경에서 분리될 때 망막의 중심이 찢어지는 것을 방지합니다.
격리된 혈관이 현미경 슬라이드에 전혀 부착되지 않으면 접착이 발생할 것으로 예상되는 슬라이드 부분이 더러움을 나타냅니다. 슬라이드 표면을 가로질러 용기를 움직여 끈적끈적한 부분을 찾거나, 다른 슬라이드로 전환하거나, 슬라이드를 꼼꼼하게 청소한 후 다시 시도해 보십시오. 혈관이 그릇 모양으로 펼쳐지기 전에 슬라이드에 달라붙으면 슬라이드에서 혈관을 들어 올려 다시 한 번 물 속에서 자유롭게 떠오를 수 있도록 합니다. YL 트립신 용액에 반복적으로 담근 겸자를 사용하여 이 단계를 수행합니다.
혈관을 분리하기 위한 몇 가지 대안적인 기술이 보고되었는데, 이는 본원에 기술된 보호 검정에 적합하지 않을 것이다. 예를 들어, 삼투압 용해는 고정되지 않은 망막 샘플로부터 혈관 조직을 분리하기 위해 사용되어 조직24,25의 생화학적 조사를 용이하게 합니다. 그러나 이 절차는 혈관의 해부학적 구조와 이 기사에서 사용된 접근 방식을 보존하지 못할 수 있습니다. 유사하게, 미세혈관의 큰 분절을 분리하기 위한 조직 프린트 방법이 혈관계의 전기긴장 구조(26)의 분석을 가능하게 하는 반면, 전체 혈관층은 전형적으로 회복되지 않는다.
이 분석법은 모세관 변성을 모니터링하기 위한 기존 접근 방식이 보호 문제를 해결하지 못하기 때문에 개발되었습니다. 장기간의 DM 후에 발생하는 모세혈관 변성은 DR이 발생했는지 여부를 나타냅니다. DR을 진단하는 것 외에도 이 결과는 약제/요법이 DR을 예방하는지 여부를 평가하는 데 유용합니다. 그러나 기존의 모세관 변성 분석법은 약제의 근본적인 작용 기전을 설명하지 못합니다. 이러한 약제는 산화 스트레스 또는 사이토카인 증가와 같은 DR을 유발하는 병리학적 사건을 예방할 수 있다. 대안적으로, 제제는 산화 스트레스 및 사이토카인에 대한 복원력을 향상시킴으로써 보호를 시행할 수 있고/또는 손상의 복구를 촉진할 수 있다. 이 새로운 보호 분석법은 주어진 치료법의 유익한 효과가 DM 관련 사망으로부터 보호하는 내인성 시스템을 시행하는 것과 관련이 있는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
이 보호 분석법의 단점은 망막 혈관 내의 두 가지 세포 유형, 즉 내피 세포(EC)와 주위 세포(PC)를 구별하지 못한다는 것입니다. PASH 염색 절편에서 핵의 모양은 세포 유형에 따라 다르지만(그림 6), 모든 핵이 진단 특징을 나타내는 것은 아닙니다. 핵의 약 30%는 적어도 부분적으로는 EC 또는 PC로 명확하게 정의할 수 없는데, 이는 PASH 염색 샘플에서 얻은 2차원 이미지가 혈관신경총의 3차원 구조를 불완전하게 분해하기 때문입니다. 이 장애물은 세포 유형별 마커를 사용한 면역형광 염색과 같은 추가 분석을 통해 극복할 수 있습니다. 두 가지 세포 유형을 구별하는 이러한 이미지는 TUNEL과 함께 염색하여 각 혈관 세포 유형의 저항성/취약성을 측정할 수 있습니다.
이 혈관 중심 분석은 신경 망막에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 정보를 제공하기 위해 추가 분석을 개발할 수 있습니다. 예를 들어, 망막 혈관을 분리하는 대신 전체 망막의 단일 세포 현탁액을 생성한 다음 저항/취약성에 대해 분석(형광 활성화 세포 분류를 통해)할 수 있습니다. 세포 사멸 지표와 함께 세포 유형 특이적 마커(신경 및 혈관 모두)를 포함하면 DM/DR 매개 사멸로부터 보호할 수 있는 망막 세포 유형에 대한 보다 완전한 그림을 제공할 수 있습니다.
결론적으로, 본원에 기술된 보호 분석은 마우스에서 DM의 시작과 DR의 발현 사이의 지연에 책임이 있는 메커니즘을 조사하기 위한 강력한 접근법을 제공한다.
Disclosures
저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 일리노이 실명 예방 협회(Illinois Society to Prevent Blindness), 국립 보건원(National Institute of Health, EY031350 및 EY001792)의 보조금과 실명 예방 연구 재단(Research to Prevent Blindness Foundation)의 무제한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
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