Summary
Campylobacter , dünya çapında bakteriyel gıda kaynaklı gastroenteritin önde gelen nedenidir. Kuruluşların tesislerinde yaygınlığı azaltmak için önlemler almasına rağmen, kontamine ürünler sürekli olarak tüketicilere ulaşmaktadır. Son on iki yılda geliştirilen teknik, Campylobacter spp.'yi çiğ etten izole etmek ve tespit etmek için mevcut yöntemlerin sınırlamalarını ele almaktadır.
Abstract
Bu makale, özellikle Campylobacter jejuni ve Campylobacter coli'ye odaklanarak, çiğ etlerden Campylobacter spp.'yi izole etmek için hızlı ama sağlam bir protokol sunmaktadır. Protokol, ABD'de Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve ABD Tarım Bakanlığı (USDA) ve Avrupa'da Uluslararası Standardizasyon Örgütü (ISO) gibi düzenleyici kurumlar tarafından kullanılan geçerli tekniklerle uyumluluğu sağlayan yerleşik yöntemler üzerine kuruludur. Bu protokolün merkezinde, at kanı içeren Bolton Broth ortamında konsantre edilen ve yeniden süspanse edilen bir durulama toplanmaktadır. Bu besiyerinin stresli Campylobacter hücrelerinin iyileşmesini kolaylaştırdığı ve gerekli zenginleştirme süresini% 50 oranında azalttığı kanıtlanmıştır. Zenginleştirilmiş numuneler daha sonra brusella plakaları üzerindeki nitroselüloz membranlara aktarılır. Yöntemin duyarlılığını ve özgüllüğünü artırmak için 0.45 μm ve 0.65 μm gözenek büyüklüğünde filtre membranları değerlendirildi. Veriler, özgüllüğü etkilemeden 0,45 μm gözenek boyutuna kıyasla 0,65 μm gözenek boyutu filtresi ile hücre iyileşmesinde 29 kat artış olduğunu ortaya koydu. Campylobacter'in oldukça hareketli özellikleri, hücrelerin membran filtrelerinden agar ortamına doğru aktif olarak hareket etmesine izin verir, bu da saf Campylobacter kolonilerinin etkili bir şekilde izole edilmesini sağlar. Protokol, izolatları tür düzeyinde tanımlamak için multipleks kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (mqPCR) testini içerir. Bu moleküler teknik, türlerin tanımlanması için güvenilir ve verimli bir araç sunar. Son on iki yılda perakende etleri içeren araştırmalar, bu yöntemin, mevcut referans yöntemlerine kıyasla doğal olarak kontamine et örneklerinden Campylobacter'in geri kazanımını artırma yeteneğini göstermiştir. Ayrıca, bu protokol daha kısa hazırlık ve işlem süresine sahiptir. Sonuç olarak, Campylobacter'in etten verimli bir şekilde geri kazanılması için umut verici bir alternatif sunar. Ayrıca, bu prosedür DNA tabanlı yöntemlerle sorunsuz bir şekilde entegre edilebilir ve kapsamlı tüm genom dizileme analizinin yanı sıra pozitif örneklerin hızlı bir şekilde taranmasını kolaylaştırır.
Introduction
Campylobacter spp. yılda tahmini 800 milyon vaka ile dünya çapında bakteriyel gıda kaynaklı gastroenteritin önde gelen nedenidir1. Önemli bir zoonotik bakteri olan Campylobacter , yabani kuşlar, çiftlik hayvanları ve evcil hayvanlar da dahil olmak üzere çok çeşitli hayvanların gastrointestinal yollarını doğal olarak kolonize eder2. Kesim veya gıda işleme sırasında, Campylobacter spp. sıklıkla karkasları veya et ürünlerini kontamine eder3. Campylobacteriosis genellikle az pişmiş kümes hayvanlarının tüketimi veya diğer gıdaların çiğ kümes hayvanı suları ile çapraz kontaminasyonu ile ilişkilidir2. Bağışıklığı baskılanmış kişilerde Guillain-Barré sendromu, reaktif artrit ve septisemi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir4. Campylobacter'i gıda kaynaklarından, özellikle kümes hayvanı ürünlerinden tespit etmek ve izole etmek, halk sağlığı gözetimi, salgın araştırması ve risk değerlendirmesi için gereklidir.
Konvansiyonel kültür tabanlı yöntemler, Campylobacter tespiti için geleneksel ve standart yöntemlerdir 5,6. Bununla birlikte, uzun inkübasyon süreleri (48 saat veya daha fazla), düşük hassasiyet (% 50'ye kadar) dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır ve tüm suşları içermez (bazı stresli Campylobacter hücreleri ortamda iyi büyümeyebilir veya hiç büyümeyebilir)7. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler yöntemler, kültür bazlı yöntemlerden daha hızlı ve hassastır, ancak daha ileri karakterizasyon için uygun izolatlar sağlamazlar 8,9.
İmmünolojik yöntemler Campylobacter tespiti için alternatif ve tamamlayıcı yöntemlerdir. Bunlar hızlı, basit ve çok yönlüdür, ancak aynı zamanda çapraz reaktivite (bazı antikorlar Campylobacter olmayan bakterilere veya benzer antijenleri paylaşan diğer maddelere bağlanabilir), düşük özgüllük (bazı antikorlar tüm Campylobacter suşlarına veya serotiplerine bağlanmayabilir) ve numune hazırlama gereksinimleri (immünolojik yöntemler genellikle antikorların bağlanmasını arttırmak için enterferans yapan maddeleri uzaklaştırmak için numunelerin ön işlemden geçirilmesini gerektirir) dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara sahiptir.10'dir.
Campylobacter cinsi içinde, C. jejuni ve C. coli, çoğu insan Campylobacter enfeksiyonuna neden olur (sırasıyla% 81 ve% 8.4)11. Her ikisi de tek kutuplu bir kamçı veya bipolar kamçı içeren spiral şekilli, mikroaerofilik ve termofilik bakterilerdir. Her kutupta bir kamçının dönmesi, hem karakteristik tirbuşon motilitesi için birincil itici güç olarak kabul edilir hem de bakterinin konakçı gastrointestinal sistemin viskoz mukozasında yüzmesine izin verdiği için patogenezi için çok önemlidir. Campylobacter'in motilitesi, hücrelerin uygun ortamlara doğru hareket etmesine izin veren kemosensör sistemi tarafından kontrol edilir12,13. Campylobacter'in hücre morfolojisine ve fizyolojik özelliklerine dayanarak, birkaç çalışmada Campylobacter spp.'nin dışkı ve çevresel örneklerden izolasyonu için membran filtrasyonu kullanılmıştır 14,15,16.
Bu çalışma, çiğ etten C. jejuni ve C. coli'nin izolasyonu ve ardından tespiti için hızlı ve sağlam bir protokol sunmaktadır, bu da mevcut yöntemlerin dezavantajlarının üstesinden gelir ve çeşitli avantajlar sunar. Geçici koloniler, mikroskopi, biyokimyasal testler (örneğin, katalaz ve oksidaz aktivite deneyleri) veya moleküler yöntemler gibi çeşitli yöntemler kullanılarak Campylobacter spp. olarak doğrulanabilir6. Yöntem, C. jejuni ve C. coli'ye özgü genleri hedefleyen bir multipleks gerçek zamanlı PCR (mqPCR) testi kullanarak izolatları tür düzeyinde tanımlar. Bu yöntem nispeten ucuz, hızlı ve seçicidir, bu da onu gıda işleme tesisleri, klinik laboratuvarlar ve araştırma laboratuvarları dahil olmak üzere çeşitli ortamlarda kullanıma uygun hale getirir.
Protocol
Bu protokolle ilgili tüm çalışmalar, aseptik koşulları korumak ve numune kontaminasyonu veya operatörün mikrobiyal patojenlere maruz kalma riskini en aza indirmek için bir biyolojik güvenlik kabini (BSC) içinde yürütülmelidir. Numuneleri BSC dışına aktarırken, numune bütünlüğünü koruyarak kazara düşme durumunda dökülmeyi önlemek için kapalı kaplar kullanın. Tercihen, çapraz kontaminasyon olasılığını azaltmak için prosedür boyunca tek kullanımlık bileşenler kullanılmalıdır. Tek kullanımlık malzemelerin mümkün olmadığı durumlarda, kullanmadan önce tüm ekipman ve malzemelerin steril olduğundan emin olun. Uygun atık yönetimi çok önemlidir; Kullanılan tüm tek kullanımlık bileşenler, biyolojik olarak tehlikeli atık olarak atılmalıdır. Uygun sterilizasyonu sağlamak ve potansiyel olarak tehlikeli maddelerin tutulmasını önlemek için malzemeleri atmadan önce otoklavlayın. Bu önlemlere bağlı kalmak yalnızca numune bütünlüğünü korumakla kalmaz, aynı zamanda operatörün mikrobiyal patojenlere maruz kalma riskini de en aza indirir. Şekil 1 , Campylobacter türlerinin numune hazırlama, seçici zenginleştirme, filtre tabanlı izolasyon ve mqPCR farklılaşmasının iş akışını göstermektedir. Ek Dosya 1 , süreç boyunca daha ayrıntılı bir iş akışı ve görüntüler gösterir.
1. Et örneklerinin hazırlanması
- Et örneklerinin alınması
- Yerel perakendecilerden tavuk budu, kanat, baget ve ciğer dahil olmak üzere çeşitli taze et paketleri satın alın.
- Tüm numuneleri 4 °C'de depoya aktarın ve alındıktan sonra 24 saat içinde işleyin.
NOT: Taze numunelerin donma noktasının altı gibi daha düşük sıcaklıklarda saklanması geri kazanımı etkileyecektir.
- Et numunelerinin işlenmesi
- FSIS örnekleme kılavuzu 6,17'de belirtilen bileşenlerin oranını izleyin.
- Her paketten 450 g tavuk parçası kesin ve bunları bir mide torbasına koyun ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Mide torbaları, sonraki süreçleri sağlamak için yeterli mekanik mukavemete sahip oldukları ve yırtılmayacak veya sızıntı yapmayacakları için önerilir. - Tamponlu pepton suyu (BPW) hazırlayın.
- 20 g tozu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 L arıtılmış suda çözün. Çözeltiyi 121 °C'de 15 dakika otoklavlayın. Çözeltiyi steril suda% 0.1'lik bir konsantrasyona seyreltin.
- Tavuğu içeren mide torbasına 200 mL %0.1 BPW ekleyin.
- Numuneyi mide torbasının dışından 2 dakika boyunca manuel olarak masaj yapın/palpe edin.
- Motorlu bir pipet kontrolörü kullanarak torbanın filtrelenmiş tarafındaki tüm tavuk durulamasını toplayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Tavuk durulamasını steril santrifüj şişelerine dağıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
- 25 mL tek kullanımlık serolojik plastik pipetli motorlu bir pipet kontrolörü kullanarak süpernatanı dikkatlice toplayın. Peletleri rahatsız etmekten kaçının.
- Tüm süpernatantın çıkarıldığından emin olmak için işlemi gerektiği kadar tekrarlayın.
- Toplanan süpernatanı atın.
2. Campylobacter'in çiğ etten seçici olarak zenginleştirilmesi
- Bolton Et Suyunun takviyelerle hazırlanması
- 13.8 g tozu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL arıtılmış suda çözün. Et suyunu 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin.
- Sterilize edilmiş 500 mL Bolton Et Suyuna 25 mL laked at kanı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
NOT: At kanı ilavesi, yaralı Campylobacter hücrelerinin gıda matrisinden geri kazanılmasına yardımcı olmak için bir oksijen söndürme maddesi görevi görür. - 1 şişe antibiyotik takviyesi (sefoperazon, sikloheksimid, trimetoprim ve vankomisin, bkz . Malzeme Tablosu) 5 mL% 50 etanol içinde sulandırın.
- Sulandırılmış antibiyotik takviyesini Bolton Broth'a ekleyin.
- Zenginleştirme prosedürü
- Pelet, laked at kanı ve antibiyotik içeren 50 mL Bolton Et Suyunda yeniden süspanse edilir.
- Numuneleri (gevşetilmiş kapaklarla) %85N2, %10CO2 ve %5O2 gaz karışımını koruyan kapalı bir kaba yerleştirin.
- Kapağın gevşek olduğundan emin olun, ancak Campylobacter'in mikroaerofilik ve termofilik büyüme gereksinimlerini üretmek için kap sıkıca kapatılmıştır.
NOT: %85N2, %10CO2 ve %5 O2 atmosferini koruyan gaz paketleri, çevre odaları mevcut olmadığında kullanılabilir. - Numuneleri 42 °C'de 24 saat inkübe edin.
- Kapağın gevşek olduğundan emin olun, ancak Campylobacter'in mikroaerofilik ve termofilik büyüme gereksinimlerini üretmek için kap sıkıca kapatılmıştır.
3. Çiğ tavuktan C. jejuni ve C. coli'nin izolasyonu ve saflaştırılması
- Brucella agar plakalarının hazırlanması
- 28 g Brucella tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 1 L arıtılmış suda çözün. Brucella çözeltisinde 15 g agar eritilir.
- Brucella agarını 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin. Orta agar karışımını 55 °C'lik bir su banyosunda soğutun.
- Her 100 mm çapındaki Petri kabına 20 mL Brucella agar dökün.
- Süzme yöntemi ve koloni yetiştiriciliği
- Kapakları açık Brucella agar plakalarını bir Biyogüvenlik kabininde 0 saat, 1 saat, 2 saat ve 3 saat kurutarak nemin filtrelerden geçen Campylobacter üzerindeki etkisini değerlendirin.
- Numunenin 80 μL'sini doğrudan Brucella agar plakasına yayarak filtresiz bir kontrol hazırlayın.
- Bir Brucella agar plakasının ortasına bir selüloz asetat filtresi (0.45 μm veya 0.65 gözenek boyutu, Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
- Filtreye 4 damla/filtre ve 20 μL/damla zenginleştirilmiş numune pipetleyin.
- Plakaya ulaşan sıvının filtrenin etrafından değil, filtreden geçmesini sağlamak için damlaları filtrenin ortasına yakın bir yere yerleştirin.
- Damlaları yayılmamalarını ve toplanmamalarını sağlayacak şekilde yerleştirin.
- Damlaları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve filtreleri dikkatlice çıkarın.
NOT: Bu adım, Campylobacter hücrelerinin zarı geçmesi ve aşırı kuruma olmadan agar ortamına ulaşması için yeterli zamana izin verir. - Plakaları daha önce açıklanan mikroaerobik koşullar altında yaklaşık 24 saat boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
- Belirli özelliklere sahip karakteristik Campylobacter kolonilerini seçin.
NOT: Campylobacter kolonileri tipik olarak yuvarlaktır, pürüzsüz kenarlı, parıldayan ve yarı saydam sarımsı veya pembemsi renktedir6. - Saflaştırma için kolonileri Brucella agar plakalarına sürün. Tek bir homojen koloni morfolojisine sahip plakalar elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın.
- Numuneleri uzun süreli saklama için hazırlayın.
- Bolton Et Suyunu daha önce açıklandığı gibi hazırlayın. Tek tip koloni morfolojisine sahip plakadan bir koloni ekleyin.
- Daha önce açıklanan mikroaerofilik koşullar altında bir gecede (24 saat) büyür. 100 μL DMSO içeren 2 mL'lik bir kriyoviyal için 900 μL gece kültürü ekleyin.
- Kuru buz-etanol banyosunda (yaklaşık -72 °C) 10 dakika boyunca hızla soğutun. Uzun süreli saklama için -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
4. C. jejuni ve C. coli türlerinin tanımlanması
- Daha önce geliştirilen bir multipleks qPCR (mqPCR) testi kullanarak C. jejuni ve C. coli'nin tür düzeyinde tanımlamasını gerçekleştirin18,19.
- 96 oyuklu plaka formatında hızlı hücre lizisi ve genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
NOT: Numunenin bilinen PCR inhibitörlerinden yeterince arınmış olduğundan emin olmak için ticari kitlerin ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanılmasının düşünülmesi şiddetle tavsiye edilir.- Saflaştırılmış Campylobacter kolonilerini 100 μL ekstraksiyon çözeltisine dağıtın.
- Numuneleri 99 °C'de 10 dakika boyunca parçalayın, ardından bir termocycler'da 20 °C'de 2 dakika soğutun.
- Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin. mqPCR testi için süpernatantın 2 μL alikotunu çıkarın.
- 10 μL 2x Master Mix, 2.0 μL DNA örneği, 104 kopya Dahili Amplifikasyon Kontrolü (IAC) şablonu ve her bir primer ve probdan 200 nM'den oluşan 20 μL'lik bir reaksiyon karışımı hazırlayın (bkz.
NOT: hipO ve cdtA'nın primerleri ve probları, sırasıyla C. jejuni ve C. coli için özel hedef genlerdir. IAC, insan adenovirüsünün 79 bp'lik bir DNA segmentinden oluşur ve tüm numunelerde DNA polimerazın tutarlı aktivitesini sağlamak için pozitif bir kontrol olarak dahil edilir.
- Tüm numuneleri bir optik filmle kaplı 96 oyuklu bir optik plakaya üç kopya halinde yükleyin ve bunları bir Gerçek Zamanlı PCR sistemine yerleştirin (bkz.
- DNA polimerazın 95 °C'de 10 dakika boyunca sıcak başlatma aktivasyonunu başlatın. 15 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon ve 60 ° C'de 1 dakika boyunca tavlama / uzatma ile takip edin.
- 96 oyuklu plaka formatında hızlı hücre lizisi ve genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
5. Hücre süspansiyonlarını numaralandırın
- 6 x 6 damla plaka prosedürü20 kullanarak hücre süspansiyonlarını numaralandırın. 6 x 6 damla plaka yöntemini gösteren resimler için Ek Dosya 1'e bakın.
- Brucella agar plakalarını, kapağı kapalı olarak laminer akış başlığında 45 dakika süreyle havayla kurutun.
- 96 oyuklu bir plakanın ilk sütunundaki altı sıraya (AF) 200 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin.
- Kalan sütunların altı sırasına (2-12) 180 μL Brucella ortamı dağıtın.
- 20 μL transferler kullanarak on kat seri seyreltmeler hazırlayın.
- Örneğin, 20 μL numuneyi birinci sütundan ikinci sütuna aktarın. Bu işlemi en az 6 sütun için tekrarlayın.
- Reflü, pipeti kullanarak her süspansiyonu on kez karıştırın ve her transfer arasında uçları değiştirin.
- Bir Brucella agar plakasının yüzeyindeki bir sütunun altı sırasından 7 μL'lik damla bırakmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
- 6 x 6 dizisi oluşturmak için bu işlemi tekrarlayın ve satırların sütunlar arasında teknik olarak çoğaltıldığından emin olun.
- Plakaları 5 dakika havayla kurutun ve ardından plakayı ters çevirin. Plakaları 42 °C'de 24 saat inkübe edin.
- Her temsili seyreltmedeki koloni sayısını sayın.
Representative Results
Campylobacter'in pasif filtrasyonu için Brucella agar plakalarındaki nemin etkisi
Campylobacter küçük bir genoma sahiptir ve E. coli O157: H7 ve Salmonella gibi diğer bakterilerde yaygın olarak bulunan birkaç stres tepkisi geninden yoksundur. Bu nedenle, çeşitli çevresel streslere karşı daha hassastır ve dehidrasyona veya ortamdaki oksijen seviyelerine tahammül edemez. Tersine, aşırı nemli bir agar ortamı filtreyi doldurabilir. Bu sadece numunenin filtrenin dışına difüzyonuna neden olmakla kalmaz, aynı zamanda oksijene maruz kalma süresinide artırır 21.
Campylobacter'in filtre bazlı izolasyonu için uygun koşulları belirlemek için, Brucella agar plakaları, bir biyolojik güvenlik kabini içinde 0 saat, 1 saat, 2 saat ve 3 saat boyunca kapaklar çıkarılarak kurutuldu ve Campylobacter hücrelerinin 0.65 μm'lik bir gözenek boyutundan geçme etkinliği açısından değerlendirildi. 1.53 x 10 4 ve 1.53 x 105 CFU/mL konsantrasyonlarında dört adet 20 μL'lik C. jejuni S27 kültürü, bir Brucella plakasının üzerine yerleştirilmiş her bir filtre membranına pipetlendi. 15 dakikalık penetrasyondan sonra filtreler çıkarıldı ve plakalar hücre büyümesi için gece boyunca inkübe edildi.
5 çoğaltılmış plakadan hücreler daha sonra sayıldı ve Tablo 1'de not edildi. Sonuçlar, 2 saat ve 3 saat boyunca kurutulan agar plakalarının, pasif filtrasyondan geri kazanılan neredeyse eşit sayıda hücre ile benzer şekilde performans gösterdiğini gösterdi. Dikkat çekici bir şekilde, bu koşullar altında 0 saat ve 1 saat boyunca kurutulan plakalar, hücrelerin kullanılan 15 dakikalık süre içinde zarı tam olarak geçmesine izin vermedi.
Campylobacter'i tavuk ciğerinden izole etmek için farklı gözenek boyutundaki filtre membranlarının karşılaştırılması
Campylobacter hücre boyutları (0.5-5 μm uzunluğunda ve 0.2-0.9 μm genişliğinde) ve çok çeşitli gıda partikül boyutları göz önüne alındığında, 0.45 μm ve 0.65 μm gözenek boyutlarına sahip selüloz asetat filtreleri, 15 dakikalık bir inkübasyon süresi verildiğinde Campylobacter geçişinin etkinliği açısından test edilmiştir. Deney için 153 CFU C. jejuni ile çivilenmiş ve daha sonra gece boyunca zenginleştirilmiş 450 g tavuk ciğerinden oluşan gıda örnekleri kullanıldı. Filtresiz bir kontrol olarak, zenginleştirme numunesinin doğrudan kaplanması paralel olarak dahil edildi. 5 kopya plakadan elde edilen sonuçlar (Şekil 2) tutarlı bir şekilde 0.65 μm gözenek boyutu filtresinin, 0.45 μm gözenek boyutu filtrelerinden daha fazla hücrenin geçmesine izin verdiğini ve bunun da elde edilen ~ 29 kat daha fazla hücrenin artmasına neden olduğunu göstermiştir. 0.45 μm gözenek boyutu filtresi, filtrenin üst tarafında çok fazla hücre tuttu ve bu da 0.65 μm gözenek boyutu filtresine kıyasla gıdadan önemli ölçüde daha düşük bir Campylobacter geri kazanımı ile sonuçlandı. Beklendiği gibi, filtresiz kontrol plakalarında büyüyen farklı arka plan organizmalarından oluşan bir çim vardı.
Perakende tavuktan Campylobacter izolasyonunda pasif filtrasyon uygulaması
Campylobacter hücrelerinin olağandışı hareketliliği nedeniyle, tipik olarak çok sayıda arka plan organizması ile kontamine olan perakende et ürünlerinden C. jejuni ve C. coli'nin izolasyonu için pasif filtrasyon tekniği seçilmiştir. 2014-2023 yılları arasında çeşitli yerel süpermarketlerden tavuk eti, tavuk ciğeri, dana ciğeri ve dana ciğerinin farklı kısımlarını içeren toplam 79 çiğ et paketi toplandı. Her paketten 450 g Campylobacter spp. izolasyonu için numune alındı. Campylobacter'in kan içeren Bolton Et Suyunda seçici olarak zenginleştirilmesi ve hücrelerin 0.65 μm gözenek boyutunda selüloz asetat filtresinden doğrudan bir Brucella agar plakasına pasif filtrasyonu birleştirilerek, 79 et örneğinden 49 Campylobacter suşu başarıyla izole edilmiştir (Tablo 2). Şekil 3, tavuk ciğerinden yeni bir Campylobacter suşunun izole edilmesinin sonucunu temsil etmektedir. Yöntemin hassas, spesifik ve uygun maliyetli olduğu defalarca kanıtlanmıştır.
C. jejuni ve C. coli izolatlarının tanımlanması ve ayırt edilmesi
Çiğ etten elde edilen Campylobacter izolatlarının cinsini doğrulamak ve türlerini ayırt etmek için, C. jejuni ve C. coli için spesifik gen hedeflerini (hipO ve cdtA) amplifiye eden bir multipleks qPCR testi ve bir dahili amplifikasyon kontrolü (IAC) kullanıldı. IAC, çoklu genlerin eşzamanlı amplifikasyonunda yanlış negatif bir gösterge olarak dahil edildi. Test, ticari olarak temin edilebilen bir reaktif kullanılarak hızlı hücre lizisi ve DNA ekstraksiyonu ile 96 oyuklu bir formatta uygulandı (bkz. Tablo 2, C. jejuni ve C. coli suşlarının tür tanımlamasının sonucunu özetlemektedir. Ek doğrulama olarak, tüm genom dizileme sonuçları, tüm izolatların türlerini doğruladı (veriler gösterilmemiştir).
Şekil 1: Campylobacter türlerinin perakende etten izolasyonu ve tanımlanması için bir iş akışı şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Filtre boyutunun Campylobacter'in geri kazanımı üzerindeki etkisi. Sonuçlar, 0,65 μm'lik filtrenin ortalama 900 ± 138 koloniyi geri kazanabildiğini, 0,45 μm'lik filtrenin ise 31 ± 7 koloniyi geri kazanabildiğini göstermektedir. Sonuçlar N = 20'den (4 damla / plaka ile 5 plaka) üretildi ve bir Student t-testi , ortalamaların istatistiksel olarak farklı olduğunu gösteriyor (p < 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zenginleştirilmiş kümes hayvanı örneklerinin pasif filtrasyonu ile Campylobacter'in izolasyonu. (A) Nitroselüloz membran filtresinde biriken dört adet 20 μL'lik zenginleştirilmiş numune damlasını gösterir. Görüntü, 15 dakikalık pasif filtrasyon sırasında toplandı. (B) Nitroselüloz filtre çıkarıldıktan sonra plakayı gösterir. Dört nokta, zenginleştirilmiş numunenin zarı nereden geçtiğini gösterir. (C) 24 saatlik inkübasyondan sonra plakayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Brucella agar plaklarının kuruma süresinin C. jejuni'nin pasif filtrasyonu üzerine etkisi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: C. jejuni ve C. coli suşları çiğ etten izole edilmiştir. 2008'den 2023'e kadar olan süre zarfında, 24 benzersiz perakende üründe 79 et paketinden 36 C. jejuni ve 13 C. coli suşu izole edildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Yalıtım ve numaralandırma işlemleri boyunca görüntüler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Protokolün önemi
C. jejuni ve C. coli, kümes hayvanlarında22 ve hayvan karaciğerlerinde 23,24 yaygın olduğu tespit edilen iki ana Campylobacter türüydü. Bu çalışmada, Campylobacter spp.'nin izolasyonu için farklı zaman dilimlerinde ve farklı perakende mağazalarından ve üreticilerden tavuk parçaları (but, kanat ve but), tavuk ciğeri ve sığır karaciğeri et örnekleri rastgele toplanmıştır. İzole edilen toplam 49 Campylobacter suşundan 36'sı C. jejuni ve 13'ü C. coli olarak tanımlandı, başka hiçbir Campylobacter türü bulunmadı, bu da diğer raporlarlatutarlıdır 25.
Test, spiral şekilli hücre morfolojisine ve karakteristik tirbuşon benzeri hareketliliğe dayanmaktadır. Spiral şekilli hücre morfolojisinden (uzun, ince, 0.2-0.9 x 0.5-5 μm) ve güçlü tirbuşon motilitesinden yararlanan basit ama etkili, pasif bir filtrasyon tekniği26,27 Campylobacter'i arka plan organizmalarının bir karışımından ayırmak için kullanıldı. Campylobacter'in yüksek hareketliliği, hücrelerin membran filtrelerini geçmesine ve agar ortamında bulunan uygun koşullara doğru hareket etmesine izin verirken, et ürünlerinden gelen diğer arka plan mikroorganizmaları geçemedi. Bu yöntem nispeten ucuz, hızlı ve seçicidir, bu da onu gıda işleme tesisleri, klinik laboratuvarlar ve araştırma laboratuvarları dahil olmak üzere çeşitli ortamlarda kullanıma uygun hale getirir.
Sıklıkla atıfta bulunulan öncü bir makale, 0.45 μm filtrenin o kadar iyi çalıştığını ve 0.65 μm'nin değerlendirilmediğini belirtir28. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, 0.65 μm gözenek boyutu filtresinin 0.45 μm gözenek boyutundan önemli ölçüde daha iyi performans gösterdiğini ve zenginleştirmeden geri kazanılan hücre sayısında 29 kat artışa neden olduğunu göstermektedir. Bu önemlidir, çünkü seçilen filtreler daha önce bildirildiği gibi azaltılmış seçicilik göstermez29. Ayrıca, filtrelemenin doğrudan kaplamaya kıyasla geri kazanılan Campylobacter miktarını önemli ölçüde azaltacağı bilindiğinden,30, bu nedenle, gözenek boyutunun arttırılması, daha önce bildirilen bulgularla tutarlı olan mikroorganizmanın geri kazanımını iyileştirir21. Bu önemlidir, çünkü filtreleri geçen tüm hücreler tek tip Campylobacter kolonileri oluşturdu, bu da her iki filtrenin de diğer mikroflora ve gıda parçacıklarının geçmesini önlemede yeterli olduğunu gösterir. Ek olarak, FSIS akış şeması7 , antibiyotik içeren Campy-Cefex plakaları üzerindeki izolatların yeniden çizilmesi nedeniyle uzun süreli sonuç üretimi potansiyelini not eder. Buna karşılık, bu yazıda açıklanan ve sefoperazon, sikloheksimid, trimetoprim ve vankomisin ile filtrasyon ve seçici zenginleştirme kullanımını birleştiren protokol, yeniden streasing'i gerektirmemiştir.
Kullanılan mevcut yöntem, mevcut FSIS Örnekleme ve Doğrulama programları ile tutarlıdır17. Campylobacter kontaminasyon seviyesi düşük olabileceğinden (153 CFU/450 g tavuk), durulama, numuneyi dört kat konsantre etmek için santrifüjlenir ve bu da testin hassasiyetini artırır. Durulama 4 kat konsantre edildikten sonra, numuneler 48 saat boyunca zenginleştirilir ve FSIS laboratuvarları tarafından kullanılan yöntemi tekrarlamak için Moleküler Tespit Sistemi (MDS) ile taranır (veriler gösterilmemiştir). Özellikle, tarif edilen yöntem, Moleküler Tespit Sistemi tarafından 48 saatlik zenginleştirme kullanılarak tespit edilen 24 saat içinde pozitif suşları tanımlamada henüz başarısız olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Son olarak, bu protokolün ek bir yararı, bakteri türleriyle ilgili bilgi sağlayabilmesi ve Campylobacter'in C.coli, C. jejuni veya C. lari olup olmadığını belirleyebilmesidir, MLG 41.07'de kabul edilen MDS, Campylobacter için yalnızca ikili bir pozitif / negatif yanıt sağlayabilir.
Kritik adımlar
Campylobacter izolasyonu ve tanımlanması için protokol, santrifüjleme, filtrasyon ve moleküler analiz sırasında hassasiyet gerektirir. Doğru seyreltmeler, uygun inkübasyon koşulları ve qPCR test koşullarına titiz bir şekilde uyulması, güvenilir tür tanımlaması için çok önemlidir.
Mikroaerofilik bir bakteri olarak, Campylobacter çok kırılgandır ve çeşitli çevresel streslere karşı hassastır ve büyüme için benzersiz titiz koşullar gerektirir 31,32,33. Tipik olarak uzun süreli taşıma ve depolamaya tabi tutulan gıda örneklerinde, birçok Campylobacter hücresi belki de uyku halindedir veya öldürücü / ölümcül yaralı durumdadır 34,35. Bu nedenle, stresli hücreleri besin matrislerinden kurtarmak ve daha yüksek bir konsantrasyona büyütmek önemlidir. İşlemin ilk adımında, Campylobacter'in gıdalardan seçici olarak zenginleştirilmesi için laked at kanı ve antibiyotiklerle desteklenmiş Bolton Broth kullandık. Ek kan, serbest oksijen radikallerinin olumsuz etkilerinin üstesinden gelmek için bir oksijen söndürme maddesi olarak görev yaptı36. Antibiyotikler, arka plan mikroflorasının büyümesini engellemek için kullanıldı37.
Campylobacter'in ortamdaki atmosferik oksijene maruz kalma süresini en aza indirmek için, hücrelerin filtreden geçmesine izin vermek için 15 dakikalık bir inkübasyon süresi seçildi. Ayrıca, filtrenin altındaki Brucella agar plakasının nemi geçiş hızında önemli bir rol oynamıştır. Spesifik olarak, 0 saat, 1 saat, 2 saat ve 3 saat boyunca kurutulan agar plakalarının test edilmesinden elde edilen sonuçlar, filtredeki yüksek nem içeriğinin hücrelerin geçmesini engellediğini göstermiştir. Aynı derecede kritik olan, her ikisi de hücrelerin izole edilmesinin başarısını etkileyen filtrelerin ve damlaların plakalara ve filtrelere hassas bir şekilde yerleştirilmesidir.
Olası tuzaklar ve sınırlamalar
Campylobacter türlerini çiğ tavuk örneklerinden izole etmek ve tanımlamak için yapılandırılmış bir yaklaşım sunarken, bu protokolün bazı sınırlamaları dikkati hak ediyor. Dış kontaminasyon, yeterince kurutulmamış plakalar, mikrobiyal hareketi engelleyen filtrelerin tıkanması, mikroorganizmaların pelet içinde hapsolması, atmosferik odanın tam sızdırmazlığı ve filtre sınırlarının ötesine yayılan damlalar başlıca tuzaklar arasındadır.
Mikroorganizmaların gıda yüzeylerinden yetersiz ayrılması veya numunenin kütlesi içinde hapsedilmesi, bu yöntem kullanılarak izolasyonlarını engelleyebilir. Ek olarak, pasif filtrelerden geçiş için mikrobiyal hareketliliğe güvenmek dikkate değer bir sınırlama sunar; filtrelerin gıdalardaki mikrobiyal patojenlerin yakalama etkinliğini azaltabileceği gösterildiğinden, filtre membranlarının daha az hareketli Campylobacter suşlarını tutması mümkündür38. Diğer sınırlamalar, santrifüjleme ve filtrasyon işlemlerinin parti yapısını, filtre tıkanmasına yatkınlığı ve oluşan peletin dağıtılmasındaki verimsizliği kapsar, bu da mikrobiyal yüklerin doğruluğunu etkileyecektir. Bu sınırlamalar, özellikle çeşitli numune türleriyle uğraşırken veya yüksek verimli yetenekler ararken, kapsamlı analiz sağlamada dikkatli olunması ve tamamlayıcı metodolojilere duyulan ihtiyacı toplu olarak vurgulamaktadır.
Sorun giderme önerileri
Olası sorunları önlemek için, öncelikle tüm malzemelerin gerekli kalite standartlarına uygun olduğundan ve son kullanma tarihinin geçmediğinden emin olun. Campylobacter'in nitroselüloz membrandan geçişini kısıtlayabilecek büyük kirleticileri gidermek için potansiyel olarak ek bir filtreleme kullanarak tıkalı filtreleri giderin. Kirlenme gözlenirse, damlaların filtrenin kenarına çok yakın yerleştirilmediğini ve gözeneklerin aksine filtrenin etrafından geçerek sıvının agar'a ulaşmasına izin verildiğini doğrulayın. Zenginleştirmeyi takiben yetersiz büyüme varsa, atmosferik kapların contalarının sıkı olduğunu ve sızıntı yapmadığını doğrulayın.
Potansiyel iyileştirme ve genişletme
Alternatif filtre malzemelerinin araştırılması, mikrobiyal geçişi artırabilir ve bu protokolün, gıda gibi heterojen karışımlardan diğer hareketli mikroorganizmaların izole edilmesinde kullanılmak üzere genişletilmesini sağlayabilir. Özgüllüğü olumsuz etkilemeden daha az hareketli Campylobacter varyantlarını korumak için kontrollerin tanımlanması tavsiye edilir. Ek olarak, bu çalışmada kullanılan çoğullanmış qPCR testinin C.lari'yi tespit etme yeteneğine sahip olduğu gösterilmiş olsa da, ilgilenilen diğer 18 Campylobacter türü bu teste dahil edilebilir.
Özetle, farklı parametreler ve ortamlar değerlendirilerek, gıdalardan C. jejuni ve C. coli'nin filtre bazlı izolasyonu ve tür düzeyinde tanımlanması için uygun koşullar oluşturulmuştur. Yöntemin hassas, spesifik, sağlam ve uygun maliyetli olduğu kanıtlanmıştır. Protokol, gerçek gıda örneklerine uygulayarak, 79 et paketinden 36 C. jejuni ve 13 C. coli suşunu izole edebildi.
Protokol, çiğ tavuk parçası örneklemesi prosedürünü özetleyen FSIS Direktifi 10,250.117 ve Campylobacter'in izolasyonu ve tanımlanması için MLG 41.076 ile uyumludur. Veriler, numunenin 4 kat konsantre edilmesinin ve 24 saat boyunca zenginleştirilmesinin, filtrasyon ve kaplama ile birleştiğinde, 96 saat yerine 48 saat içinde izole edilmiş, doğrulanmış koloniler verdiğini göstermektedir. Protokol, antimikrobiyal direnç profilleri, virülans tahminleri ve filogenetik ilişkileri dahil olmak üzere Campylobacter suşlarının kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlamak için genom dizilimi gibi DNA tabanlı yöntemlerle uyumludur. Protokol, epidemiyolojik çalışmaları ve halk sağlığı müdahalelerini kolaylaştırabilecek çiğ kümes hayvanlarından Campylobacter spp.'nin verimli bir şekilde geri kazanılması ve izolasyonu için umut verici bir alternatifi temsil etmektedir.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu araştırma, ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi (USDA-ARS), Ulusal Program 108, Güncel Araştırma Bilgi Sistemi numaraları 8072-42000-093 ve 8072-42000-094-000-D tarafından desteklenmiştir. USDA, fırsat eşitliği sağlayıcısı ve işverenidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
- Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34 (2019).
- Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
- Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111 (2019).
- Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
- Department of Food Administration.
- USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
- Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
- Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
- Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
- Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482 (2023).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M.
- Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
- Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
- Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
- Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
- Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
- USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
- He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
- Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
- Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
- Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
- Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
- Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
- Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
- Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
- Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
- He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
- Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
- Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P.
- Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
- Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
- Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751 (2015).
- Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
- Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
- Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
- Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
- Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
- Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636 (2019).
