Summary
Campylobacter es la principal causa de gastroenteritis bacteriana transmitida por los alimentos en todo el mundo. A pesar de que los establecimientos adoptan medidas para reducir la prevalencia en sus instalaciones, los productos contaminados llegan constantemente a los consumidores. La técnica desarrollada durante los últimos doce años aborda las limitaciones de los métodos existentes para aislar y detectar Campylobacter spp. de la carne cruda.
Abstract
Este artículo presenta un protocolo rápido pero robusto para aislar Campylobacter spp. de carnes crudas, centrándose específicamente en Campylobacter jejuni y Campylobacter coli. El protocolo se basa en métodos establecidos, lo que garantiza la compatibilidad con las técnicas predominantes empleadas por organismos reguladores como la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) en los Estados Unidos, así como la Organización Internacional de Normalización (ISO) en Europa. Un elemento central de este protocolo es la recolección de un enjuague, que se concentra y se resuspende en medios de caldo Bolton que contienen sangre de caballo. Se ha demostrado que este medio facilita la recuperación de las células Campylobacter estresadas y reduce la duración del enriquecimiento requerido en un 50%. A continuación, las muestras enriquecidas se transfieren a membranas de nitrocelulosa en placas de brucella. Para mejorar la sensibilidad y especificidad del método, se evaluaron membranas filtrantes de 0,45 μm y 0,65 μm con tamaño de poro. Los datos revelaron un aumento de 29 veces en la recuperación celular con el filtro de tamaño de poro de 0,65 μm en comparación con el tamaño de poro de 0,45 μm sin afectar la especificidad. Las características altamente móviles de Campylobacter permiten que las células se muevan activamente a través de los filtros de membrana hacia el medio de agar, lo que permite un aislamiento efectivo de las colonias puras de Campylobacter . El protocolo incorpora un ensayo cuantitativo múltiple de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (mqPCR) para identificar los aislados a nivel de especie. Esta técnica molecular ofrece un medio fiable y eficaz de identificación de especies. Las investigaciones llevadas a cabo durante los últimos doce años con carnes al por menor han demostrado la capacidad de este método para mejorar la recuperación de Campylobacter a partir de muestras de carne contaminadas de forma natural en comparación con los métodos de referencia actuales. Además, este protocolo cuenta con un tiempo de preparación y procesamiento reducido. Como resultado, presenta una alternativa prometedora para la recuperación eficiente de Campylobacter de la carne. Además, este procedimiento puede integrarse perfectamente con métodos basados en el ADN, lo que facilita la detección rápida de muestras positivas junto con un análisis exhaustivo de la secuenciación del genoma completo.
Introduction
Campylobacter spp. es la principal causa de gastroenteritis bacteriana transmitida por los alimentos en todo el mundo, con un estimado de 800 millones de casos al año1. Como una bacteria zoonótica importante, Campylobacter coloniza naturalmente el tracto gastrointestinal de una amplia gama de animales, incluidas avessilvestres, animales de granja y mascotas. Durante el sacrificio o el procesamiento de alimentos, Campylobacter spp. contamina con frecuencia canales o productos cárnicos3. La campilobacteriosis generalmente se asocia con el consumo de aves de corral poco cocidas o la contaminación cruzada de otros alimentos por jugos crudos de avesde corral 2. Puede causar complicaciones graves, como el síndrome de Guillain-Barré, artritis reactiva y septicemia en personas inmunodeprimidas4. La detección y el aislamiento de Campylobacter de las fuentes alimentarias, especialmente de los productos avícolas, es esencial para la vigilancia de la salud pública, la investigación de brotes y la evaluación de riesgos.
Los métodos convencionales basados en cultivos son los métodos tradicionales y estándar para la detección de Campylobacter 5,6. Sin embargo, existen varias limitaciones, como los largos tiempos de incubación (48 h o más), la baja sensibilidad (hasta el 50%) y no son inclusivas para todas las cepas (es posible que algunas células de Campylobacter estresadas no crezcan bien o no crezcan en absoluto en el medio)7. Los métodos moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), son más rápidos y sensibles que los métodos basados en cultivos, pero no proporcionan aislados viables para su posterior caracterización 8,9.
Los métodos inmunológicos son métodos alternativos y complementarios para la detección de Campylobacter . Estos son rápidos, simples y versátiles, pero también tienen varias limitaciones, incluida la reactividad cruzada (algunos anticuerpos pueden unirse a bacterias que no son Campylobacter u otras sustancias que comparten antígenos similares), baja especificidad (algunos anticuerpos pueden no unirse a todas las cepas o serotipos de Campylobacter ) y requisitos de preparación de muestras (los métodos inmunológicos a menudo requieren un tratamiento previo de las muestras para eliminar las sustancias que interfieren y mejorar la unión de los anticuerpos)10.
Dentro del género Campylobacter, C. jejuni y C. coli causan la mayoría de las infecciones humanas por Campylobacter (81% y 8,4%, respectivamente)11. Ambas son bacterias en forma de espiral, microaerofílicas y termófilas que contienen un flagelo unipolar o flagelo bipolar. La rotación de un flagelo en cada polo se considera la principal fuerza impulsora de su característica motilidad en sacacorchos y crucial para su patogénesis, ya que permite que la bacteria nade a través de la mucosa viscosa del tracto gastrointestinal del huésped. La motilidad de Campylobacter está controlada por su sistema quimiosensorial que permite que las células se muevan hacia ambientes favorables12,13. Con base en la morfología celular y las características fisiológicas de Campylobacter, algunos estudios han utilizado la filtración por membrana para el aislamiento de Campylobacter spp. a partir de muestras fecales y ambientales 14,15,16.
Este estudio presenta un protocolo rápido y robusto para el aislamiento y posterior detección de C. jejuni y C. coli a partir de carne cruda, que supera los inconvenientes de los métodos existentes y ofrece varias ventajas. Las colonias tentativas pueden confirmarse como Campylobacter spp. utilizando una variedad de métodos, como microscopía, pruebas bioquímicas (p. ej., ensayos de actividad catalasa y oxidasa) o métodos moleculares6. El método identifica los aislados a nivel de especie mediante un ensayo de PCR múltiple en tiempo real (mqPCR) que se dirige a genes exclusivos de C. jejuni y C. coli. Este método es relativamente económico, rápido y selectivo, lo que lo hace adecuado para su uso en una variedad de entornos, incluidas instalaciones de procesamiento de alimentos, laboratorios clínicos y laboratorios de investigación.
Protocol
Todo el trabajo asociado con este protocolo debe realizarse dentro de una cabina de seguridad biológica (BSC) para mantener las condiciones asépticas y minimizar el riesgo de contaminación de la muestra o la exposición del operador a patógenos microbianos. Al transferir muestras fuera del BSC, utilice recipientes sellados para evitar derrames en caso de caídas accidentales, manteniendo la integridad de la muestra. Preferiblemente, se deben utilizar componentes desechables durante todo el procedimiento para mitigar la posibilidad de contaminación cruzada. En los casos en que los desechables no sean factibles, asegúrese de que todos los equipos y materiales estén estériles antes de su uso. La gestión adecuada de los residuos es crucial; Todos los componentes desechables usados deben desecharse como residuos de riesgo biológico. Esterilizar los materiales en autoclave antes de desecharlos para garantizar una esterilización adecuada y evitar la contención de materiales potencialmente peligrosos. El cumplimiento de estas precauciones no solo salvaguarda la integridad de la muestra, sino que también minimiza el riesgo de exposición del operador a patógenos microbianos. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo de la preparación de la muestra, el enriquecimiento selectivo, el aislamiento basado en filtros y la diferenciación por mqPCR de las especies de Campylobacter . El archivo complementario 1 muestra un flujo de trabajo e imágenes más detallados a lo largo del proceso.
1. Preparación de muestras de carne
- Adquisición de muestras de carne
- Adquiera varios paquetes de carne fresca, incluidos muslos, alitas, muslos e hígados de pollo de los minoristas locales.
- Transfiera todas las muestras al almacenamiento a 4 °C y procese dentro de las 24 horas posteriores a la recepción.
NOTA: El almacenamiento de las muestras frescas a temperaturas más bajas, como por debajo del punto de congelación, afectará la recuperación.
- Procesamiento de muestras de carne
- Siga la proporción de componentes prescrita dentro de la directriz de muestreodel FSIS 6,17.
- Corta 450 g de trozos de pollo de cada paquete y colócalos en una bolsa de estómago (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Se sugieren bolsas Stomacher porque tienen suficiente resistencia mecánica para garantizar los procesos posteriores y no se romperán ni tendrán fugas. - Prepare agua de peptona tamponada (BPW).
- Disolver 20 g del polvo (ver Tabla de Materiales) en 1 L de agua purificada. Autoclave la solución a 121 °C durante 15 min. Diluir la solución en agua estéril hasta una concentración del 0,1%.
- Agregue 200 ml de BPW al 0,1% a la bolsa del estómago que contiene el pollo.
- Masajear/palpar manualmente la muestra desde el exterior de la bolsa del estómago durante 2 min.
- Recoja todo el enjuague de pollo del lado filtrado de la bolsa con un controlador de pipeta motorizado (consulte la Tabla de materiales).
- Dispense el enjuague de pollo en botellas de centrífuga estériles. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Recoja cuidadosamente el sobrenadante con un controlador de pipeta motorizado con una pipeta de plástico serológica desechable de 25 ml. Evite perturbar el pellet.
- Repita el proceso según sea necesario para asegurarse de que se elimine todo el sobrenadante.
- Deseche el sobrenadante recolectado.
2. Enriquecimiento selectivo de Campylobacter a partir de carne cruda
- Preparación de Caldo Bolton con suplementos
- Disolver 13,8 g de polvo (ver Tabla de Materiales) en 500 mL de agua purificada. Esterilizar el caldo esterilizándolo en autoclave durante 15 min a 121 °C.
- Agregue 25 ml de sangre de caballo lacada (consulte la Tabla de materiales) al caldo Bolton esterilizado de 500 ml.
NOTA: La adición de sangre de caballo actúa como un agente de enfriamiento de oxígeno para ayudar en la recuperación de las células lesionadas de Campylobacter de la matriz alimentaria. - Reconstituir 1 vial de suplemento antibiótico (cefoperazona, cicloheximida, trimetoprima y vancomicina, ver Tabla de Materiales) en 5 mL de etanol al 50%.
- Agregue el suplemento antibiótico reconstituido al caldo Bolton.
- Procedimiento de enriquecimiento
- Vuelva a suspender el gránulo en 50 ml de caldo Bolton que contenga sangre de caballo y antibióticos.
- Coloque las muestras (con las tapas aflojadas) dentro de un recipiente sellado que mantenga una mezcla de gases de 85% de N2, 10 % de CO2 y 5 % deO2.
- Asegúrese de que la tapa esté suelta, pero que el recipiente esté herméticamente sellado para producir los requisitos de crecimiento microaerófilo y termófilo de Campylobacter.
NOTA: Los paquetes de gas que mantienen una atmósfera de 85% deN2, 10% de CO2 y 5% deO2 se pueden usar cuando no se dispone de cámaras ambientales. - Incubar las muestras a 42 °C durante 24 h.
- Asegúrese de que la tapa esté suelta, pero que el recipiente esté herméticamente sellado para producir los requisitos de crecimiento microaerófilo y termófilo de Campylobacter.
3. Aislamiento y purificación de C. jejuni y C. coli a partir de pollo crudo
- Preparación de placas de agar Brucella
- Disolver 28 g de polvo de Brucella (ver Tabla de Materiales) en 1 L de agua purificada. Disolver 15 g de agar en la solución de Brucella.
- Esterilizar el agar Brucella esterilizándolo en autoclave durante 15 min a 121 °C. Enfriar la mezcla de agar medio en un baño de agua a 55 °C.
- Vierta 20 ml de agar Brucella en cada placa de Petri de 100 mm de diámetro.
- Método de filtrado y cultivo de colonias
- Evaluar el efecto de la humedad sobre el paso de Campylobacter a través de los filtros secando placas de agar Brucella con tapas abiertas en una cabina de bioseguridad durante 0 h, 1 h, 2 h y 3 h.
- Prepare un control sin filtro esparciendo directamente 80 μL de la muestra en la placa de agar Brucella.
- Coloque un filtro de acetato de celulosa (0,45 μm o 0,65 del tamaño de los poros, consulte la tabla de materiales) en el centro de una placa de agar Brucella.
- Pipetear 4 gotas/filtro y 20 μL/gota de muestra enriquecida en el filtro.
- Coloque las gotas cerca del centro del filtro para asegurarse de que el líquido que llega a la placa pase a través del filtro, no alrededor del filtro.
- Coloque las gotas de una manera que asegure que no se esparzan ni se agreguen.
- Incubar las gotas a temperatura ambiente durante 15 minutos y retirar con cuidado los filtros.
NOTA: Este paso permite tiempo suficiente para que las células de Campylobacter atraviesen la membrana y alcancen el medio de agar sin un secado excesivo. - Incubar las placas a 42 °C durante aproximadamente 24 h en las condiciones microaeróbicas descritas anteriormente.
- Escoge colonias características de Campylobacter con rasgos específicos.
NOTA: Las colonias de Campylobacter suelen ser redondas con bordes lisos, brillantes y de color amarillento o rosado translúcido6. - Coloque las colonias en placas de agar Brucella para su purificación. Repita este paso hasta obtener placas con una sola morfología de colonia uniforme.
- Prepare las muestras para su almacenamiento a largo plazo.
- Prepare el caldo Bolton como se describió anteriormente. Agregue una colonia de la placa con una morfología de colonia uniforme.
- Crece durante la noche (24 h) en condiciones microaerófilas descritas anteriormente. Añadir 900 μL del cultivo nocturno a un criovial de 2 mL que contenga 100 μL de DMSO.
- Enfriar rápidamente en un baño de hielo seco y etanol (aprox. -72 °C) durante 10 min. Transfiera a un congelador a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
4. Identificación de las especies de C. jejuni y C. coli
- Realizar la identificación a nivel de especie de C. jejuni y C. coli utilizando un ensayo de qPCR múltiple (mqPCR) previamente desarrollado18,19.
- Realice una rápida lisis celular y extracción de ADN genómico en un formato de placa de 96 pocillos.
NOTA: Se recomienda encarecidamente considerar el uso de kits comerciales (ver Tabla de Materiales) para asegurarse de que la muestra esté suficientemente libre de inhibidores conocidos de la PCR.- Disperse las colonias purificadas de Campylobacter en 100 μL de solución de extracción.
- Lisar las muestras a 99 °C durante 10 min seguido de enfriar a 20 °C durante 2 min en un termociclador.
- Centrifugar la placa a 8.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Extraer 2 μL de alícuotas del sobrenadante para el ensayo de mqPCR.
- Prepare una mezcla de reacción de 20 μL que consista en 10 μL de 2x Master Mix, 2,0 μL de muestra de ADN, 104 copias de la plantilla de control de amplificación interna (IAC) y 200 nM de cada cebador y sonda (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Los cebadores y las sondas de hipO y cdtA son los genes diana exclusivos de C. jejuni y C. coli, respectivamente. El IAC consiste en un segmento de ADN de 79 pb del adenovirus humano y se incluye como control positivo para garantizar una actividad constante de la ADN polimerasa en todas las muestras.
- Cargue todas las muestras por triplicado en una placa óptica de 96 pocillos cubierta con una película óptica y colóquelas en un sistema de PCR en tiempo real (consulte la tabla de materiales).
- Iniciar una activación de arranque en caliente de la ADN polimerasa a 95 °C durante 10 min. A continuación, se realizaron 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s y recocido/extensión a 60 °C durante 1 min.
- Realice una rápida lisis celular y extracción de ADN genómico en un formato de placa de 96 pocillos.
5. Enumerar las suspensiones celulares
- Enumere las suspensiones celulares utilizando un procedimiento de placa descendente de 6 x 620. Consulte el Archivo Suplementario 1 para ver imágenes que muestran el método de placa de caída de 6 x 6.
- Secar al aire las placas de agar Brucella sin tapa en una campana de flujo laminar durante 45 min.
- Agregue 200 μL de suspensión bacteriana a seis filas (A-F) en la primera columna de una placa de 96 pocillos.
- Distribuir 180 μL de medio Brucella en seis filas de las columnas restantes (2-12).
- Prepare diluciones seriadas diez veces más utilizando transferencias de 20 μL.
- Por ejemplo, transfiera 20 μL de muestra de la columna uno a la columna dos. Repita este proceso para un mínimo de 6 columnas.
- Reflux mix cada suspensión diez veces usando la pipeta, cambiando las puntas entre cada transferencia.
- Utilice una pipeta multicanal para depositar gotas de 7 μL de seis filas de una columna en la superficie de una placa de agar Brucella.
- Repita el procedimiento para crear una matriz de 6 x 6, asegurándose de que las filas sean réplicas técnicas en todas las columnas.
- Seque las placas al aire durante 5 minutos y luego invierta la placa. Incubar las placas a 42 °C durante 24 h.
- Cuente el número de colonias en cada dilución representativa.
Representative Results
Efecto de la humedad en placas de agar Brucella para la filtración pasiva de Campylobacter
Campylobacter tiene un genoma pequeño y carece de varios genes de respuesta al estrés que ocurren comúnmente en otras bacterias, como E. coli O157:H7 y Salmonella. Por lo tanto, es más sensible a diversas tensiones ambientales y no puede tolerar la deshidratación ni los niveles de oxígeno ambiental. Por el contrario, un medio de agar demasiado húmedo puede inundar el filtro. Esto no solo provoca la difusión de la muestra hacia el exterior del filtro, sino que también aumenta el tiempo de exposición al oxígeno21.
Para determinar las condiciones apropiadas para el aislamiento de Campylobacter basado en filtros, las placas de agar Brucella se secaron con las tapas retiradas durante 0 h, 1 h, 2 h y 3 h dentro de una cabina de seguridad biológica y se evaluó la eficiencia de las células Campylobacter para atravesar un filtro de tamaño de poro de 0,65 μm. Se pipetearon cuatro alícuotas de 20 μL de cultivos de C. jejuni S27 a concentraciones de 1,53 x 104 y 1,53 x 105 UFC/ml en cada membrana filtrante que se había colocado encima de una placa de Brucella. Después de 15 minutos de penetración, se retiraron los filtros y se incubaron las placas durante la noche para el crecimiento celular.
A continuación, se contaron las células de 5 placas replicadas y se anotaron en la Tabla 1. Los resultados indicaron que las placas de agar secadas durante 2 h y 3 h se comportaron de manera similar con un número casi igual de células recuperadas de la filtración pasiva. Notablemente, las placas secadas en estas condiciones durante 0 h y 1 h no permitieron que las células atravesaran completamente la membrana dentro del período de tiempo de 15 minutos utilizado.
Comparación de diferentes membranas filtrantes del tamaño de los poros para aislar Campylobacter de hígados de pollo
Teniendo en cuenta el tamaño de las células de Campylobacter (0,5-5 μm de longitud y 0,2-0,9 μm de ancho) y una amplia gama de tamaños de partículas de alimentos, se probaron filtros de acetato de celulosa con tamaños de poro de 0,45 μm y 0,65 μm para determinar la eficiencia del paso de Campylobacter cuando se les dio un tiempo de incubación de 15 minutos. Para el experimento se utilizaron muestras de alimentos que consistían en 450 g de hígados de pollo enriquecidos con 153 UFC de C. jejuni y luego enriquecidos durante la noche. Como control sin filtro, se incluyó en paralelo el recubrimiento directo de la muestra de enriquecimiento. Los resultados (Figura 2) de 5 placas replicadas mostraron consistentemente que el filtro de tamaño de poro de 0,65 μm permitió que atravesaran más células que los filtros de tamaño de poro de 0,45 μm, lo que resultó en aumentos de ~ 29 veces más células obtenidas. El filtro de tamaño de poro de 0,45 μm retuvo demasiadas células en la parte superior del filtro, lo que resultó en una recuperación significativamente menor de Campylobacter de los alimentos en comparación con el filtro de tamaño de poro de 0,65 μm. Como era de esperar, había un césped de diferentes organismos de fondo que crecían en las placas de control sin filtro.
Aplicación de la filtración pasiva en el aislamiento de Campylobacter de pollo al por menor
Debido a la motilidad inusual de las células Campylobacter , se seleccionó la técnica de filtración pasiva para el aislamiento de C. jejuni y C. coli de productos cárnicos minoristas, que suelen estar contaminados con numerosos organismos de fondo. Entre los años 2014-2023, se recolectaron un total de 79 paquetes de carne cruda, incluidas diferentes partes de carne de pollo, hígados de pollo, hígados de res e hígados de ternera, de varios supermercados locales. De cada envase se muestrearon 450 g para el aislamiento de Campylobacter spp. Mediante la combinación del enriquecimiento selectivo de Campylobacter en el caldo de Bolton que contiene sangre y la filtración pasiva de las células a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,65 μm de tamaño de poro directamente sobre una placa de agar Brucella, se han aislado con éxito 49 cepas de Campylobacter de 79 muestras de carne (Tabla 2). La Figura 3 representa el resultado de aislar una nueva cepa de Campylobacter de hígados de pollo. Se ha demostrado repetidamente que el método es sensible, específico y rentable.
Identificación y diferenciación de aislados de C. jejuni y C. coli
Para verificar el género y diferenciar las especies de aislados de Campylobacter obtenidos a partir de carne cruda, se empleó un ensayo de qPCR múltiple que amplificó las dianas génicas específicas (hipO y cdtA) para C. jejuni y C. coli, y un control de amplificación interna (IAC). El IAC se incluyó como un indicador falso negativo en la amplificación concurrente de múltiples genes. El ensayo se implementó en un formato de 96 pocillos con lisis celular rápida y extracción de ADN utilizando un reactivo disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). En la Tabla 2 se resume el resultado de la identificación de las especies de las cepas de C. jejuni y C. coli . Como verificación adicional, los resultados de la secuenciación del genoma completo confirmaron las especies de todos los aislados (datos no mostrados).
Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo para el aislamiento e identificación de especies de Campylobacter a partir de carne vendida al por menor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Impacto del tamaño del filtro en la recuperación de Campylobacter. Los resultados indican que el filtro de 0,65 μm puede recuperar un promedio de 900 ± 138 colonias, mientras que el filtro de 0,45 μm recupera 31 ± 7 colonias. Los resultados se generaron a partir de N = 20 (5 placas con 4 gotas/placa) y una prueba t de Student indica que las medias son estadísticamente diferentes (p < 0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aislamiento de Campylobacter mediante filtración pasiva de muestras de aves de corral enriquecidas. (A) Representa las cuatro gotas de 20 μL de muestra enriquecida depositadas en el filtro de membrana de nitrocelulosa. La imagen fue recolectada durante los 15 min de filtración pasiva. (B) Representa la placa después de que se retiró el filtro de nitrocelulosa. Los cuatro puntos indican dónde atravesó la membrana la muestra enriquecida. (C) Representa la placa después de 24 h de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Efecto del tiempo de secado de las placas de agar Brucella sobre la filtración pasiva de C. jejuni. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Cepas de C. jejuni y C. coli aisladas de carne cruda. Durante el período de tiempo comprendido entre 2008 y 2023, se aislaron 36 cepas de C. jejuni y 13 de C. coli de 79 paquetes de carne en 24 productos minoristas únicos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Archivo complementario 1: Imágenes a lo largo de los procesos de aislamiento y enumeración. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Importancia del protocolo
C. jejuni y C. coli fueron las dos especies principales de Campylobacter que prevalecieron en aves de corral22 y en hígados de animales23,24. En este estudio, las muestras de carne de partes de pollo (patas, alas y muslos), hígados de pollo e hígados de res se recolectaron aleatoriamente durante diferentes períodos de tiempo y de diferentes tiendas minoristas y fabricantes para el aislamiento de Campylobacter spp. Del total de 49 cepas de Campylobacter aisladas, 36 fueron identificadas como C. jejuni y 13 como C. coli, sin que se encontrara ninguna otra especie de Campylobacter, lo que es consistente con otros informes25.
El ensayo se basa en la morfología celular en forma de espiral y la motilidad característica en forma de sacacorchos de Campylobacter spp. Se utilizó una técnica de filtración pasiva simple, pero efectiva,26,27 que aprovechó su morfología celular en forma de espiral (larga, delgada, 0,2-0,9 por 0,5-5 μm) y una fuerte motilidad en sacacorchos para separar Campylobacter de una mezcla de organismos de fondo. La alta motilidad de Campylobacter permitió que las células atravesaran los filtros de membrana y avanzaran hacia condiciones favorables que se encuentran dentro del medio de agar, mientras que otros microorganismos de fondo de los productos cárnicos no pudieron pasar. Este método es relativamente económico, rápido y selectivo, lo que lo hace adecuado para su uso en una variedad de entornos, incluidas instalaciones de procesamiento de alimentos, laboratorios clínicos y laboratorios de investigación.
Un artículo pionero, a menudo citado, afirma que el filtro de 0,45 μm funcionó tan bien que no se evaluó 0,65 μm28. Los resultados de este estudio indican que el filtro de tamaño de poro de 0,65 μm funcionó significativamente mejor que el tamaño de poro de 0,45 μm, lo que resultó en un aumento de 29 veces en el número de células recuperadas del enriquecimiento. Esto es importante porque los filtros seleccionados no muestran una selectividad reducida como se informó anteriormente29. Además, como se sabe que el filtrado reducirá significativamente la cantidad de Campylobacter recuperado en comparación con la siembra directa30, por lo tanto, el aumento del tamaño del poro mejora la recuperación del microorganismo, lo que es consistente con los hallazgos reportados previamente21. Esto es significativo porque todas las células que atravesaron los filtros formaron colonias uniformes de Campylobacter , lo que indica que ambos filtros fueron suficientes para evitar el paso de otras microflora y partículas de alimentos. Además, el diagrama de flujo7 del FSIS señala el potencial de una producción de resultados extendida debido a la repetición de las líneas aisladas en las placas Campy-Cefex que contienen antibióticos. Por el contrario, el protocolo descrito en este manuscrito, que combina el uso de filtración y enriquecimiento selectivo con cefoperazona, cicloheximida, trimetoprima y vancomicina, no ha requerido la repetición de las rayas.
El método actual empleado es consistente con los actuales programas de Muestreo y Verificación del FSIS17. Como el nivel de contaminación por Campylobacter puede ser bajo (153 UFC/450 g de pollo), el enjuague se centrifuga para concentrar la muestra en un factor de cuatro, lo que aumenta la sensibilidad del ensayo. Después de concentrar el enjuague por un factor de 4x, las muestras se enriquecen durante 48 h y se analizan con el Sistema de Detección Molecular (MDS) para replicar el método empleado por los laboratorios del FSIS (datos no mostrados). En particular, el método descrito aún no ha logrado identificar cepas positivas dentro de las 24 h que fueron detectadas por el Sistema de Detección Molecular utilizando 48 h de enriquecimiento (datos no mostrados). Por último, un beneficio adicional de este protocolo es que puede proporcionar información relacionada con las especies bacterianas e identificar si el Campylobacter es C. coli, C. jejuni o C. lari, mientras que el MDS adoptado en MLG 41.07 solo puede proporcionar una respuesta binaria positiva/negativa para Campylobacter.
Pasos críticos
El protocolo para el aislamiento e identificación de Campylobacter requiere precisión durante la centrifugación, la filtración y el análisis molecular. Las diluciones precisas, las condiciones de incubación adecuadas y el cumplimiento meticuloso de las condiciones del ensayo qPCR son fundamentales para una identificación fiable de las especies.
Como bacteria microaerofílica, Campylobacter es muy frágil y sensible a diversas tensiones ambientales y requiere condiciones exigentes únicas para su crecimiento 31,32,33. En las muestras de alimentos que suelen someterse a largos períodos de transporte y almacenamiento, muchas células de Campylobacter se encuentran quizás en un estado de latencia o lesión subletal/letal34,35. Por lo tanto, es importante recuperar las células estresadas de sus matrices alimentarias y hacerlas crecer a una concentración más alta. En el primer paso del procedimiento, utilizamos caldo Bolton suplementado con sangre de caballo y antibióticos para el enriquecimiento selectivo de Campylobacter a partir de los alimentos. La sangre aditiva sirvió como agente de enfriamiento de oxígeno para superar los efectos adversos de los radicales libres de oxígeno36. Los antibióticos se utilizaron para inhibir el crecimiento de la microflora de fondo37.
Para minimizar el tiempo de exposición de Campylobacter al oxígeno atmosférico ambiental, se seleccionó un período de incubación de 15 minutos para permitir que las células atravesaran el filtro. Además, la humedad de la placa de agar Brucella debajo del filtro jugó un papel importante en la velocidad de paso. Específicamente, los resultados de las pruebas de placas de agar secadas durante 0 h, 1 h, 2 h y 3 h sugirieron que un alto contenido de humedad en el filtro impedía el paso de las células. Igualmente importante es la colocación precisa de filtros y gotas en las placas y filtros, ya que ambos influyen en el éxito del aislamiento de las células.
Posibles escollos y limitaciones
Si bien se presenta un enfoque estructurado para aislar e identificar especies de Campylobacter a partir de muestras de pollo crudo, varias limitaciones de este protocolo merecen atención. La contaminación externa, las placas insuficientemente secas, la obstrucción de los filtros que impiden el movimiento microbiano, el atrapamiento de los microorganismos dentro del gránulo, el sellado incompleto de la cámara atmosférica y las gotas que se extienden más allá de los límites del filtro se encuentran entre los principales escollos.
La separación inadecuada de los microorganismos de las superficies de los alimentos o su confinamiento dentro de la mayor parte de la muestra puede dificultar su aislamiento mediante este método. Además, confiar en la motilidad microbiana para atravesar filtros pasivos presenta una limitación notable; es posible que las membranas filtrantes retuvieran algunas cepas de Campylobacter menos móviles, ya que se ha demostrado que los filtros pueden reducir la eficiencia de captura de patógenos microbianos en los alimentos38. Otras limitaciones abarcan la naturaleza por lotes de los procesos de centrifugación y filtración, la susceptibilidad a la obstrucción del filtro y la ineficiencia en la dispersión del gránulo formado, lo que afectará la precisión de las cargas microbianas. Estas limitaciones enfatizan colectivamente la necesidad de precaución y metodologías complementarias para garantizar un análisis exhaustivo, especialmente cuando se trata de diversos tipos de muestras o se buscan capacidades de alto rendimiento.
Sugerencias para la solución de problemas
Para evitar posibles problemas, asegúrese inicialmente de que todos los materiales cumplan con los estándares de calidad necesarios y no hayan caducado. Solucione los problemas de los filtros obstruidos mediante el empleo potencial de una filtración adicional para eliminar cualquier contaminante grande que pueda restringir el paso del Campylobacter a través de la membrana de nitrocelulosa. Si se observa contaminación, verifique que las gotas no se colocaron demasiado cerca del borde del filtro y permitieron que el líquido llegara al agar rodeando el filtro en lugar de a través de los poros. Si no hay suficiente crecimiento después del enriquecimiento, verifique que los sellos de los recipientes atmosféricos estén herméticos y no tengan fugas.
Potencial de refinamiento y expansión
La exploración de materiales filtrantes alternativos puede mejorar el recorrido microbiano y permitir que este protocolo se amplíe para su uso en el aislamiento de otros microorganismos móviles de mezclas heterogéneas como los alimentos. Es aconsejable identificar controles para retener variantes de Campylobacter menos móviles sin afectar negativamente la especificidad. Además, si bien se demostró que el ensayo de qPCR multiplexado utilizado en este estudio tiene la capacidad de detectar C.lari, se pueden incluir otras 18 especies de Campylobacter de interés dentro de este ensayo.
En resumen, a través de la evaluación de diferentes parámetros y entornos, se establecieron las condiciones apropiadas para el aislamiento basado en filtros y la identificación a nivel de especie de C. jejuni y C. coli a partir de alimentos. Se ha demostrado que el método es sensible, específico, robusto y rentable. Al aplicarlo a muestras de alimentos reales, el protocolo pudo aislar 36 cepas de C. jejuni y 13 C. coli de 79 paquetes de carne.
El protocolo está alineado con la Directiva FSIS 10.250.117, que describe el procedimiento para el muestreo de partes de pollo crudo, y MLG 41.07-6 para el aislamiento e identificación de Campylobacter. Los datos sugieren que concentrar la muestra en 4 veces y enriquecerla durante 24 h, junto con la filtración y el enchapado, produce colonias aisladas y confirmadas en 48 h en lugar de 96 h. El protocolo es compatible con métodos basados en el ADN, como la secuenciación del genoma, para proporcionar una caracterización completa de las cepas de Campylobacter, incluidos sus perfiles de resistencia a los antimicrobianos, las predicciones de virulencia y las relaciones filogenéticas. El protocolo representa una alternativa prometedora para la recuperación y el aislamiento eficiente de Campylobacter spp. de aves crudas, lo que puede facilitar los estudios epidemiológicos y las intervenciones de salud pública.
Disclosures
Todos los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola (USDA-ARS), Programa Nacional 108, Sistema de Información de Investigación Actual números 8072-42000-093 y 8072-42000-094-000-D. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica una recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés) es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
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