Summary
カンピロバクター は、世界中の細菌性食品媒介性胃腸炎の主な原因です。施設が施設全体の蔓延を減らすための対策を講じているにもかかわらず、汚染された製品は一貫して消費者に届いています。過去12年間に開発されたこの技術は、生肉から カンピロバクター 属菌を分離・検出するための既存の方法の限界に対処しています。
Abstract
本稿では、カン ピロバクター 属菌を生肉から分離するための迅速かつ堅牢なプロトコルについて、特に カンピロバクター・ジェジュニ と カンピロバクター・コリに焦点を当てて紹介します。このプロトコルは、確立された方法に基づいて構築されており、米国の食品医薬品局(FDA)や米国農務省(USDA)、ヨーロッパの国際標準化機構(ISO)などの規制機関で採用されている一般的な技術との互換性を確保しています。 このプロトコルの中心となるのは、リンセートを採取し、それを濃縮し、馬の血液を含むボルトンブロス培地に再懸濁することです。この培地は、ストレスを受けた カンピロバクター 細胞の回収を促進し、必要な濃縮期間を50%短縮することが証明されています。濃縮されたサンプルは、ブルセラプレート上のニトロセルロースメンブレンに移されます。分析法の感度と特異性を向上させるために、0.45 μmおよび0.65 μmの孔径のフィルターメンブレンを評価しました。データによると、0.65 μmのポアサイズフィルターでは、0.45 μmのポアサイズと比較して、特異性に影響を与えることなく細胞回収率が29倍向上することが明らかになりました。 カンピロバクター の運動性の高い特性により、細胞はメンブレンフィルターを通って寒天培地に向かって活発に移動できるため、純粋な カンピロバクター コロニーを効果的に単離することができます。このプロトコルには、マルチプレックス定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(mqPCR)アッセイが組み込まれており、種レベルで分離株を同定します。この分子技術は、信頼性が高く効率的な種同定の手段を提供します。過去 12 年間に実施された小売食肉に関する調査では、この分析法が、現在の参照方法と比較して、自然に汚染された肉サンプルからの カンピロバクター の回収率を高める能力があることが実証されています。さらに、このプロトコルは、準備と処理時間の短縮を誇っています。その結果、肉から カンピロバクター を効率的に回収するための有望な代替品を提示します。 さらに、この手順はDNAベースの方法とシームレスに統合できるため、包括的な全ゲノムシーケンシング解析とともに、陽性サンプルの迅速なスクリーニングが容易になります。
Introduction
カンピロバクター 属菌は、世界中で細菌性食中毒性胃腸炎の主な原因であり、年間8億人の患者がいると推定されています1。 カンピロバクター は、人獣共通感染症の主要な細菌として、野鳥、家畜、ペットなど、さまざまな動物の消化管に自然に定着しています2。屠殺や食品加工の際、 カンピロバクター 属菌は死骸や肉製品を頻繁に汚染します3.カンピロバクター症は通常、加熱が不十分な家禽の消費または生の家禽ジュースによる他の食品の二次汚染に関連しています2。免疫不全の人には、ギラン・バレー症候群、反応性関節炎、敗血症などの重篤な合併症を引き起こす可能性があります4。食品源、特に家禽製品から カンピロバクター を検出して分離することは、公衆衛生の監視、アウトブレイクの調査、およびリスク評価に不可欠です。
従来の培養ベースの方法は、カンピロバクター検出のための伝統的で標準的な方法です5,6。しかし、長いインキュベーション時間(48時間以上)、感度が低い(最大50%)など、いくつかの制限があり、すべての菌株に当てはまるわけではありません(ストレスを受けたカンピロバクター細胞の中には、培地中でうまく増殖しないものやまったく増殖しないものもあります)7。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの分子法は、培養ベースの方法よりも迅速で感度が高いが、さらなる特性評価のための実行可能な分離株は提供しない8,9。
免疫学的方法は、 カンピロバクター を検出するための代替および補完的な方法です。これらは迅速、簡便、かつ汎用性が高いが、交差反応性(一部の抗体は非カンピロバクター 菌または類似の抗原を共有する他の物質に結合する可能性がある)、低い特異性(一部の抗体はすべての カンピロバクター 株または血清型に結合しない可能性がある)、およびサンプル調製要件(免疫学的方法では、抗体の結合を強化するために干渉物質を除去するためにサンプルの前処理を必要とすることが多い)など、いくつかの制限もあります10。です。
カンピロバクター属内では、C. jejuniとC. coliがヒトのカンピロバクター感染のほとんどを引き起こします(それぞれ81%と8.4%)11。どちらもらせん状の微好気性細菌であり、単極鞭毛または双極鞭毛を含む好熱性細菌です。各極での鞭毛の回転は、その特徴的なコルク栓抜きの運動性の主要な原動力であり、細菌が宿主の消化管の粘性粘膜を泳ぐことを可能にするため、その病因にとって重要であると考えられています。カンピロバクターの運動性は、細胞が好ましい環境に向かって移動することを可能にする化学感覚システムによって制御されています12,13。カンピロバクターの細胞形態と生理学的特徴に基づいて、いくつかの研究では、糞便および環境サンプルからカンピロバクター属菌を分離するために膜ろ過を利用しています14,15,16。
この研究は、生肉からの C. jejuni と C. coli の分離とその後の検出のための迅速で堅牢なプロトコルを提示し、既存の方法の欠点を克服し、いくつかの利点を提供します。暫定的なコロニーは、顕微鏡検査、生化学的検査(カタラーゼおよびオキシダーゼ活性アッセイなど)、または分子学的方法などのさまざまな方法を使用して、 カンピロバクター 属菌として確認することができます6。この方法では、 C. jejuni および C. coli に固有の遺伝子を標的とするマルチプレックスリアルタイム PCR(mqPCR)アッセイを使用して、種レベルで分離株を同定します。この方法は、比較的安価で、迅速で、選択的であるため、食品加工施設、臨床検査室、研究所など、さまざまな環境での使用に適しています。
Protocol
このプロトコルに関連するすべての作業は、無菌状態を維持し、サンプル汚染またはオペレーターによる微生物病原体への曝露のリスクを最小限に抑えるために、生物学的安全キャビネット(BSC)内で実施する必要があります。サンプルをBSC外に移す場合は、密閉容器を使用して、誤って落下した場合にこぼれないようにし、サンプルの完全性を維持してください。好ましくは、クロスコンタミネーションの可能性を軽減するために、手順全体を通して使い捨てのコンポーネントを使用する必要があります。使い捨てが不可能な場合は、使用前にすべての機器と材料が滅菌されていることを確認してください。適切な廃棄物管理は非常に重要です。使用済みの使い捨て部品はすべて、バイオハザード廃棄物として廃棄する必要があります。適切な滅菌を確実にし、潜在的に危険な物質の封じ込めを避けるために、廃棄する前に材料をオートクレーブします。これらの予防措置を遵守することで、サンプルの完全性が保護されるだけでなく、オペレーターが微生物病原体にさらされるリスクを最小限に抑えることができます。 図 1 は、 カンピロバクター 種のサンプル調製、選択的濃縮、フィルターベースの単離、mqPCR による分化のワークフローを示しています。 補足ファイル1 は、プロセス全体のより詳細なワークフローと画像を示しています。
1.肉サンプルの調製
- 食肉サンプルの採取
- 鶏もも肉、手羽先、ドラムスティック、レバーなど、さまざまな新鮮な肉のパッケージを地元の小売店から入手してください。
- すべてのサンプルを4°Cの保管場所に移し、受領後24時間以内に処理します。
注:新鮮なサンプルを氷点下などの低温で保管すると、回収に影響します。
- 食肉サンプルの加工
- FSISサンプリングガイドライン6,17で規定されている成分の比率に従ってください。
- 各パッケージから450gの鶏肉を切り取り、ストマッカーバッグに入れます( 材料表を参照)。
注:ストマッカーバッグは、下流工程を保証するのに十分な機械的強度を持ち、破裂や漏れがないため、推奨されます。 - 緩衝ペプトン水(BPW)を調製します。
- 20gの粉末( 材料表を参照)を1Lの精製水に溶解します。溶液を121°Cで15分間オートクレーブします。溶液を滅菌水で0.1%の濃度に希釈します。
- 鶏肉の入ったストマバッグに200 mLの0.1%BPWを加えます。
- ストマッカーバッグの外側からサンプルを手動でマッサージ/触診して2分間。
- 電動ピペットコントローラーを使用して、バッグのろ過された側からすべてのチキンリンスを収集します( 材料表を参照)。
- チキンリンスを滅菌遠心分離機ボトルに分注します。室温で10,000 x g で10分間遠心分離します。
- 25 mLの使い捨て血清プラスチックピペットを備えた電動ピペットコントローラーを使用して、上清を慎重に回収します。ペレットを乱さないでください。
- 必要に応じてこのプロセスを繰り返し、すべての上清が除去されるようにします。
- 採取した上清を捨てる。
2. 生肉からのカンピロバクターの選択的濃縮
- サプリメントによるボルトンブロスの調製
- 13.8gの粉末( 材料表を参照)を500mLの精製水に溶解します。121°Cで15分間オートクレーブ滅菌して培養液を滅菌します。
- 滅菌した500 mLのボルトンブロスに25 mLのレーキングした馬の血液( 材料表を参照)を加えます。
注:馬の血液の添加は、酸素消冷剤として機能し、食品マトリックスから損傷した カンピロバクター 細胞の回復を助けます。 - 抗生物質サプリメント(セフォペラゾン、シクロヘキシミド、トリメトプリム、バンコマイシン、材料 表を参照)1バイアルを5 mLの50%エタノールで再構成します。.
- 再構成された抗生物質サプリメントをボルトンブロスに加えます。
- 濃縮手順
- 湖沼化した馬の血液と抗生物質を含む50 mLのボルトンブロスにペレットを再懸濁します。
- サンプル(キャップを緩めた状態)を、85%N2、10%CO2、および5%O2の混合ガスを維持する密閉容器に入れます。
- キャップが緩んでいることを確認してくださいが、 カンピロバクターの微好気性および好熱性の成長要件を生成するために容器がしっかりと密閉されています。
注:85%N2、10% CO2、および5%O2 の雰囲気を維持するガスパックは、恒温槽が利用できない場合に使用できます。 - サンプルを42°Cで24時間インキュベートします。
- キャップが緩んでいることを確認してくださいが、 カンピロバクターの微好気性および好熱性の成長要件を生成するために容器がしっかりと密閉されています。
3. 生鶏からのC.jejuniおよびC.大腸菌の単離と精製
- ブルセラ寒天プレートの調製
- 28gのブルセラ粉末( 材料表を参照)を1Lの精製水に溶解します。寒天15gをブルセラ液に溶解します。
- ブルセラ寒天培地を121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。 中寒天混合物を55°Cのウォーターバスで冷却します。
- 20 mLのブルセラ寒天を直径100 mmのシャーレに注ぎます。
- 濾過法及びコロニー培養
- バイオセーフティキャビネットで蓋を開けた状態でブルセラ寒天プレートを0時間、1時間、2時間、3時間乾燥させることにより、フィルターを通過する カンピロバクター に対する水分の影響を評価します。
- 80 μLのサンプルをブルセラ寒天プレートに直接広げて、フィルターなしのコントロールを調製します。
- 酢酸セルロースフィルター(0.45 μmまたは0.65ポアサイズ、 材料表を参照)をブルセラ寒天プレートの中央に配置します。
- フィルターに4滴/フィルターと20μL/滴の濃縮サンプルをピペットで移します。
- フィルターの中央付近に滴を置き、プレートに到達した液体がフィルターの周りではなくフィルターを通過するようにします。
- 滴が広がって凝集しないように滴を置きます。
- 滴を室温で15分間インキュベートし、フィルターを慎重に取り外します。
注:このステップにより、 カンピロバクター 細胞が膜を通過し、過度に乾燥することなく寒天培地に到達するのに十分な時間を確保します。 - プレートを42°Cで約24時間、前述の微好気的条件下でインキュベートします。
- 特定の形質を持つ特徴的な カンピロバクター のコロニーを選びます。
注: カンピロバクター のコロニーは通常、丸みを帯びており、縁が滑らかで、光沢があり、半透明の黄色がかったまたはピンクがかった色をしています6。 - 精製のためにブルセラ寒天プレートにコロニーを縞状にします。単一の均一なコロニー形態のプレートが得られるまで、このステップを繰り返します。
- 長期保存用のサンプルを調製します。
- 前述のようにボルトンブロスを準備します。均一なコロニー形態のプレートからコロニーを1つ追加します。
- 前述の微好気性条件下で一晩(24時間)成長させます。100 μL の DMSO を含む 2 mL のクライオバイアルに 900 μL の一晩培養液を加えます。
- ドライアイスエタノール浴(約-72°C)で10分間急冷します。-80°Cの冷凍庫に移し、長期保存してください。
4. C. jejuni および C. coli の種の同定
- 以前に開発されたマルチプレックスqPCR(mqPCR)アッセイを使用して、C.jejuniおよびC.coliの種レベルの同定を実行します18,19。
- 迅速な細胞溶解とゲノムDNA抽出を96ウェルプレートフォーマットで行います。
注:サンプルに既知のPCR阻害剤が十分に含まれていないことを確認するために、市販のキット( 材料表を参照)の使用を検討することを強くお勧めします。- 精製した カンピロバクター コロニーを100μLの抽出液に分散させます。
- サンプルを99°Cで10分間溶解した後、サーモサイクラーで20°Cで2分間冷却します。
- プレートを室温で8,000 x g で10分間遠心分離します。mqPCRアッセイのために上清のアリコート2 μLを除去します。
- 10 μL の 2x Master Mix、2.0 μL の DNA サンプル、104 コピーの内部増幅コントロール(IAC)テンプレート、および各プライマーとプローブ 200 nM からなる 20 μL の反応混合物を調製します( 材料表を参照)。
注: hipO および cdtA のプライマーおよびプローブは、それぞれ C. jejuni および C. coliの排他的な標的遺伝子である。IAC は、ヒトアデノウイルスの 79 bp の DNA セグメントで構成されており、すべてのサンプルで DNA ポリメラーゼの活性を一定に保つためのポジティブコントロールとして含まれています。
- すべてのサンプルを光学フィルムで覆われた96ウェル光学プレートに3回に分けてロードし、リアルタイムPCRシステムに入れます( 材料表を参照)。
- DNAポリメラーゼを95°Cで10分間ホットスタート活性化します。その後、95°Cで15秒間40サイクルの変性を行い、60°Cで1分間アニーリング/伸長を行います。
- 迅速な細胞溶解とゲノムDNA抽出を96ウェルプレートフォーマットで行います。
5. 細胞懸濁液の列挙
- 6 x 6 ドロッププレート手順20 を使用して細胞懸濁液を列挙します。6 x 6 ドロップ プレート法を示す画像については、 補足ファイル 1 を参照してください。
- ブルセラ寒天プレートを蓋を外して層流フードで45分間風乾します。
- 200 μL の細菌懸濁液を 96 ウェルプレートの最初のカラムの 6 列(A-F)に加えます。
- 180 μLのブルセラ培地を残りの列(2〜12列)の6列に分配します。
- 20 μL のトランスファーを使用して 10 倍段階希釈液を調製します。
- 例えば、20 μL のサンプルをカラム 1 からカラム 2 に移します。このプロセスを少なくとも 6 列繰り返します。
- リフラックスは、ピペットを使用して各懸濁液を10回混合し、各移送のたびにチップを交換します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、ブルセラ寒天プレートの表面に6列のカラムから7 μLの滴を堆積させます。
- これを繰り返して 6 x 6 の配列を作成し、行が列間で技術的なレプリケートになるようにします。
- プレートを5分間風乾してから、プレートを反転させます。プレートを42°Cで24時間インキュベートします。
- 各代表希釈液のコロニー数を数えます。
Representative Results
カンピロバクターの受動的濾過におけるブルセラ寒天プレートの水分の影響
カンピロバクター はゲノムが小さく、 大腸菌 O157:H7や サルモネラ菌など、他の細菌によく見られるストレス応答遺伝子がいくつか欠けています。そのため、さまざまな環境ストレスに敏感で、脱水症状や周囲の酸素濃度に耐えられません。逆に、過度に湿った寒天培地はフィルターを浸水させる可能性があります。これは、サンプルをフィルターの外側に拡散させるだけでなく、酸素21への曝露時間も増加させる。
カンピロバクターのフィルターベースの単離の適切な条件を決定するために、ブルセラ寒天プレートを蓋を外して生物学的安全キャビネット内で0時間、1時間、2時間、および3時間乾燥させ、カンピロバクター細胞が0.65 μmの孔径フィルターを通過する効率を評価しました。1.53 x 104 および 1.53 x 105 CFU/mL の濃度の C. jejuni S27 培養液の 4 つの 20 μL アリコートを、ブルセラプレートの上に配置した各フィルターメンブレンにピペットで移しました。15分間の浸透後、フィルターを取り外し、プレートを一晩インキュベートして細胞増殖させました。
次に、5つの複製プレートからの細胞をカウントし、 表1に記録しました。その結果、寒天プレートを2時間乾燥させた場合と3時間乾燥させたところ、パッシブろ過から回収した細胞数がほぼ同数で、同様の結果が得られました。注目すべきことに、これらの条件下で0時間および1時間乾燥させたプレートでは、使用した15分間の時間内に細胞が膜を完全に横断することができませんでした。
鶏レバーから カンピロバクター を分離するための異なる孔径フィルター膜の比較
カンピロバクターの細胞サイズ(長さ0.5〜5μm、幅0.2〜0.9μm)と幅広い食品粒子サイズを考慮して、0.45μmおよび0.65μmの孔径の酢酸セルロースフィルターを15分間のインキュベーション時間でカンピロバクター継代の効率について試験しました。450gの鶏レバーに153CFUのC.jejuniをスパイクし、一晩濃縮した食品サンプルを実験に使用しました。無フィルター対照として、濃縮サンプルの直接めっきを並行して行いました。5 枚の複製プレートの結果(図 2)では、0.65 μm のポアサイズフィルターは 0.45 μm のポアサイズフィルターよりも多くの細胞を通過でき、得られた細胞は ~29 倍に増加することが一貫して示されました。孔径0.45μmのフィルターは、フィルターの上側に保持する細胞が多すぎるため、孔径0.65μmのフィルターと比較して、食品からのカンピロバクターの回収率が大幅に低下しました。予想通り、無フィルターのコントロールプレートには、さまざまな背景生物の芝生が生えていました。
小売用鶏肉からの カンピロバクター 分離における受動的ろ過の応用
カンピロバクター細胞の異常な運動性のため、通常、多数のバックグラウンド生物で汚染されている小売食肉製品からC.jejuniおよびC.大腸菌を分離するために、受動的ろ過技術が選択されました。2014 年から 2023 年の間に、鶏肉、鶏レバー、牛レバー、子牛レバーのさまざまな部位を含む合計 79 個の生肉パッケージが、さまざまな地元のスーパーマーケットから収集されました。各パッケージから、カンピロバクター属菌の単離のために450gをサンプリングしました。血液含有ボルトンブロス中のカンピロバクターの選択的濃縮と、孔径0.65 μmの酢酸セルロースフィルターによる細胞のパッシブろ過をブルセラ寒天プレートに直接組み合わせることにより、79の肉サンプルから49のカンピロバクター株を単離することに成功しました(表2)。図3は、ニワトリの肝臓からカンピロバクター株を単離した結果です。この方法は、感度が高く、特異的で、費用対効果が高いことが繰り返し証明されています。
C. jejuniおよびC. coli 分離株の同定と鑑別
生肉から得られたカンピロバクター分離株の属を検証し、種を区別するために、C. jejuniおよび大腸菌の特異的遺伝子標的(hipOおよびcdtA)を増幅するマルチプレックスqPCRアッセイと、内部増幅制御(IAC)を採用しました。IACは、複数の遺伝子の同時増幅における偽陰性指標として含まれていました。アッセイは、市販の試薬を用いて迅速な細胞溶解とDNA抽出を行う96ウェルフォーマットで実施しました(材料表を参照)。表2は、C. jejuni株とC. coli株の種同定の結果をまとめたものである。さらなる検証として、全ゲノムシークエンシングの結果、すべての分離株の種が確認されました(データは示されていません)。
図1:市販食肉からの カンピロバクター 種の分離と同定のワークフロー図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2: カンピロバクターの回収率に対するフィルターサイズの影響。 その結果、0.65 μmフィルターは平均900±138コロニーを回収でき、0.45 μmフィルターは7コロニー±31コロニーを回収できることが示されました。結果は N = 20 (5 枚のプレートと 4 滴/プレート) から生成され、スチューデントの t 検定 は平均が統計的に異なることを示しています (p < 0.0001)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:濃縮家禽サンプルのパッシブろ過による カンピロバクター の単離。 (A)は、ニトロセルロースメンブレンフィルターに堆積した濃縮サンプルの20 μL滴4滴を示しています。画像は、15分間のパッシブろ過中に収集されました。(B)は、ニトロセルロースフィルターを取り外した後のプレートを示しています。4 つのスポットは、濃縮されたサンプルがメンブレンを横切った場所を示しています。(C)は、24時間インキュベーション後のプレートを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:ブルセラ寒天プレートの乾燥時間がC. jejuniのパッシブろ過に及ぼす影響。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:生肉から単離されたC.jejuniおよびC.大腸菌株。 2008 年から 2023 年までの期間に、24 のユニークな小売製品の 79 の食肉パッケージから 36 の C. jejuni 株と 13 の C. coli 株が分離されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: 分離および列挙プロセス全体の画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
プロトコルの意義
C. jejuni と C. coli は、家禽22 と動物の肝臓 23,24 に蔓延していることがわかったカンピロバクターの 2 つの主要な種でした。この研究では、カンピロバクター属菌を分離するために、鶏の部位(脚、手羽先、太もも)、鶏レバー、牛レバーの肉サンプルをさまざまな期間、さまざまな小売店やメーカーからランダムに収集しました。分離されたカンピロバクター株49株のうち、36株がC. jejuni、13株がC. coliと同定され、他のカンピロバクター種は見つからず、他の報告と一致している25。
このアッセイは、カンピロバクター属菌のらせん状の細胞形態と特徴的なコルク栓抜きのような運動性に基づいています。螺旋状の細胞形態(細長い、細長い、0.2-0.9 x 0.5-5 μm)と強力なコルク栓抜きの運動性を利用した、シンプルでありながら効果的な受動的ろ過技術26,27を使用して、背景生物の混合物からカンピロバクターを分離しました。カンピロバクターの高い運動性により、細胞はメンブレンフィルターを通過し、寒天培地内で見られる好ましい条件に向かって移動することができましたが、肉製品に含まれる他のバックグラウンド微生物は通過できませんでした。この方法は、比較的安価で、迅速で、選択的であるため、食品加工施設、臨床検査室、研究所など、さまざまな環境での使用に適しています。
よく引用される先駆的な論文では、0.45μmのフィルターは非常にうまく機能したため、0.65μmは評価されなかったと述べています28。本研究の結果は、0.65 μmの孔径のフィルターが0.45 μmの孔径よりも有意に優れた性能を発揮し、その結果、濃縮から回収された細胞の数が29倍に増加したことを示しています。これは、以前に報告された29のように、選択性の低下を示さないため、重要です。また、濾過は直接めっきに比べてカン ピロバクター の回収量を有意に減少させることが知られている30ので、細孔のサイズを大きくすると微生物の回収率が向上し、これは以前に報告された知見21と一致している。これは、フィルターを通過するすべての細胞が均一な カンピロバクター コロニーを形成し、両方のフィルターが他の微生物叢や食物粒子の通過を防ぐのに十分であったことを示しているため、重要です。さらに、FSISのフローチャート7 は、抗生物質を含むCampy-Cefexプレート上の分離株の再ストリークによる結果産生の延長の可能性を指摘しています。対照的に、この原稿に記載されているプロトコルは、セフォペラゾン、シクロヘキシミド、トリメトプリム、およびバンコマイシンによるろ過と選択的濃縮の使用を組み合わせたもので、再ストリーキングを必要としませんでした。
現在採用されている方法は、現在のFSISサンプリングおよび検証プログラム17と一致しています。 カンピロバクター の汚染レベルは低い(153 CFU/450 gのニワトリ)ため、リンスを遠心分離してサンプルを4倍に濃縮し、アッセイの感度を高めます。リンセートを4倍に濃縮した後、サンプルを48時間濃縮し、分子検出システム(MDS)でスクリーニングして、FSISラボで採用されている方法を再現します(データは示していません)。特筆すべきことに、記載された方法は、48時間の濃縮(データは示さず)を使用して分子検出システムによって検出された陽性株を24時間以内に同定することにまだ失敗していません。最後に、このプロトコルのさらなる利点は、細菌種に関連する情報を提供し、 カンピロバクター が 大腸菌、 C.ジェジュニ、または C.ラリのいずれであるかを識別できることですが、MLG 41.07で採用されたMDSは カンピロバクターに対してバイナリ陽性/陰性応答しか提供できません。
重要な手順
カンピロバクターの単離と同定のプロトコルでは、遠心分離、ろ過、分子分析の精度が要求されます。正確な希釈、適切なインキュベーション条件、およびqPCRアッセイ条件の細心の注意を払った遵守は、信頼性の高い種同定にとって極めて重要です。
微好気性細菌として、カンピロバクターは非常に壊れやすく、さまざまな環境ストレスに敏感であり、成長には独自の潔癖な条件が必要です31,32,33。通常、長期間の輸送と保管を受ける食品サンプルでは、多くのカンピロバクター細胞が休眠状態または亜致死的/致死的損傷状態にある可能性があります34,35。したがって、ストレスを受けた細胞を食物マトリックスから回収し、より高い濃度に成長させることが重要です。手順の最初のステップでは、湖水の馬の血と抗生物質を添加したボルトンブロスを使用して、食物からカンピロバクターを選択的に濃縮しました。アドイン血液は、遊離酸素ラジカルの悪影響を克服するための酸素消光剤として機能しました36。抗生物質は、バックグラウンド微生物叢の増殖を阻害するために使用されました37。
カンピロバクターの大気中酸素への曝露時間を最小限に抑えるために、細胞がフィルターを通過できるように15分間のインキュベーション期間を選択しました。また、フィルター下のブルセラ寒天プレートの水分は、通過速度に重要な役割を果たしました。具体的には、寒天プレートを0時間、1時間、2時間、3時間乾燥させた試験結果から、フィルター内の水分含有量が高いと細胞の通過が妨げられることが示唆されました。同様に重要なのは、プレートとフィルターへのフィルターと滴の正確な配置であり、どちらも細胞の単離の成功に影響を与えます。
潜在的な落とし穴と制限
生のニワトリサンプルから カンピロバクター 種を分離して同定するための構造化されたアプローチを提示していますが、このプロトコルにはいくつかの制限があります。外部汚染、乾燥が不十分なプレート、微生物の移動を妨げるフィルターの目詰まり、ペレット内の微生物の閉じ込め、大気チャンバーの不完全な密閉、フィルター境界を超えて広がる液滴などが主な落とし穴です。
食品表面からの微生物の分離が不十分であったり、サンプルの大部分内に閉じ込められたりすると、この方法を使用した微生物の分離が妨げられる可能性があります。さらに、パッシブフィルターを通過するために微生物の運動性に依存することには、顕著な制限があります。フィルター膜は、食物中の微生物病原体の捕捉効率を低下させる可能性があることが示されているように、いくつかの運動性の低い カンピロバクター 株を保持している可能性がある38。さらなる制限としては、遠心分離およびろ過プロセスのバッチ性、フィルターの目詰まりに対する感受性、および形成されたペレットの分散の非効率性が含まれ、微生物負荷の精度に影響を与えます。これらの制限は、特にさまざまなサンプルタイプを扱ったり、ハイスループット機能を求めたりする場合に、包括的な分析を確実に行うための注意と補足的な方法論の必要性を総合的に強調しています。
トラブルシューティングの提案
潜在的な問題を未然に防ぐには、まず、すべての材料が必要な品質基準に準拠し、有効期限が切れていないことを確認してください。ニトロセルロースメンブレンを通る カンピロバクター の通過を制限する可能性のある大きな汚染物質を除去するために、追加のろ過を採用することで、フィルターの目詰まりをトラブルシューティングします。コンタミネーションが観察された場合は、液滴がフィルターの端に近づきすぎていないこと、および液体が細孔を通過するのではなくフィルターの周りを回って寒天に到達したことを確認してください。濃縮後の成長が不十分な場合は、大気容器のシールがしっかりしていて、漏れていないことを確認してください。
潜在的な洗練と拡張
代替フィルター材料を探索することで、微生物のトラバーサルが強化され、このプロトコルを拡張して、食品などの不均一な混合物から他の運動性微生物を単離することができます。特異性に悪影響を与えることなく、運動性の低い カンピロバクター 変異体を保持するコントロールを同定することが望ましい。さらに、この研究で利用されたマルチプレックスqPCRアッセイは、 C.lari18 を検出する能力があることが実証されましたが、このアッセイには他の 目的のカンピロバクター 種を含めることができます。
要約すると、さまざまなパラメータと設定を評価することにより、フィルターベースの単離と、食品からの C. jejuni と C. coli の種レベルの同定のための適切な条件が確立されました。この方法は、感度が高く、特異的で、頑健で、費用対効果が高いことが実証されています。実際の食品サンプルに適用することで、プロトコルは79の肉パッケージから36の C.jejuni 株と13の C.大腸菌 株を分離することができました。
このプロトコルは、生の鶏肉の部位サンプリングの手順を概説するFSIS指令10,250.117、およびカンピロバクターの分離と同定のためのMLG 41.076に準拠しています。このデータは、サンプルを4倍に濃縮し、24時間濃縮し、ろ過とプレーティングと組み合わせると、96時間ではなく48時間以内に単離され、確認されたコロニーが得られることを示唆しています。このプロトコルは、ゲノムシーケンシングなどのDNAベースの方法と互換性があり、抗菌薬耐性プロファイル、病原性予測、系統関係など、カンピロバクター株の包括的な特性評価を提供します。このプロトコルは、生の家禽からカンピロバクター属菌を効率的に回収・分離するための有望な代替手段であり、疫学研究や公衆衛生上の介入を促進することができます。
Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、米国農務省農業研究局(USDA-ARS)、国家プログラム108、現在の研究情報システム番号8072-42000-093および8072-42000-094-000-Dの支援を受けました。USDAは機会均等の提供者であり、雇用主です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
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