Summary
弯曲杆菌 是全球细菌性食源性胃肠炎的主要原因。尽管企业制定了减少整个设施流行率的措施，但受污染的产品始终如一地到达消费者手中。过去12年开发的技术解决了从生肉中分离和检测 弯曲杆菌 属的现有方法的局限性。
Abstract
本文介绍了一种从生肉中分离 弯曲杆菌 属的快速而强大的方案，特别关注 空肠弯曲杆菌 和 大肠弯曲杆菌。该协议建立在既定方法的基础上，确保与美国食品和药物管理局 （FDA） 和美国农业部 （USDA） 以及欧洲国际标准化组织 （ISO） 等监管机构采用的流行技术兼容。 该协议的核心是收集冲洗液，将其浓缩并重悬于含有马血的Bolton Broth培养基中。该培养基已被证明可促进应激 弯曲杆 菌细胞的恢复，并将所需的富集持续时间减少 50%。然后将富集的样品转移到布鲁氏菌板上的硝酸纤维素膜上。为了提高该方法的灵敏度和特异性，评估了孔径为0.45μm和0.65μm的滤膜。数据显示，与0.45 μm孔径相比，0.65 μm孔径过滤器的细胞回收率提高了29倍，而不影响特异性。 弯曲杆 菌的高度运动特性使细胞能够主动通过膜过滤器向琼脂培养基移动，从而能够有效分离纯 弯曲杆菌 菌落。该方案结合了多重定量实时聚合酶链反应（mqPCR）测定，以在物种水平上鉴定分离株。这种分子技术提供了一种可靠和有效的物种鉴定方法。过去12年中对零售肉类进行的调查表明，与目前的参考方法相比，这种方法能够提高弯曲 杆 菌从自然污染的肉类样品中的回收率。此外，该协议还减少了制备和处理时间。因此，它为从肉类中有效回收 弯曲杆菌 提供了一种很有前途的替代方案。 此外，该程序可以与基于DNA的方法无缝集成，便于快速筛选阳性样本以及全面的全基因组测序分析。
Introduction
弯曲杆菌 属是全球细菌性食源性胃肠炎的主要原因，估计每年有 8 亿例病例1。弯曲 杆 菌是一种主要的人畜共患细菌，可自然定植于多种动物的胃肠道中，包括野生鸟类、农场动物和宠物2。在屠宰或食品加工过程中， 弯曲杆菌 属经常污染胴体或肉制品3.弯曲杆菌病通常与食用未煮熟的家禽或生禽汁交叉污染其他食物有关2.它可能导致严重的并发症，例如吉兰-巴雷综合征、反应性关节炎和免疫功能低下个体的败血症4.从食物来源（尤其是家禽产品）中检测和分离 弯曲杆菌 对于公共卫生监测、疫情调查和风险评估至关重要。
传统的基于培养的方法是弯曲杆菌检测的传统和标准方法5,6。然而，存在一些局限性，包括孵育时间长（48小时或更长时间）、灵敏度低（高达50%），并且不适用于所有菌株（一些应激弯曲杆菌细胞可能无法在培养基中生长良好或根本无法生长）7。分子方法，如聚合酶链反应（PCR），比基于培养的方法更快速、更灵敏，但它们不能为进一步表征提供可行的分离株8,9。
免疫学方法是 弯曲杆菌 检测的替代和补充方法。这些方法快速、简单、用途广泛，但也有一些局限性，包括交叉反应性（某些抗体可能与非弯曲杆 菌或其他具有相似抗原的物质结合）、特异性低（某些抗体可能无法与所有 弯曲杆 菌株或血清型结合）和样品制备要求（免疫学方法通常需要对样品进行预处理以去除干扰物质以增强抗体的结合）10。
在弯曲杆菌属中，空肠梭菌和大肠杆菌可引起大多数人类弯曲杆菌感染（分别为 81% 和 8.4%）11。两者都是螺旋形、微需氧和嗜热细菌，含有单极鞭毛或双极鞭毛。鞭毛在每极的旋转被认为是其特征开瓶器运动的主要驱动力，也是其发病机制的关键，因为它允许细菌游过宿主胃肠道的粘膜。弯曲杆菌的运动受其化学感觉系统控制，使细胞能够向有利的环境移动12,13。基于弯曲杆菌的细胞形态和生理特征，一些研究利用膜过滤从粪便和环境样品中分离弯曲杆菌属14,15,16。
本研究提出了一种快速而稳健的方案，用于从生肉中分离和随后检测空肠梭菌和大肠杆菌，克服了现有方法的缺点，并提供了一些优点。使用多种方法，如显微镜检查、生化试验（例如，过氧化氢酶和氧化酶活性测定）或分子方法，可以确认暂定菌落为弯曲杆菌属6。该方法使用靶向空肠衣原体和大肠杆菌特有基因的多重实时荧光定量PCR（mqPCR）检测在物种水平上鉴定分离株。这种方法相对便宜、快速且具有选择性，因此适用于各种环境，包括食品加工设施、临床实验室和研究实验室。
Protocol
与本协议相关的所有工作都应在生物安全柜（BSC）内进行，以保持无菌条件，并将样品污染或操作员暴露于微生物病原体的风险降至最低。将样品转移到平衡计分卡外时，请使用密封容器，以防止意外掉落时溢出，保持样品的完整性。优选在整个过程中应使用一次性组件，以减少交叉污染的可能性。如果一次性用品不可行，请确保所有设备和材料在使用前都是无菌的。适当的废物管理至关重要;所有使用过的一次性组件都应作为生物危害废物丢弃。在丢弃材料之前对材料进行高压灭菌，以确保适当的灭菌并避免包含潜在的危险材料。遵守这些预防措施不仅可以保证样品的完整性，还可以最大限度地降低操作人员接触微生物病原体的风险。 图 1 描述了 弯曲杆菌 物种的样品制备、选择性富集、基于过滤器的分离和 mqPCR 分化的工作流程。 补充文件 1 描述了整个过程中更详细的工作流程和图像。
1. 肉类样品的制备
- 获取肉类样品
- 从当地零售商处购买各种新鲜肉类包装，包括鸡腿、鸡翅、鸡腿和肝脏。
- 将所有样品转移到4°C的储存中，并在收到后24小时内处理。
注意：将新鲜样品储存在较低的温度下，例如低于冰点，会影响回收率。
- 处理肉类样品
- 遵循FSIS抽样指南6,17中规定的成分比例。
- 从每个包装中切下 450 克鸡块，并将它们放入胃袋中（见 材料表）。
注意： 建议使用胃袋，因为它们具有足够的机械强度来确保下游工艺，并且不会破裂或泄漏。 - 准备缓冲蛋白胨水（BPW）。
- 将20g粉末（见 材料表）溶解在1L纯化水中。将溶液在121°C高压灭菌15分钟。在无菌水中将溶液稀释至0.1%的浓度。
- 将 200 mL 0.1% BPW 加入装有鸡肉的胃袋中。
- 从胃袋外部手动按摩/触诊样品 2 分钟。
- 使用电动移液器控制器从袋子的过滤侧收集所有鸡肉冲洗液（参见 材料表）。
- 将鸡肉冲洗液分配到无菌离心机瓶中。在室温下以10,000× g 离心10分钟。
- 使用带有 25 mL 一次性血清塑料移液器的电动移液器控制器仔细收集上清液。避免干扰颗粒。
- 根据需要重复该过程以确保除去所有上清液。
- 弃去收集的上清液。
2. 从生肉中选择性富集弯曲杆菌
- 用补充剂制备博尔顿肉汤
- 将 13.8 g 粉末（参见 材料表）溶解在 500 mL 纯化水中。通过在121°C下高压灭菌15分钟对肉汤进行灭菌。
- 将 25 mL 湖化马血（见 材料表）加入灭菌的 500 mL Bolton 肉汤中。
注意：添加马血可作为氧淬灭剂，以帮助从食物基质中恢复受伤的 弯曲杆菌 细胞。 - 在 5 mL 50% 乙醇中复溶 1 瓶抗生素补充剂（头孢哌酮、环己酰亚胺、甲氧苄啶和万古霉素，参见 材料表）。
- 将复溶的抗生素补充剂添加到博尔顿肉汤中。
- 浓缩程序
- 将沉淀重悬于含有湖状马血和抗生素的 50 mL Bolton 肉汤中。
- 将样品（盖子松开）放入密封容器中，该容器保持 85% N2、10% CO2 和 5% O2 的气体混合物。
- 确保盖子松动，但容器密封严密，以产生 弯曲杆菌的微需氧和嗜热生长要求。
注意： 当环境室不可用时，可以使用保持 85% N2、10% CO2 和 5% O2 大气的气组。 - 将样品在42°C孵育24小时。
- 确保盖子松动，但容器密封严密，以产生 弯曲杆菌的微需氧和嗜热生长要求。
3.从生鸡肉中分离纯化空肠梭菌和大肠杆菌
- 布鲁氏菌琼脂平板的制备
- 将28克布鲁氏菌粉（见 材料表）溶于1升纯净水中。将15g琼脂溶解在布鲁氏菌溶液中。
- 通过在121°C下高压灭菌15分钟灭菌布鲁氏菌琼脂。 在55°C水浴中冷却中等琼脂混合物。
- 将 20 mL 布鲁氏菌琼脂倒入每个直径为 100 mm 的培养皿中。
- 过滤方法和菌落培养
- 通过干燥布鲁氏菌琼脂平板，并在生物安全柜中打开盖子0小时，1小时，2小时和3小时，评估水分对弯曲 杆菌 通过过滤器的影响。
- 通过将 80 μL 样品直接铺在布鲁氏菌琼脂平板上来制备无过滤器对照。
- 将醋酸纤维素过滤器（0.45μm或0.65孔径，参见 材料表）置于布鲁氏菌琼脂平板的中心。
- 将 4 滴/过滤器和 20 μL/滴富集样品移液到过滤器上。
- 将液滴放在过滤器中心附近，以确保到达板的液体通过过滤器，而不是过滤器周围。
- 滴剂的放置方式应确保它们不会扩散和聚集。
- 将液滴在室温下孵育15分钟，然后小心地取出过滤器。
注意：此步骤允许 弯曲杆菌 细胞有足够的时间穿过膜并到达琼脂培养基，而无需过度干燥。 - 在前面描述的微需氧条件下，在42°C孵育板约24小时。
- 选择具有特定性状的特征 性弯曲杆菌 菌落。
注意： 弯曲杆菌 菌落通常是圆形的，边缘光滑，闪闪发光，呈半透明的淡黄色或粉红色6。 - 将菌落条纹菌落到布鲁氏菌琼脂平板上进行纯化。重复此步骤，直到获得具有单个均匀菌落形态的平板。
- 准备长期储存的样品。
- 如前所述准备博尔顿肉汤。从平板中加入一个具有均匀菌落形态的菌落。
- 在前面描述的微需氧条件下生长过夜（24小时）。将 900 μL 过夜培养物加入含有 100 μL DMSO 的 2 mL 冻存管中。
- 在干冰 - 乙醇浴（约-72°C）中快速冷却10分钟。转移到-80°C冰箱中长期储存。
4. 空肠梭 菌和 大肠杆菌 物种的鉴定
- 使用先前开发的多重qPCR（mqPCR）测定法对空肠梭菌和大肠杆菌进行物种水平鉴定18,19。
- 以 96 孔板形式进行快速细胞裂解和基因组 DNA 提取。
注意：强烈建议考虑使用商业试剂盒（参见 材料表），以确保样品充分不含已知的PCR抑制剂。- 将纯化的 弯曲杆菌 菌落分散到100μL提取溶液中。
- 在99°C下裂解样品10分钟，然后在热循环仪中在20°C下冷却2分钟。
- 在室温下以8,000× g 离心板10分钟。取出 2 μL 等分试样的上清液用于 mqPCR 测定。
- 制备一个 20 μL 反应混合物，包括 10 μL 2x 预混液、2.0 μL DNA 样品、104 个内部扩增对照 （IAC） 模板以及 200 nM 的每个引物和探针（参见 材料表）。
注： hipO 和 cdtA 的引物和探针分别是 空肠衣原体 和 大肠杆菌的独家靶基因。IAC 由人类腺病毒的 79 bp DNA 片段组成，并作为阳性对照包括在内，以确保 DNA 聚合酶在所有样品中的活性一致。
- 将所有样品一式三份加载到覆盖有光学薄膜的 96 孔光学板中，并将它们放入实时荧光定量 PCR 系统中（参见 材料表）。
- 在95°C启动DNA聚合酶的热启动激活10分钟。随后在95°C下变性40个循环15秒，在60°C下退火/延伸1分钟。
- 以 96 孔板形式进行快速细胞裂解和基因组 DNA 提取。
5. 枚举细胞悬浮液
- 使用 6 x 6 滴板程序计数细胞悬浮液20.有关描述 6 x 6 滴板方法的图像，请参阅 补充文件 1 。
- 将布鲁氏菌琼脂平板风干，盖子在层流罩中关闭45分钟。
- 将 200 μL 细菌悬浮液加入 96 孔板第一列的六行 （A-F） 中。
- 将 180 μL 布鲁氏菌培养基分布在其余色谱柱的 6 行 （2-12） 中。
- 使用 20 μL 转印制备 10 倍连续稀释液。
- 例如，将 20 μL 样品从第一列转移到第二列。对至少 6 列重复此过程。
- 使用移液管将每个悬浮液混合十次，在每次转移之间更换吸头。
- 使用多通道移液器将来自六行色谱柱的 7 μL液滴沉积在布鲁氏菌琼脂平板表面。
- 重复此操作以创建一个 6 x 6 数组，确保行是跨列的技术复制。
- 将板风干5分钟，然后倒置板。将板在42°C孵育24小时。
- 计算每个代表性稀释中的菌落数。
Representative Results
布鲁氏菌琼脂平板中水分对弯曲杆菌被动过滤的影响
弯曲杆菌 的基因组很小，缺乏其他细菌中常见的几种应激反应基因，例如 大肠杆菌 O157：H7和 沙门氏菌。因此，它对各种环境压力更敏感，不能忍受脱水或环境氧气水平。相反，过于潮湿的琼脂培养基会淹没过滤器。这不仅会导致样品扩散到过滤器外部，而且还会增加暴露于氧气21的时间。
为了确定基于过滤器分离弯曲杆菌的适当条件，将布鲁氏菌琼脂平板干燥，并在生物安全柜内取下盖子 0 小时、1 小时、2 小时和 3 小时，并评估弯曲杆菌细胞穿过 0.65 μm 孔径过滤器的效率。将浓度为 1.53 x 104 和 1.53 x 105 CFU/mL 的 4 个 20 μL 空肠梭菌 S27 等分试样移液到放置在布鲁氏菌板顶部的每个滤膜上。渗透15分钟后，取出过滤器，并将板孵育过夜以供细胞生长。
然后对来自5个复制板的细胞进行计数，并在 表1中记录。结果表明，干燥2小时和3小时的琼脂平板表现相似，从被动过滤中回收的细胞数量几乎相等。值得注意的是，在这些条件下干燥0小时和1小时的板不允许细胞在使用的15分钟时间内完全穿过膜。
从鸡肝中分离 弯曲杆菌 的不同孔径滤膜的比较
考虑到 弯曲杆菌 细胞大小（长度为0.5-5μm，宽度为0.2-0.9μm）和广泛的食物粒径，在孵育时间为15分钟时，测试了孔径为0.45μm和0.65μm的醋酸纤维素过滤器的弯曲 杆 菌传代效率。实验使用由450克鸡肝组成的食物样本，加入153 CFU的 空肠梭 菌，然后浓缩过夜。作为无过滤器对照，并行包括富集样品的直接电镀。来自 5 个重复板的结果（图 2）一致表明，0.65 μm 孔径过滤器比 0.45 μm 孔径过滤器允许更多的细胞遍历，从而获得的细胞增加 ~29 倍。与0.65 μm孔径过滤器相比，0.45 μm孔径过滤器在过滤器的上侧保留了过多的细胞，导致弯曲 杆 菌从食物中的回收率显着降低。不出所料，在无过滤器控制板上生长着不同背景生物的草坪。
被动过滤在零售鸡肉 弯曲杆菌 分离中的应用
由于 弯曲杆 菌细胞具有不寻常的运动性，因此选择被动过滤技术从零售肉制品中分离 空肠梭 菌和 大球菌 ，这些肉制品通常被许多背景生物污染。在2014年至2023年期间，我们共从多家本地超市收集了79个生肉包，包括鸡肉、鸡肝、牛肝和小牛肝的不同部分。从每个包装中取样450g用于分离 弯曲杆菌 属。通过将弯曲 杆菌 在含血的Bolton肉汤中的选择性富集和通过0.65μm孔径的醋酸纤维素过滤器直接过滤到布鲁氏菌琼脂平板上对细胞进行被动过滤，已从79个肉类样品中成功分离出49个 弯曲杆菌 菌株（表2）。 图3 显示了从鸡肝中分离出一种新的 弯曲杆菌 菌株的结果。该方法已被反复证明是灵敏、特异性和成本效益高的。
空肠梭菌和大肠杆菌分离株的鉴定和区分
为了验证从生肉中获得的弯曲杆菌分离株的属并区分其种类，采用了多重qPCR测定法扩增空肠衣原体和大肠杆菌的特定基因靶标（hipO和cdtA），并采用内部扩增对照（IAC）。IAC作为假阴性指标纳入多个基因的同时扩增中。该测定以 96 孔形式进行，使用市售试剂进行快速细胞裂解和 DNA 提取（参见材料表）。表2总结了空肠梭菌和大肠杆菌菌株的物种鉴定结果。作为进一步的验证，全基因组测序结果证实了所有分离株的物种（数据未显示）。
图 1：从零售肉类中分离和鉴定 弯曲杆菌 物种的工作流程图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：过滤器尺寸对 弯曲杆菌回收率的影响。 结果表明，0.65 μm滤器平均可回收900±138个菌落，而0.45 μm滤器可回收7个菌落±31个。结果是从 N = 20（5 个板，每块板 4 滴）生成的，学生 的 t 检验 表明均值在统计学上不同 （p < 0.0001）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：通过被动过滤富集的家禽样品分离 弯曲杆菌 。 （A） 描绘了沉积在硝酸纤维素膜过滤器上的四滴 20 μL 富集样品。在被动过滤的 15 分钟内收集图像。（B） 描绘取下硝酸纤维过滤器后的板。四个点表示富集样品穿过膜的位置。（C） 描述孵育 24 小时后的板。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1：布鲁氏菌琼脂平板干燥时间对空肠梭菌被动过滤的影响。请按此下载此表格。
表2：从生肉中分离出的空肠梭菌和大肠杆菌菌株。 在 2008 年至 2023 年期间，从 24 种独特零售产品的 79 个肉类包装中分离出 36 个 空肠衣原 体和 13 个 大肠杆菌 菌株。 请按此下载此表格。
补充文件 1：整个隔离和枚举过程中的图像。请点击此处下载此文件。
Discussion
协议的意义
空肠梭菌和大肠杆菌是在家禽22和动物肝脏23,24中发现的两种主要弯曲杆菌。本研究随机采集不同时间段的鸡肉部位（腿、翅、大腿）、鸡肝、牛肝等肉类样本，从不同的零售店和厂家采集，用于分离弯曲杆菌属。在分离出的49株弯曲杆菌菌株中，36株为空肠梭菌，13例为大肠杆菌，未发现其他弯曲杆菌属，与其他报告一致25。
该测定基于弯曲杆菌属的螺旋状细胞形态和特征性的开瓶器样运动。一种简单而有效的被动过滤技术26,27利用其螺旋形细胞形态（长而细长，0.2-0.9 x 0.5-5μm）和强大的开瓶器运动，用于将弯曲杆菌从背景生物的混合物中分离出来。弯曲杆菌的高运动性使细胞能够穿过膜过滤器并朝着琼脂培养基中发现的有利条件移动，而来自肉制品的其他背景微生物无法通过。这种方法相对便宜、快速且具有选择性，因此适用于各种环境，包括食品加工设施、临床实验室和研究实验室。
一篇经常被引用的开创性文章指出，0.45 μm 过滤器工作得非常好，以至于 0.65 μm 没有被评估28。本研究的结果表明，0.65 μm 孔径过滤器的性能明显优于 0.45 μm 孔径过滤器，导致从富集中回收的细胞数量增加了 29 倍。这很重要，因为所选的滤光片不会像之前报道的那样显示出降低的选择性29。此外，众所周知，与直接铺板相比，过滤将显著减少 弯曲杆菌 的回收量30，因此，增加孔径的大小可提高微生物的回收率，这与先前报道的发现21一致。这很重要，因为所有穿过过滤器的细胞都形成了均匀的 弯曲杆菌 菌落，这表明两个过滤器都足以防止其他微生物群落和食物颗粒通过。此外，FSIS 流程图7 指出，由于在含有抗生素的 Campy-Cefex 平板上重新划线分离株，可能会延长结果产生。相比之下，本手稿中描述的方案结合了使用头孢哌酮、环己酰亚胺、甲氧苄啶和万古霉素进行过滤和选择性富集，不需要重新划线。
目前采用的方法与当前的FSIS抽样和验证计划一致17。由于 弯曲杆菌 污染水平可能很低（153 CFU/450 g 鸡肉），因此将冲洗液离心以将样品浓缩四倍，从而提高测定的灵敏度。在将冲洗液浓缩4倍后，将样品富集48小时，并用分子检测系统（MDS）进行筛选，以复制FSIS实验室采用的方法（数据未显示）。值得注意的是，所描述的方法尚未未能在24小时内鉴定出分子检测系统使用48小时富集检测到的阳性菌株（数据未显示）。最后，该协议的另一个好处是它可以提供与细菌种类相关的信息，并确定 弯曲杆 菌是大肠杆 菌、 空肠梭菌还是 拉里弯曲杆菌，而 MLG 41.07 中采用的 MDS 只能为 弯曲杆菌提供二元阳性/阴性反应。
关键步骤
弯曲杆菌分离和鉴定方案要求在离心、过滤和分子分析过程中保持精确。准确的稀释度、适当的孵育条件和对qPCR检测条件的严格遵守对于可靠的物种鉴定至关重要。
作为一种微需氧细菌，弯曲杆菌非常脆弱，对各种环境胁迫敏感，需要独特的苛刻条件才能生长31,32,33。在通常经历长时间运输和储存的食物样品中，许多弯曲杆菌细胞可能处于休眠或亚致死/致死损伤状态34,35。因此，从食物基质中恢复应激细胞并将它们培养到更高的浓度非常重要。在手术的第一步中，我们使用补充了马血和抗生素的博尔顿肉汤，从食物中选择性富集弯曲杆菌。添加血液作为氧淬灭剂，以克服自由氧自由基的不利影响36.抗生素用于抑制背景微生物群落的生长37。
为了最大限度地减少 弯曲杆菌 暴露于环境大气氧气的时间，选择了 15 分钟的孵育期以允许细胞穿过过滤器。此外，过滤器下布鲁氏菌琼脂平板的水分在通过率中起着重要作用。具体来说，干燥0小时，1小时，2小时和3小时的琼脂平板测试结果表明，过滤器中的高水分含量阻止了细胞通过。同样关键的是滤光片和液滴在板和滤光片上的精确放置，这两者都会影响细胞分离的成功。
潜在的陷阱和局限性
虽然提出了一种从生鸡肉样品中分离和鉴定 弯曲杆菌 物种的结构化方法，但该协议的几个局限性值得关注。外部污染、板干燥不充分、过滤器堵塞阻碍微生物移动、微生物滞留在颗粒内、大气室密封不完全以及液滴扩散到过滤器边界之外是主要陷阱。
微生物与食物表面的分离不充分或它们被限制在大部分样品中可能会阻碍使用这种方法进行分离。此外，依靠微生物运动通过被动过滤器进行遍历存在显着局限性;过滤膜可能保留了一些运动性较差的 弯曲杆 菌菌株，因为已经表明过滤器可以降低食物中微生物病原体的捕获效率38。进一步的限制包括离心和过滤过程的批处理性质、过滤器堵塞的易感性以及分散形成的颗粒的效率低下，这将影响微生物载量的准确性。这些局限性共同强调了在确保全面分析时需要谨慎和补充方法，尤其是在处理各种样品类型或寻求高通量能力时。
故障排除建议
为了预防潜在问题，首先要确保所有材料都符合必要的质量标准并且没有过期。通过可能采用额外的过滤来去除任何可能限制 弯曲杆菌 通过硝酸纤维素膜的大污染物，从而排除过滤器堵塞的问题。如果观察到污染，请确认液滴没有放置在离过滤器边缘太近的位置，并允许液体绕过过滤器而不是通过孔隙到达琼脂。如果浓缩后生长不足，请验证常压容器的密封是否严密且没有泄漏。
潜在的改进和扩展
探索替代过滤材料可以增强微生物的穿越，并使该协议能够扩展，用于从异质混合物（如食物）中分离其他运动微生物。建议确定对照，以保留运动较少的 弯曲杆菌 变体，而不会对特异性产生负面影响。此外，虽然本研究中使用的多重qPCR测定被证明具有检测 C.lari的能力 ，但其他感兴趣的 弯曲杆菌 物种可以包括在该测定中。
综上所述，通过评估不同的参数和设置，建立了基于过滤器的分离和食物中 空肠衣原体 和 大肠杆菌 物种水平鉴定的适宜条件。该方法已被证明具有灵敏性、特异性、稳健性和成本效益。通过将其应用于真实的食品样品，该协议能够从79个肉类包装中分离出36个 空肠梭 菌和13个 大肠杆菌 菌株。
该协议符合 FSIS 指令 10,250.117，该指令概述了生鸡肉部分取样的程序，以及用于分离和鉴定弯曲杆菌的 MLG 41.076。数据表明，将样品浓缩 4 倍并富集 24 小时，再加上过滤和接种，可在 48 小时内产生分离的、确认的菌落，而不是 96 小时。该协议与基于DNA的方法（如基因组测序）兼容，以提供弯曲杆菌菌株的全面表征，包括其抗菌素耐药性特征、毒力预测和系统发育关系。该协议代表了从生家禽中有效回收和分离弯曲杆菌属的有前途的替代方案，可以促进流行病学研究和公共卫生干预。
Disclosures
所有作者都声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了美国农业部农业研究服务局 （USDA-ARS） 国家计划 108、当前研究信息系统编号 8072-42000-093 和 8072-42000-094-000-D 的支持。美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
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